專(zhuān)利名稱(chēng)：一種增強(qiáng)單增李斯特菌溶血素o抗原性的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種增強(qiáng)單增李斯特菌溶血素0抗原性的核苷 酸序列。
背景技術(shù)：
農(nóng)產(chǎn)品和食品安全是一全球性問(wèn)題，食源性疾病是食品安全的主要問(wèn)題。近年來(lái)， 國(guó)內(nèi)外食源性疾病事件頻頻發(fā)生，而單增李斯特菌在食源性細(xì)菌中毒中占主要地位。李斯 特菌屬是最重要的人類(lèi)食源性病原菌，是90年代食品中四大病原菌之一，在美國(guó)被列為7 種主要的食源性致病菌之一。單增李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較 高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青儲(chǔ)飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動(dòng)物 很容易食入該菌，并通過(guò)口腔-糞便的途徑進(jìn)行傳播。據(jù)報(bào)道，健康人糞便中單增李氏菌的 攜帶率為0. 6-16 %，有70 %的人可短期帶菌，4-8 %的水產(chǎn)品、5-10 %的奶及其產(chǎn)品、30 % 以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。人主要通過(guò)食入軟奶酪、未充分加熱的雞 肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西紅 柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，約占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。該菌可通過(guò)眼及破損皮膚、粘膜進(jìn)入體內(nèi)而造成感染，孕婦感染后通過(guò)胎盤(pán)或產(chǎn) 道感染胎兒或新生兒，棲居于陰道、子宮頸的該菌也引起感染，性接觸也是本病傳播的可能 途徑，且有上升趨勢(shì)。單增李斯特菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，可在巨噬細(xì)胞和許多非吞噬細(xì)胞(如上皮 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞)內(nèi)增殖。其毒力因子包括李斯特菌溶血素(ListeriolysionO， LL0)，ActA蛋白，磷脂酶C，P60蛋白，PrfA蛋白，內(nèi)化素，表面蛋白P104。其中LLO是最主 要的毒力因子，由hly基因編碼的Hly蛋白，與破壞吞噬體，促進(jìn)菌體進(jìn)入胞液有關(guān)，是細(xì)菌 得以在胞液內(nèi)增殖的先決條件，它的缺失將會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒力的全部喪失。不產(chǎn)生LLO的單 增李斯特菌突變株雖可在非吞噬細(xì)胞的胞液中生存一段時(shí)間，但卻不能繁殖，并且因無(wú)法 逃逸吞噬體而不能對(duì)其他細(xì)胞的感染。除此之外，LLO還參與了同單增李斯特菌致病性有 關(guān)的其它反應(yīng)，研究顯示一單增李斯特菌感染鼠脾臟和骨髓的樹(shù)突狀細(xì)胞，可導(dǎo)致細(xì)胞的 凋亡；不產(chǎn)生LLO的單增李斯特菌突變體不能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而提純的LLO則可引起這種 程序性控可引起這種程序性控制的細(xì)胞死亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服食品檢測(cè)中現(xiàn)有技術(shù)的不足，采用定點(diǎn)突變提供一種編碼單增李斯特溶血素0蛋白的核苷酸基因序列，以提高單增李斯特菌溶血素0蛋 白的抗原性，和顯著的提高食品中單增李斯特菌的檢測(cè)靈敏度，為開(kāi)發(fā)食源性病原菌檢測(cè) 方法提供有用的侯選基因資源。本發(fā)明是依據(jù)溶血素0的毒理作用在結(jié)合免疫膠體金技術(shù)來(lái)達(dá)到檢測(cè)單增李斯 特菌的目的。免疫膠體金技術(shù)，是90年代新興的一種免疫學(xué)方法，現(xiàn)在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。它實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。 顯色程度與抗原含量成正比。本發(fā)明的單增李斯特溶血素0蛋白的核苷酸基因序列如SEQ ID No 1所示，首先 通過(guò)突變?cè)鰪?qiáng)單增李斯特溶血素0的抗原性，制得突變用質(zhì)粒模版一單增李斯特菌溶血素 0核苷酸序列；然后再對(duì)該質(zhì)粒模版進(jìn)行反向PCR法定點(diǎn)突變，后經(jīng)Blunting Kination反 應(yīng)、Ligation反應(yīng)后即可得到本發(fā)明的核苷酸序列。本發(fā)明的核苷酸序列的具體制備路線(xiàn)圖參見(jiàn)圖1。本發(fā)明采用定點(diǎn)突變制得的單增李斯特溶血素0蛋白的核苷酸基因序列，能夠提 高單增李斯特菌溶血素0蛋白的抗原性，且顯著的提高了食品中單增李斯特菌的檢測(cè)靈敏 度，為開(kāi)發(fā)食源性病原菌檢測(cè)方法提供有用的侯選基因資源。



圖1為本發(fā)明的單增李斯特溶血素0核苷酸序列的制備路線(xiàn)圖。圖2為hly基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道1_4為hly PCR產(chǎn)物，M為marker DL-2000。圖3為hly-T重組克隆質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果，其中1陽(yáng)性對(duì)照；2、3、4重組克隆質(zhì)粒； 5陰性對(duì)照；6空白對(duì)照。圖4為hly-T重組克隆質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，其中1 hly_T重組質(zhì)粒；2、3hly_T雙 酶切后(sall/xhol)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明所用限制性?xún)?nèi)切酶，定點(diǎn)突變?cè)噭┖芯?gòu)自寶生物工程(大連)有限責(zé)任 公司，引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成，DNA基因組提取試劑盒，DNA回收試劑 盒與親和層析柱也購(gòu)自該公司，其他所用化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)施例11.PCR 擴(kuò)增根據(jù)NCBI上登錄的單增李斯特菌的基因序列，并根據(jù)所要連接的載體PMD18-T的 多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。在正向引物(Hly-F)加上Sal I位點(diǎn)，在反向引物(Hly-R)加上Xho I位點(diǎn)。引物序列如下正向引物Hly-F 5，-GCGTCGAC(Sail) CCAATTGCGCAACAAACTGA-3，反向引物Hly-R 5，-CCCTCGAG (Xho I) TTTTGCGGAACCACCGTAA-3，PCR反應(yīng)程序如下94 "C 4min
