專利名稱：一種區(qū)分dna與相應(yīng)rna的核酸擴增檢測方法和檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種區(qū)分DNA與相應(yīng)RNA的核酸擴增檢 測方法和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是嚴(yán)重影響人類健康的慢性消耗性傳染病。由于移民、吸毒、人類免疫缺陷 病毒(HIV)與結(jié)核桿菌伴發(fā)感染、結(jié)核桿菌耐多藥性及人畜共患傳染病等因素，全球每1秒 鐘就有1個新感染者出現(xiàn)，每年新發(fā)結(jié)核病人達(dá)850-1000萬，300萬人死于結(jié)核病，且新的 發(fā)病率有逐年增加的趨勢。目前，全球約有10-20億人感染結(jié)核菌。這給全球結(jié)核病防治工 作提出了新的挑戰(zhàn)。結(jié)核病的嚴(yán)峻形勢促使全球基金機構(gòu)和科學(xué)家探討新的方法來診斷、 預(yù)防和治療結(jié)核病。結(jié)核病不僅已成為21世紀(jì)嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題，而且也 已成為嚴(yán)重的經(jīng)濟、社會、政治問題。WHO將結(jié)核病作為重點控制的傳染病，1993年，WHO宣 布“全球結(jié)核病處于緊急狀態(tài)”；1998年，WHO再次指出“遏制結(jié)核病行動刻不容緩” ；2000 年3月，WHO與WB在荷蘭阿姆斯特丹召開“結(jié)核病控制與可持續(xù)發(fā)展部長會議”。全球80% 結(jié)核病人在22個高負(fù)擔(dān)國家，中國是22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，中國的結(jié)核病人僅次于 印度居于第二位，結(jié)核病死亡占全球結(jié)核病死亡的1/4。我國目前有上億人感染有結(jié)核分枝 桿菌，結(jié)核病患者約600萬人，每年因治療不及時造成死亡的人數(shù)約25. 6萬余人。如果不 盡快改進結(jié)核病的控制措施，將有2億多人發(fā)展成活動性肺結(jié)核。結(jié)核病是病原學(xué)清楚、治療用藥方案基本確定的一種疾病。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群 (MTC)是結(jié)核病的元兇，分類學(xué)上歸屬分枝桿菌屬(該屬分為結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿 菌、麻風(fēng)分枝桿菌三類150種以上)，該復(fù)合群包括人型結(jié)核分枝桿菌(M. Tuberculosis)、 非洲結(jié)核分枝桿菌(MAfricanum 1、11，主要流行于非洲)、牛型結(jié)核分枝桿菌(M. Bovis)、 卡介苗(M. Bovis BCG，為牛型結(jié)核分枝桿菌的減毒株，是活菌疫苗，接種量不當(dāng)可致病)、田 鼠分枝桿菌(M. Microti)、卡氏分枝桿菌(MCanetti)等，均對抗結(jié)核藥物敏感。非結(jié)核分 枝桿菌(NTM)原稱非典型分枝桿菌，也是廣泛分布的環(huán)境分枝桿菌，為條件致病菌(對絕大 多數(shù)正常人為非致病菌)，對常用的抗結(jié)核藥物不敏感。常用的結(jié)核病診斷方法為細(xì)菌學(xué)檢查(1)痰涂片鏡檢法最普遍、最基本的細(xì)菌 學(xué)檢查方法，優(yōu)點是簡單、快速、廉價，當(dāng)天出結(jié)果；缺點是無法辨別死菌活菌，敏感性低，通 常需5000 10000條菌/ml才能夠得到陽性結(jié)果，特異性差，抗酸桿菌均可著色，陽性只能 說明“分枝桿菌屬陽性”，需要進一步試驗才可確定。有關(guān)鏡檢法的研究和評價很多，但由于 顯微形態(tài)學(xué)檢測原理與方法學(xué)的限制，不可能出現(xiàn)突破性的進展。(2)痰常規(guī)培養(yǎng)法(羅氏 培養(yǎng)基)是鑒定死菌活菌的可靠方法，被譽為“金標(biāo)準(zhǔn)”。缺點是時間長，需8周才能報出 結(jié)果，操作難于標(biāo)準(zhǔn)化，不同實驗室報道陽性率差異較為顯著；敏感性中等，一般認(rèn)為大于 100 1000條菌/ml才能夠得到陽性結(jié)果；特異性中等，各種分枝桿菌均可生長，需結(jié)合藥 物敏感性試驗和分枝桿菌菌種鑒定，才可確定是否為結(jié)核菌。(3)藥物敏感性試驗用于鑒定結(jié)核菌對抗菌素藥物的敏感性水平。這項試驗通常是在痰結(jié)核菌培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進行的， 故需時更長。(4)分枝桿菌菌種鑒定是根據(jù)不同分枝桿菌的理化特性，以生物化學(xué)的方法 為主。可以精確地鑒定分枝桿菌的不同菌種，但操作復(fù)雜，且個別試驗使用的藥品，有一定 的危險性。