專利名稱：活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌rt－pcr檢測試劑盒及檢測方法
專利說明活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法 本發(fā)明涉及一種利用分子技術(shù)檢測活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測試劑盒及檢測方法，特別涉及基于mRNA的針對溶血素基因hlyA的活性單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR快速檢測試劑盒及檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(以下簡稱“單增李斯特氏菌”)是一種重要的人畜共患病致病菌，能引起人和動物腦膜炎、敗血癥及孕婦流產(chǎn)，死亡率極高。單增李斯特氏菌廣泛存在于土壤、動物、水產(chǎn)品等，主要通過奶及奶制品、蔬菜、水產(chǎn)品、肉制品等食物傳播。該菌已被列為90年代4大食品致病菌之一，成為許多國家食品衛(wèi)生的必檢項目。
傳統(tǒng)的單增李斯特氏菌生化檢測方法全過程至少需要4-7d，檢出限低(僅為104cfu/ml(g)，費時費力，不能滿足食品中致病菌及時、快速、靈敏的檢測需要，不利于食物中毒突發(fā)事件的處理。免疫法比較快，但單克隆抗體制備困難，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性差；核酸雜交法快速特異，但靈敏度低，需要103-104cfu/g才能得到雜交信號；PCR方法快速特異，且靈敏度很高，但是PCR方法得到的結(jié)果包括活菌和死菌，易產(chǎn)生假陽性。國內(nèi)至今沒有在解決假陽性方面作過研究，國外雖有少量文獻(xiàn)以RT-PCR方法檢測活體單增李斯特氏菌的報道，但是以southern雜交顯示結(jié)果，檢測時間長，技術(shù)復(fù)雜，價格昂貴，不易推廣應(yīng)用，且在樣品檢測實際應(yīng)用方面并沒有作細(xì)致的研究。因此，建立一種簡便、靈敏、快速、特異同時還能區(qū)分活菌和死菌的方法很有必要。
針對以上不足，本發(fā)明以hlyA基因為靶點，設(shè)計特異引物，優(yōu)化體系，并對易受單增李斯特氏菌污染的樣品作了活體檢測應(yīng)用研究，能從根本上彌補傳統(tǒng)檢測方法的不足，其所建立的RT-PCR檢測技術(shù)及試劑盒，對食品中的活體單增李斯特氏菌可以進(jìn)行全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的檢測與鑒定，且操作簡單、快速，具很高的特異性和敏感度，可為快速檢測與鑒定食品及臨床中單增李斯特氏菌提供有效的手段，可以推廣應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生監(jiān)督、商品檢驗檢疫等領(lǐng)域，并能為其它活體食源性和臨床致病菌檢測提供技術(shù)模式。本發(fā)明針對傳統(tǒng)檢測方法的不足，以及普通PCR檢測方法出現(xiàn)的假陽性問題，建立了一套基于mRNA為模板的針對hlyA基因的RT-PCR快速檢測活體單增李斯特氏菌的方法，并構(gòu)建了相應(yīng)的RT-PCR檢測活體單增李斯特氏菌檢測試劑盒，可為快速檢測與鑒定活體食源性和臨床中的活體單增李斯特氏菌提供有效的手段。
本發(fā)明提供的RT-PCR試劑盒配置方法簡便，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，檢測靈敏度高、周期短、速度快、可操作性強、其最高檢測限達(dá)5cfu/sample，對食源性和臨床出現(xiàn)的活體單增李斯特氏菌可以進(jìn)行全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的檢測與鑒定。
本發(fā)明根據(jù)單增李斯特氏菌的特異性及毒力靶基因hlyA設(shè)計引物，根據(jù)Oligo6.0和Primer5.0軟件程序?qū)σ镞M(jìn)行設(shè)計和理論分析。引物的退火溫度為55℃，RT-PCR產(chǎn)物長度為858bp，大小易于通過電泳觀察鑒別出來。
本發(fā)明的目的可經(jīng)如下方案來實現(xiàn)本發(fā)明食源性活體單增李斯特氏菌RT-PCR快速檢測試劑盒包括如下試劑MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、5×RT-PCR緩沖液、RNasin、DEPC水、10×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)、dNTP、引物、DNA聚合酶(Taq酶)。具體地說，本發(fā)明的活體單增李斯特氏菌RT-PCR快速檢測試劑盒由RT體系及PCR體系試劑組成，RT體系包括5×RT-PCR緩沖液、Rnasin，dNTP，MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，上游引物，下游引物；PCR體系包括dNTP，10×PCR反應(yīng)緩沖液，Taq酶，上游引物及下游引物。其中上游引物P1為5’-CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG AAA-3＇，下游引物P2為5’-TAG TTC TAC ATC ACC TGA GAC AGA-3＇。MLV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度為100U/μL、Rnasin濃度為10U/μL、dNTP濃度為10mmol/L、Taq酶濃度為2.5U/μL。
利用上述檢測試劑盒進(jìn)行快速檢測的方法1.活體單增李斯特氏菌RNA的提取1)取1ml培養(yǎng)8h的單增李斯特氏菌，離心后，加溶菌酶37℃作用1h，加0.5～3mLTRNzol試劑，用移液器反復(fù)混勻幾次后靜置5min；2)加入200μL氯仿，用力振搖15S，再靜置2-3min；3)4℃，12000g，離心15min，棄去上層液體；4)加入500μL異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；5)4℃，12000g，離心10min，再次棄去上清；6)加入75％的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；7)4℃，7500g，離心5min，小心棄去乙醇；8)充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于100μL適量的無RNA酶的水中。
