專利名稱：特異檢測(cè)牛皰疹病毒ⅰ型的lux熒光引物和核酸擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供牛皰疹病毒I型(BHV-1)病毒特異的熒光核酸擴(kuò)增引物并建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)BHV-1病毒的新型實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增方法，適用于進(jìn)出口動(dòng)物檢疫、動(dòng)物傳染病疫情防控、診斷和流行病學(xué)調(diào)查領(lǐng)域?qū)HV-1病毒感染引起的傳染病的快速檢測(cè)、監(jiān)控和防治。
背景技術(shù)：
牛皰疹病毒I型(BHV-1)可感染牛引起牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovinerhinotracheitis，IBR)和牛傳染性膿皰性外陰陰道炎(Infectious pustularvulvovaginitis，IPV)，是一種急性、接觸性病毒性傳染病，在臨床上表現(xiàn)為鼻氣管炎、、角膜結(jié)膜炎等癥狀，引起牛生長(zhǎng)發(fā)育不良、產(chǎn)乳量和生殖力下降、流產(chǎn)、死亡率和淘汰率增高，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。IBR/IPV被國(guó)際動(dòng)物組織(OIE)列為B類疫病，被我國(guó)列為二類動(dòng)物檢疫疫病。在活牛和牛遺傳物質(zhì)(精液、胚胎)的國(guó)際貿(mào)易和我國(guó)的進(jìn)出口檢疫中，均要求對(duì)IBR/IPV進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，我國(guó)進(jìn)口活牛的主要輸出國(guó)澳大利亞和新西蘭均是IBR/IPV高發(fā)區(qū)。該病在國(guó)內(nèi)的傳播感染范圍也較廣，對(duì)我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)、活牛和牛產(chǎn)品貿(mào)易造成較嚴(yán)重威脅。
在本發(fā)明方法之前，國(guó)內(nèi)外在進(jìn)出口動(dòng)物檢疫和疾病監(jiān)控中采用的檢測(cè)BHV-1感染的方法。長(zhǎng)期以來(lái)，由于缺乏快速、有效的檢測(cè)方法，OIE在國(guó)際動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品貿(mào)易中推薦采用血清中和試驗(yàn)和病毒分離進(jìn)行IBR診斷。這兩種方法前者檢測(cè)的是抗體，后者檢測(cè)病毒，均需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，需要1-2周時(shí)間，且敏感性不理想，其中，牛精液和胚胎的檢驗(yàn)只能采用病毒分離方法。除這兩種方法外，國(guó)內(nèi)外還采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法(ELISA)檢測(cè)抗體，由于致病因子感染動(dòng)物后產(chǎn)生抗體需要1-2周時(shí)間，抗體檢測(cè)方法不利于IBR病毒(BHV-1)急性感染或早期感染情況的診斷，并且ELISA方法特異性不理想。國(guó)內(nèi)外還報(bào)道了檢測(cè)IBR病毒的常規(guī)核酸擴(kuò)增(Polymerase chain reaction，PCR)方法，這種方法檢測(cè)的是病毒核酸，比上述方法的特異性和敏感性均有顯著提高，但常規(guī)PCR方法需要通過凝膠電泳判定結(jié)果，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且易造成PCR產(chǎn)物污染環(huán)境引起假陽(yáng)性反應(yīng)，不利于方法推廣應(yīng)用，目前這種方法主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究或少量樣品的檢測(cè)。
本發(fā)明采用LUX(Light Upon Extension)新型實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增技術(shù)原理，設(shè)計(jì)篩選了BHV-1特異的LUX熒光PCR引物，建立了快速準(zhǔn)確檢測(cè)BHV-1的LUX熒光PCR方法，該方法可通過電腦實(shí)時(shí)監(jiān)控檢測(cè)結(jié)果，不需要對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳等操作，操作簡(jiǎn)便快速，適合推廣應(yīng)用。LUX技術(shù)的原理是通過構(gòu)建一個(gè)單標(biāo)記的具有自身淬滅熒光性能的引物-LUX熒光引物，即在PCR的一個(gè)引物上引入發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并標(biāo)記上熒光基團(tuán)，在PCR反應(yīng)過程中，引物與靶序列配對(duì)后，其熒光就會(huì)恢復(fù)產(chǎn)生可檢測(cè)的光信號(hào)，從而達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程的目的。