94 "C3 Osec〕
56。C30sec I 30 Cycles
72 °CImin )72 °C IOmin
PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系如下ddH2037 μ 1IOXBuffer 5μ 1dNTP (IOmM)5μ 1模板DNA (lOOng/ μ 1)1 μ 1引物(10pm/ μ 1) (20pm/ μ 1) 各 1 μ 1Taq 酶(5υ/μ1)1 μ 1_總體積50 μ 12. PCR產(chǎn)物的電泳和回收用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)束，將凝膠置于紫外分析儀內(nèi)，切取 含PCR產(chǎn)物的膠塊，用DNA凝膠回收試劑盒回收。3. DNA連接反應(yīng)在無(wú)菌Eppendorf管中加入4 μ 1回收PCR產(chǎn)物，1 μ 1 pMD18_T載體，5 μ 1 Solution 1，總體積為10 μ 1。將各組分混勻，16°C連接過(guò)夜。4.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5a的制備挑取大腸桿菌DH5 α單菌落到含有50ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37°C振蕩培養(yǎng) 過(guò)夜；取10 μ 1到含有50ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C振蕩培養(yǎng)到0D600值為0. 4-0. 6 ； 將培養(yǎng)好的的菌液轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，冰浴IOmin ；在4°C，5000rpm條件下離心5min， 去上清，收集細(xì)胞；用20ml冰預(yù)冷的0. IM CaCl2輕輕懸浮沉淀，在冰上放置IOmin ；在4°C， 5000rpm條件下離心lOmin，用2ml 0. IM CaCl2懸浮沉淀，按每管200 μ 1分裝細(xì)胞懸浮液 于無(wú)菌的Eppenforf管中，用液氮快速冷凍，儲(chǔ)存于_70°C。5.大腸桿菌的轉(zhuǎn)化在200 μ 1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入10 μ 1 DNA連接產(chǎn)物，手指輕彈管壁，混 勻混合物，置于冰上30min ；42°C水浴熱激處理90sec，迅速放回冰上，冰浴2-3min ；加入 800 μ 1 LB培養(yǎng)液，混勻，37°C振蕩培養(yǎng)Ih ；將混合液涂布在A(yíng)mp固體LB培養(yǎng)基上，37°C過(guò) 夜培養(yǎng)。6.堿法小量制備質(zhì)粒DNA從培養(yǎng)基平板上挑取含目的質(zhì)粒的單菌落，接種于3ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培 養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(37°C，200rpm)。在1. 5ml離心管中，倒入1. 5ml菌液，離心(4°C， 13000rpm, lmin)；去上清，收集菌體，加入100 μ 1預(yù)冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L Tris-CKpH 8. 0), 10mmol/L EDTA (pH 8. 0))，劇烈振蕩，懸浮菌體；加入 200 μ 1 新鮮的 溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用)，蓋緊管蓋并迅速顛倒4_5次至溶液呈透明粘 稠狀；加入150 μ 1溶液III (5mol/L KAc 60mL，冰醋酸11. 5mL，H20 28. 5mL)，顛倒數(shù)次至白 色絮狀沉淀呈均勻分散狀，冰浴3-5min ；離心(4°C，13000rpm，15min)，將上清轉(zhuǎn)移到新的 離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻并離心(4°C，13000rpm，5min)；將上清液 轉(zhuǎn)入一新離心管中，加入2倍體積無(wú)水乙醇混勻，常溫放置IOmin后離心(4°C，13000rpm， 2min)；倒去上清，將離心管倒扣在紙巾上，室溫放置數(shù)分鐘，等管壁上的殘余乙醇液滴揮發(fā) 完全，用 30 μ 1 TE (pH 8.0，含 20yg/ml Dnase-free Rnase Α)溶解 DNA 沉淀，37°C保溫30min, DNA保存于_20°C備用。經(jīng)PCR驗(yàn)證，酶切驗(yàn)證(寶生物工程(大連)有限責(zé)任公司)，測(cè)序驗(yàn)證后，做為突 變用質(zhì)粒模板。實(shí)施例2單增李斯特菌溶血素0核苷酸序列的定點(diǎn)突變I) PCR 反應(yīng)1.以抽提大腸桿菌質(zhì)粒PMD18-T-hly為模板，用突變引物(52-F/52-R)，對(duì)其進(jìn)行 反向PCR擴(kuò)增，引物序列如下52-F 5' -CAAGGATTCGACTACAATAAAAACA-3，52-R 5' -TATATACTTATCGATTTCATCCGCGT-3，2.配制下列組成的PCR反應(yīng)液，全量50 μ 1。Pyrobest DNA Polymerase(5U/μ 1) 0.25 μ 1IOXPyrobest Buffer II5μ 1dNTP Mixture (各 2. 5mM)4 μ 1Primer 1 (20 μ Μ)1 μ 1Primer 2 (20 μ Μ)1 μ 1Template0. 01 Ing滅菌蒸餾水up to 50 μ 13.按下列反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
94"C 30 sec. 55°C30 sec I 30 Cycles