2.RT-PCR擴增(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)每次實驗取試劑盒中RT體系試劑9～13μL，具體為5×RT-PCR緩沖液2uL，Rnasin(10U/uL)1μL，dNTP(10mmol/L)1uL，MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(100U/uL)1μL，上游引物(10umol/L)2～4μL，下游引物(10umol/L)2～4μL于PCR eppendorf管中，然后加提取的RNA模板8μL，最后加水至20μL，置PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件95℃變性5min，42℃反應(yīng)1h；(2)PCR體系擴增每次實驗取試劑盒中PCR體系試劑5～6μL，具體為10mmol/LdNTP 1μL，10umol/L上游引物0.5～1μL，10umol/L下游引物0.5～1μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL，2.5U/μLTaq酶0.5μL，于PCR eppendorf管中，然后加RT反應(yīng)的模板3μL，最后加水至25μL，置PCR儀進(jìn)行擴增。擴增反應(yīng)條件95℃變性5min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃反應(yīng)7min，4℃保存。
3.擴增產(chǎn)物電泳檢測。
擴增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。
4.結(jié)果分析與100bp標(biāo)準(zhǔn)分子量對照，如果擴增產(chǎn)物出現(xiàn)858bp擴增條帶，說明該樣品中含有單增李斯特氏菌，而陰性對照則無擴增條帶出現(xiàn)，見附

圖1。附圖1不同李斯特氏菌及陰性對照RT-PCR擴增結(jié)果。1、2分別為單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和野生分離株，經(jīng)RT-PCR擴增后出現(xiàn)858bp擴增條帶；3、4、5分別為默氏李斯特氏菌、英諾克李斯特菌、希爾李斯特菌，經(jīng)RT-PCR擴增后無擴增條帶出現(xiàn)；M為100bp標(biāo)準(zhǔn)Marker；6、7、8、9、10分別為1、2、3、4、5的RNA提取物直接進(jìn)行PCR作為陰性對照驗證無DNA污染，經(jīng)RT-PCR擴增后同樣無出現(xiàn)擴增條帶。
附圖2豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR活體快速檢測結(jié)果1為陰性對照，為不含菌的豬肉樣品；2、3、4分別為三個含菌豬肉的平行樣品的檢出結(jié)果；M為100bp marker；6、7、8、9分別為1、2、3、4的RNA提取物直接進(jìn)行PCR作為陰性對照驗證無DNA污染。含菌豬肉樣品經(jīng)RT-PCR擴增后，出現(xiàn)858bp擴增條帶。
附圖3牛奶中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR活體快速檢測結(jié)果1為陰性對照，為不含菌的牛奶樣品；2、3、4分別為三個平行陽性樣品的檢出結(jié)果；M為100bpmarker；6、7、8、9分別為1、2、3、4的RNA提取物直接進(jìn)行PCR作為陰性對照驗證無DNA污染。含菌牛奶樣品經(jīng)RT-PCR擴增后，出現(xiàn)858bp擴增條帶。實施例1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR活體快速檢測試劑盒該檢測試劑盒由RT體系試劑及PCR體系試劑組成。
RT體系試劑包括以下試劑5×RT-PCR緩沖液40μL、10U/uL Rnasin 20μL、10mmol/LdNTP 20μL、100U/μLMLV逆轉(zhuǎn)錄酶20μL、10umol/L上游引物40μL、10umol/L下游引物40μL。
PCR體系試劑包括以下試劑10mmol/L dNTP 20μL、10×PCR反應(yīng)緩沖液50μL、2.5U/μLTaq酶10μL、10umol/L上游引物10μL、10umol/L下游引物10μL。
本試劑盒所用的上游引物P1為5’-CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG AAA-3＇，下游引物P2為5’-TAG TTC TAC ATC ACC TGA GAC AGA-3＇。
實施例2豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR活體快速檢測方法1.樣品前處理。取25g經(jīng)過傳統(tǒng)方法檢測確認(rèn)的陽性食品樣品豬肉，采用無菌操作剪碎放于盛有225mL TSB三角瓶中，于37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)12h，用加有濾紙的漏斗初步過濾除掉殘余食品。
2.RNA提取1)取1mL培養(yǎng)后的過濾液，離心后，加溶菌酶37℃作用1h，加1mlTRNzol試劑，用移液器反復(fù)混勻幾次后靜置5min；2)加入200uL氯仿，用力振搖15S，再靜置2-3min；3)4℃，12000g，離心15min，棄去上層液體；4)加入500uL異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；5)4℃，12000g，離心10min，再次棄去上清；6)加入75％的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；7)4℃，7500g，離心5min，小心棄去乙醇；8)充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于100uL適量的無RNA酶的水中。