LUX熒光PCR技術(shù)的關(guān)鍵是特異引物的設(shè)計(jì)，對(duì)于不同的檢測(cè)目標(biāo)基因，需要設(shè)計(jì)不同的特異LUX引物和根據(jù)引物的核苷酸組成性質(zhì)設(shè)置不同的反應(yīng)條件。
目前常用的實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增技術(shù)主要有采用雙標(biāo)記的寡核苷酸探針和采用雙鏈DNA結(jié)合染料兩種，前者成本高，后者易產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。LUX熒光PCR技術(shù)的特異性和敏感性與雙標(biāo)記探針技術(shù)相當(dāng)，但由于采用的是單標(biāo)記的自身淬滅熒光引物，可顯著降低檢測(cè)成本，有利于方法的推廣應(yīng)用和商業(yè)化試劑盒開發(fā)。
實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)植物病原體的快速檢測(cè)研究和臨床診斷，禽流感、口蹄疫等傳染病的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，但均為采用雙標(biāo)記寡核苷酸探針技術(shù)或核酸染料技術(shù)，未見采用LUX熒光PCR技術(shù)。另一方面，由于國(guó)內(nèi)養(yǎng)牛業(yè)和乳業(yè)生產(chǎn)近年來(lái)呈持續(xù)快速增長(zhǎng)的勢(shì)頭，近幾年均從國(guó)外大量引進(jìn)優(yōu)質(zhì)種牛，對(duì)IBR等相關(guān)傳染病的快速檢測(cè)技術(shù)需求迫切。因此，本發(fā)明所建立的方法有開發(fā)商業(yè)化檢測(cè)試劑盒的價(jià)值。迄今，除本發(fā)明外，國(guó)內(nèi)外均未有報(bào)道BHV-1特異的LUX熒光PCR檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了BHV-1特異的LUX熒光引物并建立了一種能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)BHV-1病毒的分子生物學(xué)方法-LUX實(shí)時(shí)熒光PCR方法。內(nèi)容包括1、通過專用軟件設(shè)計(jì)BHV-1特異的LUX自身淬滅熒光引物和對(duì)應(yīng)的配對(duì)引物。
引物的靶序列來(lái)源于BHV-1 gpC基因序列。通過專業(yè)軟件針對(duì)gpC基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，選取軟件生成的多對(duì)引物序列，應(yīng)用blast軟件進(jìn)行分析，從中篩選出特異性和檢測(cè)范圍滿足要求的一對(duì)LUX自身淬滅熒光引物和配對(duì)引物序列，其中反向引物為L(zhǎng)UX熒光引物，含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)并標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)。應(yīng)用blast軟件進(jìn)行核酸序列同源性分析表明，所選取的兩條引物序列均與公開數(shù)據(jù)庫(kù)中所有BHV-1 gpC基因的對(duì)應(yīng)序列完全相符合，未發(fā)現(xiàn)與其它動(dòng)物病毒的核酸序列有相關(guān)性，分析結(jié)果證實(shí)所設(shè)計(jì)的引物為BHV-1特異。引物的核酸序列見序列表。
2、對(duì)LUX實(shí)時(shí)熒光PCR退火溫度和時(shí)間、引物濃度、鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了適合LightCycler(Roche)熒光核酸擴(kuò)增儀的優(yōu)化反應(yīng)條件，包括反應(yīng)液體系和循環(huán)反應(yīng)條件。
為取得最佳的檢測(cè)效果，本發(fā)明進(jìn)行一系列試驗(yàn)，對(duì)不同的實(shí)時(shí)熒光PCR退火溫度和時(shí)間、引物濃度、鎂離子濃度進(jìn)行檢測(cè)效果測(cè)試，最終將在LightCycler(Roche)熒光核酸擴(kuò)增儀上的反應(yīng)條件優(yōu)化為65℃退火20秒、采用0.5μM引物濃度和4mM鎂離子濃度。
反應(yīng)液體系，采用20μl反應(yīng)體積，組成如下Quantitative PCR SuperMix-UDG10μl50mM MgCl20.4μl
熒光標(biāo)記引物(10μM)1μl配對(duì)引物(10μM)1μl牛血清白蛋白(5mg/mL) 1μlTaq DNA Polymerase(5U/μl) 0.5μl滅菌雙蒸水 4.1μl模板核酸 2μl擴(kuò)增循環(huán)條件，在熒光PCR儀上設(shè)定熒光F1程序選擇擴(kuò)增分析模式定量UDG處理50℃ 2min；變性95℃ 2min；循環(huán)(40次)94℃ 5s，65℃ 20s(采集信號(hào))。
3、建立了熔解曲線結(jié)果判定方法，比常規(guī)采用Ct值及擴(kuò)增曲線的判定標(biāo)準(zhǔn)更為準(zhǔn)確和敏感。以在熔解曲線上90-93℃出現(xiàn)明顯吸收峰定為陽(yáng)性反應(yīng)。
