專(zhuān)利名稱：一種用于檢測(cè)單增李斯特氏菌的F<sub>0</sub>F<sub>1</sub>-ATPase旋轉(zhuǎn)分子馬達(dá)傳感器試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)的一種。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的單增李斯特氏菌檢測(cè)方法要求對(duì)每個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行非選擇性增菌、選擇性增菌、分離、篩選和鑒定等步驟，一般需要5天才能出具檢測(cè)報(bào)告，嚴(yán)重影響貨物的品質(zhì)和貨架壽命。一些新的技術(shù)如PCR技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、生物芯片技術(shù)等檢測(cè)方法仍依賴于傳統(tǒng)的檢測(cè)步驟，即需要進(jìn)行增菌，耗時(shí)耗力，完成一次檢測(cè)通常需要幾天的時(shí)間。這樣不僅增加了實(shí)驗(yàn)室的工作量，而且也不利于食品工業(yè)中生產(chǎn)流程的監(jiān)測(cè)、終產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及政府部門(mén)對(duì)食品安全的管理和控制。
發(fā)明內(nèi)容
以受控分子馬達(dá)技術(shù)為核心，集成核酸探針識(shí)別、熒光探針標(biāo)記與檢測(cè)等技術(shù)，建立了一個(gè)全新概念的快速檢測(cè)技術(shù)體系。利用ATP酶作為載體對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速的特點(diǎn)。分子馬達(dá)連接上特異的核酸探針，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定食品微生物的快速、特異性、高通量的檢測(cè)。本發(fā)明可將檢測(cè)時(shí)間縮短至2天，且檢測(cè)靈敏度能達(dá)到102CFU/ml，滿足現(xiàn)有的食品微生物檢測(cè)范圍。
附圖1為分子馬達(dá)生物傳感器模式圖(其中a、b、C、α、β、δ、Υ、ε均為ATP合酶亞基)，I為ε亞基抗體，2為鏈霉親和素(Strptavidin)，3為N-biotin，4為prfA探針，5為單增李斯特氏菌單鏈DNA。附圖2為chix) prfA對(duì)不同種菌株的檢測(cè)結(jié)果，縱坐標(biāo)表示熒光值，橫坐標(biāo)表示檢測(cè)的樣本，其中I為水，2為單增李斯特氏菌，3為副溶血性弧菌，4為沙門(mén)氏菌，5為霍亂弧菌，6為大腸桿菌。附圖3為chro prfA對(duì)30株單增李斯特氏菌樣本的檢測(cè)結(jié)果，縱坐標(biāo)表示熒光值，橫坐標(biāo)表示檢測(cè)的樣本,I 30為食品檢測(cè)樣本編號(hào)。
具體實(shí)施例方式根據(jù)單增李斯特氏菌prfA基因設(shè)計(jì)特異性核酸探針5’_gatacagaaacatcggttggc,其中探針的5’用生物素進(jìn)行標(biāo)記。將該探針通過(guò)生物素抗體連接在分子馬達(dá)上面，利用分子馬達(dá)傳感器即可對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)樣品為單增李斯特氏菌DNA時(shí)，檢測(cè)體系的熒光值會(huì)發(fā)生明顯的變化，通過(guò)這一變化即可判斷樣本為陽(yáng)性。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)試劑盒，可以方便、快速對(duì)食品中的單增李斯特氏菌進(jìn)行檢測(cè)。
試劑盒組成:
權(quán)利要求
1.本發(fā)明要求保護(hù)的內(nèi)容有:異性核酸探針與FtlF1-ATP合酶連接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亞基上依次連接ε亞基抗體、生物素、鏈霉親和素、生物素標(biāo)記的prfA探針。
2.劑盒檢測(cè)體系的反應(yīng)條件:37°C恒溫?fù)u床中溫育20min。
3.成buffer、啟動(dòng)buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20%,氯化鎂5mM, Tricine50mM,憐酸氫二鉀 5mM ;啟動(dòng) buffer:ADP (2.2mM):上述合成 buffer = 1: 6 (v/v) ；PBS:137mM氯化鈉，2.7mM氯化 鉀，IOmM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鉀。
全文摘要
一種用于檢測(cè)單增李斯特氏菌的F0F1-ATPase旋轉(zhuǎn)分子馬達(dá)傳感器試劑盒試劑盒屬于食品微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域，主要解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(約5天)。本發(fā)明的核心技術(shù)是利用載色體Chromatophore上的F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器，F(xiàn)0F1-ATP合酶由于能快速地旋轉(zhuǎn)，通過(guò)旋轉(zhuǎn)它建立了催化位點(diǎn)與質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)之間的偶聯(lián)。首先在ATP合酶的ε亞基上連接prfA探針，將待測(cè)樣品和陰性對(duì)照分別與生物傳感器結(jié)合后，比較其催化ATP合成20分鐘后的ATP產(chǎn)生量，ATP合成的多寡可以通過(guò)環(huán)境中H+的量進(jìn)行測(cè)量，而H+的多寡通過(guò)H-DHPE所體現(xiàn)的熒光強(qiáng)度大小來(lái)獲得。本試劑盒可對(duì)待測(cè)樣本中的單增李斯特氏菌進(jìn)行快速、靈敏、高通量的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103088112SQ201110336049
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者張捷, 張惠媛, 汪琦, 陸琳, 張昕, 盧曉宇, 韓晶, 劉巖, 顧德周, 陳廣全 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局