3.擴增反應(yīng)(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用微量進(jìn)樣器分別吸取檢測試劑盒中RT-PCR體系試劑9μL，具體為5×RT-PCR緩沖液2μL，10U/uL Rnasin 1μL，10mmol/L dNTP 1μL，100U/uL MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，10umol/L上游引物2μL，10umol/L下游引物2μL，于PCR eppendorf管中，然后加提取的RNA模板5μL，最后加水至20μL，置PCR儀進(jìn)行擴增。擴增反應(yīng)條件95℃變性5min，42℃反應(yīng)1h。
(2)PCR體系擴增反應(yīng)用微量進(jìn)樣器分別吸取檢測試劑盒中PCR體系試劑5μL，具體為10mmol/L dNTP 1μL，10umol/L上游引物0.5μL，10umol/L下游引物0.5μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL，2.5U/μLTaq酶0.5uL于PCR eppendorf管中，然后加RT反應(yīng)的模板3μL，最后加水至25μL，置PCR儀進(jìn)行擴增。
擴增反應(yīng)條件95℃變性5min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃反應(yīng)7min，4℃保存。
4.擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳及結(jié)果分析。
(1)取5ul擴增產(chǎn)物，制備10g/L的瓊脂糖凝膠，在電泳設(shè)備中電泳。
(2)在凝膠成像儀上觀察并記錄實驗結(jié)果。
(3)電泳結(jié)果如圖2所示，含菌豬肉樣品經(jīng)RT-PCR擴增后出現(xiàn)858bp擴增條帶。
對豬肉陽性樣品的檢測，提取RNA需時2h，逆轉(zhuǎn)錄1.5h，PCR擴增3h，電泳0.5h，加上樣品前處理12h，整個檢測過程19h內(nèi)可以完成。
實施例3牛奶中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR活體快速檢測方法1.樣品前處理取25ml經(jīng)傳統(tǒng)方法檢測確認(rèn)的陽性食品樣品牛奶，采用無菌操作置于盛有225mLTSB三角瓶中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)16h，用加有濾紙的漏斗初步過濾除掉牛奶雜質(zhì)。
2.RNA提取1)取1mL培養(yǎng)后的過濾液，離心后，加溶菌酶37℃作用1h，加1mlTRNzol試劑，用移液器反復(fù)混勻幾次后靜置5min；2)加入200μL氯仿，用力振搖15S，再靜置2-3min；3)4℃，12000g，離心15min，棄去上層液體；4)加入500uL異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；5)4℃，12000g，離心10min，再次棄去上清；6)加入75％的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；7)4℃，7500g，離心5min，小心棄去乙醇；8)充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于100μL適量的無RNA酶的水中。
3.擴增反應(yīng)(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用微量進(jìn)樣器分別吸取檢測試劑盒RT-PCR體系試劑13μL，具體為5×RT-PCR緩沖液2μL，10U/uL Rnasin 1μL，10mmol/L dNTP 1μL，100U/uL MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，10umol/L上游引物4μL，10umol/L下游引物4μL，于PCR eppendorf管中，然后加提取的RNA模板5μL，最后加水至20μL，置PCR儀進(jìn)行擴增。擴增反應(yīng)條件95℃變性5min，42℃反應(yīng)1h。
(2)PCR體系擴增。
用微量進(jìn)樣器分別吸取檢測試劑盒中PCR體系試劑6μL，具體為10mmol/L dNTP 1μL，10umol/L上游引物1μL，10umol/L下游引物1μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL，2.5U/μLTaq酶0.5μL于PCR eppendorf管中，然后加RT反應(yīng)的模板3μL，最后加水至25μL，置PCR儀進(jìn)行擴增。
擴增反應(yīng)條件95℃變性5min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃反應(yīng)7min，4℃保存。
4.擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳及結(jié)果分析。
(1)取5uL擴增產(chǎn)物，制備10g/L的瓊脂糖凝膠，在電泳設(shè)備中電泳。
(2)在凝膠成像儀上觀察并記錄實驗結(jié)果。
(3)電泳結(jié)果如圖3所示，含菌牛奶樣品經(jīng)RT-PCR擴增后出現(xiàn)858bp擴增條帶。
對牛奶陽性樣品檢測，提取RNA需時2h，逆轉(zhuǎn)錄1.5h，PCR擴增3h，電泳0.5h，加上樣品前處理16h，整個檢測過程23h內(nèi)可以完成。
SEQ ID NO1CCTAAGACGC CAATCGAAAA GAAA 24SEQ ID NO2TAGTTCTACA TCACCTGAGA CAGA 2權(quán)利要求
1.一種活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR快速檢測試劑盒，其特征是包括5×RT-PCR緩沖液、Rnasin、dNTP、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、上游引物及下游引物、10×PCR緩沖液、Taq酶試劑。