對(duì)于實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的結(jié)果判定，可采用在定量分析模式下出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線和有效Ct值作為陽(yáng)性結(jié)果的判定依據(jù)；也可采用熔解曲線判定方法，即以在熔解曲線的特定溫度區(qū)域是否出現(xiàn)吸收峰作為陽(yáng)性結(jié)果的判定依據(jù)。本發(fā)明比較了兩種判定模式，發(fā)現(xiàn)采用熔解曲線判定模式可提高檢測(cè)的敏感性和特異性。
熔解曲線分析條件，在熒光PCR儀上設(shè)定程序選擇熔解曲線分析模式熔解曲線溫度條件(在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行)95℃ 0s，72℃ 20s，95℃ 0s(0.1℃/s)。
4、將LUX實(shí)時(shí)熒光PCR方法與常規(guī)凝膠PCR方法進(jìn)行比較試驗(yàn)，表明可顯著提高檢測(cè)敏感性。
將濃度為11800μg/ml的BHV-1病毒核酸樣品進(jìn)行10倍倍比系列稀釋，分別用LUX實(shí)時(shí)熒光PCR方法和常規(guī)凝膠PCR方法進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果前者的檢測(cè)敏感性為108稀釋度，后者僅能檢測(cè)到104稀釋度，表明LUX實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢測(cè)敏感性比常規(guī)凝膠電泳PCR方法可提高達(dá)104。
5、本發(fā)明方法的具體步驟
(1)設(shè)計(jì)合成引物。
(2)、采集樣品，提取核酸。本發(fā)明可檢測(cè)體外細(xì)胞培養(yǎng)病毒樣品、動(dòng)物活體采集的樣品如血液、唾液、呼吸道分泌物、精液、陰道拭子等，以及通過剖檢采集的組織樣品，如呼吸道粘膜、神經(jīng)組織等。采用QIAGEN DNA KIT技術(shù)從上述樣品中提取核酸。
(3)、加樣。按上述反應(yīng)液體系，在反應(yīng)管中分別加入反應(yīng)液和核酸，記錄樣品編號(hào)和對(duì)應(yīng)管號(hào)。
(4)、上機(jī)檢測(cè)。在熒光PCR儀上，按上述擴(kuò)增循環(huán)條件和熔解曲線分析條件設(shè)定反應(yīng)參數(shù)，放入反應(yīng)管，開機(jī)檢測(cè)。
(5)、分析、判定結(jié)果。在定量分析模式和熔解曲線模式下分別分析反應(yīng)結(jié)果，根據(jù)熔解曲線最終判定結(jié)果。
全過程可在2小時(shí)內(nèi)結(jié)束。
6、本發(fā)明特點(diǎn)。
單標(biāo)記的熒光引物特異性強(qiáng)，成本低，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果監(jiān)控和分析自動(dòng)化，適合大批量樣品的檢測(cè)。檢測(cè)敏感性和特異性比現(xiàn)有方法顯著提高，檢測(cè)結(jié)果可靠，適合推廣應(yīng)用。
7、檢測(cè)試驗(yàn)。
(1)、對(duì)BHV-1疫苗株和分離株的檢測(cè)結(jié)果。
將BHV-1疫苗株Barta/Nu和分離株4027分別接種MDBK細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞病變后，分別取樣提取核酸進(jìn)行LUX實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，取正常MDBK細(xì)胞提取核酸作為陰性對(duì)照，并以滅菌雙蒸水作為模板設(shè)空白對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如附

圖1，Barta/Nu疫苗株和4027分離株樣品的熔解曲線均在90-93℃出現(xiàn)吸收峰，MDBK細(xì)胞陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未形成吸收峰。
(2)、對(duì)BHV-1病毒精液樣品的檢測(cè)試驗(yàn)。
取BHV-1疫苗株Barta/Nu的細(xì)胞病毒液5μl、10μl、20μl、50μl分別與195μl、190μl、180μl、150μl陰性精液樣品混合制備一組體積為200μl的病毒精液樣品，分別提取核酸后進(jìn)行LUX實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，取陰性精液樣品200μl提取核酸同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如附圖2。四個(gè)混合了病毒液的精液樣品對(duì)應(yīng)的熔解曲線均出現(xiàn)特征吸收峰，陰性精液樣品未出現(xiàn)吸收峰。
(3)、特異性試驗(yàn)。
將BHV-1病毒核酸和其它四種常見的牛病毒(牛病毒性腹瀉-粘膜病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、牛白血病病毒)核酸樣品同時(shí)進(jìn)行LUX實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果見附圖3。僅BHV-1病毒核酸樣品對(duì)應(yīng)的熔解曲線出現(xiàn)特征吸收峰。