72 °C5 min ‘4.對(duì)PCR反應(yīng)液進(jìn)行1 % Agarose凝膠電泳。5.切膠回收目的 DNA 片段(DNA Fragment)。II)Blunting KinationJxjS1.在微量離心管中配制下列反應(yīng)液。DNA Fragment約 IpmolIOXBlunting Kination Buffer 2μ 1Blunting Kination Enzyme Mix 1 μ 1ddH20up to 20 μ 12. 37 °C 反應(yīng) 10 分鐘。3. 70°C反應(yīng) 10 分鐘。III)Ligation 反應(yīng)1.取約0. 25pmol (5 μ 1)上述的溶液于新的微量離心管中。2.加入 5 μ 1 的 Ligation Solution I,均勻混合。3.16°C 反應(yīng) 1 小時(shí)。4.反應(yīng)液全量轉(zhuǎn)化至100 μ 1的E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)北京六合華大基因(上海)采用Sanger方法進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證后，獲.得增強(qiáng)單增李斯特菌溶血素O抗原性的核苷酸序列的突變基因序列，記為PMD18-T-L52F。最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的 技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在 本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。附本發(fā)明所涉及的DNA核苷酸序列和蛋白質(zhì)的氨基酸序列表如下〈110〉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院〈120〉一種增強(qiáng)單增李斯特菌溶血素0抗原性的核苷酸序列<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>SEQ ID No 1〈211>1590<212>DNA〈213> |±曾$其jf牛寺胃(Listeria monocytogenes)〈400〉atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa60caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca120ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa180atcgataagt atatacaagg attcgattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga240gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt300gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca360atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat420caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt480atgactaatc aagacaataa aatcgttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac540gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta600agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa660tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt720gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt780aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa840gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt900caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat960gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat1020tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac1080ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca1140ccaggagttc ccattgctta tacaacaaat ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt1200aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac1260atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat1320gatcctgaag gtaacgaaat tgttcaacat aaaaactgga gcgaaaacaa taaaagcaag1380ctagctcatt tcacatcgtc catctatttg ccaggtaacg caagaaatat taatgtttac1440
gccaaagaat gcactggttt agcttgggaa tggtggagaa cggtaattga tgaccggaac 1500ctaccacttg taaaaaatag aaatatctcc atctggggca ctacgcttta tccgaaatat 1560agtaatagtg tagataatcc aatcgaataa1590<210>SEQ ID No 2<211>529<212>PRT<213> Jll.il^Sjf^g' (Listeria monocytogenes)<400>Met Lys Lys lie Met Leu Val Phe lie Thr Leu lie Leu Val Ser Leu Pro lie151015Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu ASh Ser lie20253035Ser Ser MET Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr Pro lie Glu404550Lys Lys His Ala Asp Glu lie Asp Lys Tyr lie Gln Gly Phe Asp Tyr Asn Lys55606570Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys75808590Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr lie Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser lie95100105Asn Gln Asn Asn Ala Asp lie Gln Val Val Asn Ala lie Ser Ser Leu Thr Tyr110115120125Pro Gly Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val130135140Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser lie Asp Leu Pro Gly MET Thr145150155160Asn Gln Asp Asn Lys lie Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn Asn165170175180Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro185190195Asn Val Ser Ala Lys lie Asp Tyr Asp Asp Glu MET Ala Tyr Ser Glu Ser Gln200205210215Leu lie Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val220225230Asn Phe Gly Ala lie Ser Glu Gly Lys MET Gln Glu Glu Val lie Ser Phe Lys235240245250Gln lie Tyr Tyr Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe255260265 270Gly Lys Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275280285Pro Pro Ala Tyr lie Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu
290295300305Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val Ser310315320Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn lie lie Lys Asn Ser Ser325330335340Phe Lys Ala Val lie Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu Val Gln lie lie Asp345350355360Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp lie Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg365370375Glu Thr Pro Gly Val Pro lie Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu380385390395Leu Ala Val lie Lys Asn Asn Ser Glu Tyr lie Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr400405410Thr Asp Gly Lys lie Asn lie Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn415420425430lie Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu lie Val Gln His435440445450Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser lie455460465Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn lie Asn Val Tyr Ala Lys Glu Cys Thr Gly470475480485Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val lie Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu490495500Val Lys Asn Arg Asn lie Ser lie Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr505510515520Ser Asn Ser Val Asp Asn Pro lie Glu ~k ~k ~k525529
權(quán)利要求
一種增強(qiáng)單增李斯特菌溶血素O抗原性的核苷酸序列，其特征在于，(1)與現(xiàn)有的單增李斯特菌溶血素O基因相比，在202至205間存在3個(gè)堿基突變，序列為SEQ ID NO 1；(2)其編碼蛋白序列由529個(gè)氨基酸組成，序列為SEQ ID NO 2；(3)其編碼蛋白序列第68位氨基酸殘基為Phe，序列為SEQ ID NO2。
2.權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)單增李斯特菌溶血素0抗原性的核苷酸序列在食源性病原菌 檢測(cè)方法中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)單增李斯特菌溶血素0抗原性的核苷酸序列在提高單增李斯 特菌溶血素0蛋白的抗原性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種編碼單增李斯特溶血素O蛋白的核苷酸基因序列。通過(guò)突變?cè)鰪?qiáng)單增李斯特溶血素O的抗原性，制得突變用質(zhì)粒模版—單增李斯特菌溶血素O核苷酸序列；然后再對(duì)該質(zhì)粒模版進(jìn)行定點(diǎn)突變，即制得本發(fā)明的核苷酸基因序列。本發(fā)明的核苷酸基因序列不但可以提高單增李斯特菌溶血素O蛋白的抗原性，而且還能顯著提高樂(lè)食品中單增李斯特菌的檢測(cè)靈敏度，為開(kāi)發(fā)食源性病原菌檢測(cè)方法提供了有用的候選基因資源。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101812466SQ20091020107
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日
發(fā)明者吳瀟, 唐雪明, 孫曉飛, 朱宏, 王金斌, 蔣玲曦, 譚芙蓉, 趙凱, 陶世如 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院