2.權(quán)利要求1所述的活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的RT-PCR檢測試劑盒，包括RT體系及PCR體系試劑，RT體系試劑包括5×RT-PCR緩沖液、Rnasin，dNTP，MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，上游引物，下游引物；PCR體系試劑包括dNTP，10×PCR反應(yīng)緩沖液，Taq酶，上游引物及下游引物。
3.權(quán)利要求1或2所述的活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR快速檢測試劑盒，其上游引物為5′-CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG AAA-3′，下游引物為5′-TAG TTC TAC ATCACC TGA GAC AGA-3′。
4.權(quán)利要求1或2所述的活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR快速檢測試劑盒，其Rnasin濃度為10U/μL、dNTP濃度為10mmol/L、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度為100U/μL、上游引物及下游引物濃度均為10umol/L、Taq酶濃度為2.5U/μL。
5.一種利用權(quán)利要求1或2所述的活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT-PCR快速檢測試劑盒進(jìn)行快速檢測的方法，包括以下步驟(1)提取RNA①取1ml培養(yǎng)8h活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，離心后，加溶菌酶37℃作用1h，加0.5～3mL TRNzol試劑，用移液器反復(fù)混勻幾次后靜置5min；②加入200uL氯仿，用力振搖15S，再靜置2-3min；③4℃，12000g，離心15min，棄去上層液體；④加入500ul異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；⑤4℃，12000g，離心10min，再次棄去上清；⑥加入75％的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；⑦4℃，7500g，離心5min，小心棄去乙醇；充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于100uL適量的無RNA酶的水中；(2)RT-PCR擴增①逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積20μL，每次實驗取試劑盒中RT體系試劑9～13μL，具體為5×RT-PCR緩沖液2μL，10U/uL Rnasin 1μL，10mmol/L dNTP 1μL，100U/uL MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，上游引物2～4μL，下游引物2～4μL于PCR eppendorf管中，然后加提取的RNA模板8μL，最后加水至20μL，置PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件95℃變性5min，42℃反應(yīng)1h；②PCR體系擴增反應(yīng)總體積25μL，每次實驗取試劑盒中PCR體系試劑5～6μL，具體為10mmol/L dNTP 1μL，10umol/L上游引物0.5～1μL，10umol/L下游引物0.5～1μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL，2.5U/μL Taq酶0.5μL，于PCR eppendorf管中，然后加RT反應(yīng)的模板3μL，最后加水至25μL，置PCR儀進(jìn)行擴增。擴增反應(yīng)條件95℃變性5min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃反應(yīng)7min，4℃保存；(3)擴增產(chǎn)物電泳檢測取5uL擴增產(chǎn)物，制備10g/L的瓊脂糖凝膠，在電泳設(shè)備中電泳，然后在凝膠成像儀上觀察并記錄實驗結(jié)果；(4)結(jié)果分析如果樣品擴增產(chǎn)物出現(xiàn)858bp擴增條帶，說明該樣品存在活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌RT－PCR快速檢測試劑盒及檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌溶血素基因hlyA的mRNA為靶標(biāo)，通過提取樣品RNA，經(jīng)RT－PCR擴增反應(yīng)及電泳檢測，結(jié)果如出現(xiàn)858bp擴增條帶，證明該樣品存在活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。本發(fā)明還相應(yīng)地建立了檢測試劑盒，可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有檢測靈敏度高、周期短、速度快、可操作性強的特點。整個檢測過程最長可在23h內(nèi)完成，其最低檢測限可達(dá)5cfu/g(ml)樣品，對食源性和臨床出現(xiàn)的活體單核細(xì)胞增生李斯特氏菌可以進(jìn)行全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的檢測與鑒定，并可推廣應(yīng)用到環(huán)境檢測、食品衛(wèi)生領(lǐng)域、商品檢驗檢疫等領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK1982476SQ200610034150
公開日2007年6月20日 申請日期2006年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月7日
發(fā)明者吳清平, 李善志, 張菊梅, 郭偉鵬, 楊寧 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司