(4)、敏感性試驗(yàn)。
取接種MDBK細(xì)胞增殖產(chǎn)生的BHV-1病毒液(毒價(jià)為10-7.5TCID50/ml)200μl提取核酸，然后用滅菌雙蒸水進(jìn)行10倍系列倍比稀釋，取10-1到10-7樣品同時(shí)進(jìn)行LUX實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。結(jié)果如附圖4，10-1到10-6樣品對(duì)應(yīng)的熔解曲線均出現(xiàn)特征吸收峰，檢測(cè)敏感性可達(dá)10-6稀釋度，10-7稀釋度和滅菌雙蒸水對(duì)照樣品沒有出現(xiàn)特征吸收峰。
附圖1、對(duì)BHV-1病毒疫苗株和分離株的檢測(cè)試驗(yàn)。
1BHV-1疫苗株Barta/Nu； 2BHV-1分離株4027；3MDBK細(xì)胞陰性對(duì)照；4滅菌雙蒸水空白對(duì)照。
附圖2、對(duì)BHV-1病毒精液樣品的檢測(cè)試驗(yàn)。
1-4分別為含50、20、10和5μl病毒液的精液樣品5陰性精液樣品對(duì)照。
附圖3、BHV-1 LUX實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)。
1BHV-1病毒核酸；2-5其他四種牛病毒核酸。
附圖4、BHV-1 LUX實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)敏感性試驗(yàn)。
1-6分別為10-1-10-6稀釋度的病毒核酸樣品；7-8分別為10-7稀釋度病毒核酸樣品和滅菌雙蒸水對(duì)照樣品。
具體實(shí)施例方式
。
1、引物設(shè)計(jì)在Genebank中下載BHV-1目標(biāo)基因gpC序列，采用在線LUX熒光引物設(shè)計(jì)軟件(http://www.invitrogen.com/lux)設(shè)計(jì)BHV-1病毒特異的LUX熒光引物和配對(duì)引物，采用Blast軟件分析引物序列的特異性。采用權(quán)力要求書中的引物。引物序列見序列表。
2、檢測(cè)樣品采集牛鼻腔或生殖道拭子、呼吸道、眼分泌物、血液、牛精液、唾液、體外細(xì)胞培養(yǎng)物等樣品。拭子樣品應(yīng)懸浮在PBS緩沖液中。
3、核酸提取采用QIAGEN DNA KIT提取核酸。步驟簡(jiǎn)要如下(1)、在1.5ML離心管中加入20μl QIAGEN蛋白酶或蛋白酶K，加入200μl樣品，若樣品體積不足200μl，則加PBS補(bǔ)足體積。
(2)、加200μl AL緩沖液，用渦旋振蕩器混勻15s。
(3)、在56℃溫浴10min。
(4)、加入200μl無(wú)水乙醇，用渦旋振蕩器混勻15s。
(5)、把所有液體移入QIAamp離心柱，套入收集管，蓋上蓋子，放入臺(tái)式微量離心機(jī)，6000×g離心1min。
(6)、把離心柱放入新的收集管，加入500μl AW1洗滌液，蓋上蓋子，6000×g離心1min。
(7)、把離心柱放入新的收集管，加入500μl AW2洗滌液，蓋上蓋子，用最高轉(zhuǎn)速(16,000-20,000×g)離心3min。
(8)、把離心柱放入新的1.5ML滅菌離心管，加入100μlAE洗脫液，室溫(15-25℃)靜置1分鐘，6000×g離心1min。
(9)、所提取的核酸樣品可直接進(jìn)行LUX實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，也可置-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 4、LUX實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)(1)、儀器LightCycler(Roche)(2)、加樣試劑除引物外，可從invitrogen公司購(gòu)買。采用20μl反應(yīng)體積，1個(gè)樣品的反應(yīng)液體系如下Quantitative PCR SuperMix-UDG10μl50mM MgCl20.4μl熒光標(biāo)記引物(10μM) 1μl配對(duì)引物(10μM) 1μl牛血清白蛋白(5mg/mL) 1μlTaq DNA Polymerase(5U/μl) 0.5μl滅菌雙蒸水 4.1μl總體積 18μl進(jìn)行多個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)，將上述各試劑的量乘以樣品數(shù)。每次檢測(cè)均設(shè)至少1管陽(yáng)性對(duì)照和1管陰性對(duì)照。
在滅菌反應(yīng)管中依序按比例加入上述試劑，用微量移液器混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡，按18μl/管分裝加入LightCycler(Roche)毛細(xì)管。
在毛細(xì)管中每管加入2μl核酸樣品，記錄樣品和反應(yīng)管編號(hào)，蓋好，700×g離心10秒，把毛細(xì)管小心放到LightCycler(Roche)儀器中。
(4)、上機(jī)檢測(cè)在LightCycler(Roche)儀器的反應(yīng)界面，按以下參數(shù)設(shè)定擴(kuò)增反應(yīng)和結(jié)果分析條件擴(kuò)增循環(huán)條件熒光設(shè)F1；程序選擇擴(kuò)增；分析模式定量。
UDG處理50℃ 2min；變性95℃ 2min；循環(huán)(40次)94℃ 5s，65℃ 20s(采集信號(hào))。
熔解曲線制備條件程序選擇熔解曲線；分析模式熔解曲線溫度條件(在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行)95℃ 0s，72℃ 20s，95℃ 0s(0.1℃/s)。
條件設(shè)定好后，對(duì)樣品進(jìn)行編輯，按儀器指示儲(chǔ)存檢測(cè)程序和試驗(yàn)數(shù)據(jù)文件，開機(jī)開始檢測(cè)反應(yīng)。
(5)、在反應(yīng)過程中，可通過電腦實(shí)時(shí)觀察各樣品熒光信號(hào)的變化情況。
5、結(jié)果判定反應(yīng)結(jié)束后，可在定量分析模式下，察看各樣品的擴(kuò)增曲線和Ct值，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)典型s型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)小于35，陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線應(yīng)平坦，應(yīng)無(wú)Ct值。
檢測(cè)結(jié)果的最終判定在熔解曲線模式下進(jìn)行，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)在90-93℃出現(xiàn)明顯吸收峰，陰性對(duì)照應(yīng)在相應(yīng)區(qū)域不出現(xiàn)吸收峰。在對(duì)照成立的條件下，樣品在90-93℃出現(xiàn)吸收峰的判為陽(yáng)性，與陰性對(duì)照一致不出現(xiàn)上述特征吸收峰的判為陰性。
BHV-1序列表<110>廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>特異檢測(cè)牛皰疹病毒I型的LUX熒光引物和核酸擴(kuò)增方法<160>2<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>該序列含有可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸<400>1cacgaggtaa cgggcgggtc gtg 23<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2cgacgctacg ccagagga 18
權(quán)利要求
1.牛皰疹病毒I型(BHV-1)病毒特異的LUX熒光核酸擴(kuò)增引物和配對(duì)引物。兩條引物根據(jù)BHV-1病毒gpC基因序列，應(yīng)用專業(yè)軟件設(shè)計(jì)和篩選得到，用于建立LUX實(shí)時(shí)熒光PCR方法快速、準(zhǔn)確檢測(cè)BHV-1病毒。其中，反向引物為L(zhǎng)UX熒光引物，除gpC基因序列外，還含有能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列，并標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)。兩條引物的序列如下正向引物5’CGACGCTACGCCAGAGGA 3’反向引物5’CACGAGGTAACGGGCGGGTCGTG 3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了牛皰疹病毒I型(BHV－1)特異的LUX(Light Upon Extension)熒光PCR引物序列和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明以BHV－1病毒的gpC基因?yàn)槟繕?biāo)基因，設(shè)計(jì)和篩選BHV－1特異的單標(biāo)記自身淬滅LUX熒光引物和對(duì)應(yīng)的配對(duì)引物。采用BLAST軟件對(duì)引物序列的分析結(jié)果表明，兩條引物序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有BHV－1病毒對(duì)應(yīng)序列完全吻合，與其他動(dòng)物病毒序列無(wú)明顯相關(guān)性。本發(fā)明對(duì)實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增反應(yīng)退火溫度和時(shí)間、鎂離子濃度、引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，采用優(yōu)化的反應(yīng)條件和熔解曲線結(jié)果判定方法，進(jìn)行了特異性和敏感性試驗(yàn)，證實(shí)方法特異、敏感?？稍?小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)到拭子、呼吸道、眼分泌物、血液、精液、體外細(xì)胞培養(yǎng)物等樣品中的BHV－1病毒，檢測(cè)敏感性比常規(guī)凝膠PCR方法可提高達(dá)10
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1952174SQ20061003405
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2006年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月7日
發(fā)明者陳茹 申請(qǐng)人:廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心