(5)痰結(jié)核菌快培系統(tǒng)(儀器快速培養(yǎng)BD公司的BACTECTB 460 system及 BACTEC MGIT 960 system) :20世紀(jì)70年代發(fā)展的一種新的結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查方法-痰 結(jié)核菌快速培養(yǎng)、藥敏系統(tǒng)。該方法將陽性檢出時間較L-J法明顯縮短，從常規(guī)培養(yǎng)的8周 縮短到3-14d，且具有操作簡便、自動化強、靈敏度高等優(yōu)點，可以檢測出大于100 1000條 菌/ml，在結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)診斷中起到了重要作用，促進了結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷的發(fā)展。主要 問題是儀器與試劑價格昂貴，檢測時間仍然較長，結(jié)果可靠性與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比仍存有爭 議等，還難以用作快速檢測。(6)噬菌體生物擴增法靈敏度較高，可達(dá)100條菌/ml，但與 細(xì)菌培養(yǎng)相比，試驗條件更為苛刻，檢出率低，因此目前評價不高。上述常規(guī)檢測方法均因靈敏度低、特異性差、費時費力等諸多原因難以滿足早期 診斷與快速診斷的需要。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸診斷尤其是熒光PCR(靈 敏度一般為1-10條菌/ml)的廣泛應(yīng)用，使得結(jié)核病的快速準(zhǔn)確診斷成為可能，已有獲得 SFDA醫(yī)療器械注冊證的熒光PCR產(chǎn)品上市。目前評價較高的商售MTC核酸診斷試劑有三 種，為Roche公司的TB Amplicor (采用PCR技術(shù)，檢測TB的16S r DNA)、Gen-Probe公司 的 Amplified MTD (采用 TMA 技術(shù)檢測 TB 的 16S r RNA)、BD 公司的 BD ProbeTec ET (采 用SDA方法擴增，發(fā)夾探針雜交技術(shù)檢測TB的IS6110 DNA和16S rDNA)，其中Amplified MTD被業(yè)內(nèi)公認(rèn)為與細(xì)菌培養(yǎng)符合率最高的核酸試劑，也是當(dāng)前評價最高的結(jié)核核酸診斷 產(chǎn)品。一般認(rèn)為與其檢測對象為RNA而非DNA有關(guān)，因為DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，細(xì)菌死亡后可以在 很長時間內(nèi)仍為陽性，而PCR的靈敏度高，有痕量的菌體DNA殘留，可測為陽性；RNA半衰期 短，細(xì)菌死亡后，很快降解，與細(xì)菌的活性相關(guān)。簡而言之，DNA檢測不能區(qū)分死菌還是活菌， 合適的RNA檢測可以區(qū)分死活菌，DNA檢測與RNA檢測結(jié)核桿菌都有其相對的臨床意義。然 而，現(xiàn)有的結(jié)核診斷尚無一種同步檢測其DNA與RNA的試劑，究其原因，在于缺乏一種核酸 擴增方法可以同步特異檢測其DNA與RNA，例如PCR方法，由于PCR無法直接對RNA進行擴 增，需經(jīng)一個逆轉(zhuǎn)錄(RT)過程，將RNA轉(zhuǎn)成DNA后再行擴增，無法區(qū)分相應(yīng)的DNA與RNA， 比如RT-PCR法檢測16Sr RNA時，其相應(yīng)的16Sr DNA也被高效地擴增，無法區(qū)分檢測的是 DNA還是RNA。再如TMA方法，由于采用等溫擴增技術(shù)，溫度較低，染色體DNA沒有變性，參 與擴增的是單鏈RNA，因此，不能直接用作DNA檢測，除非擴增前增加一步“高溫變性”的步 驟；另外，即使增加了熱變性步驟，也無法區(qū)分DNA與RNA。單一性檢測結(jié)核DNA或RNA的 核酸試劑由于不能給出比痰培養(yǎng)更多的信息，專家認(rèn)為核酸診斷并沒有達(dá)到預(yù)期的效果， 多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其診斷準(zhǔn)確性還不如細(xì)菌培養(yǎng)，部分學(xué)者甚至并不認(rèn)可熒光PCR的結(jié)果。因此本領(lǐng)域迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的核酸檢測試劑，尤其是能夠同步檢測 結(jié)核桿菌DNA與RNA的快速診斷試劑。針對上述情況，我們通過獨特設(shè)計，建立了一種適合 于國情的結(jié)核桿菌復(fù)合群DNA與RNA同步檢測的新型熒光PCR方法和試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測靈敏度高、檢測速度快的能區(qū)分DNA和相應(yīng)RNA 的核酸擴增檢測方法和檢測試劑盒。
本發(fā)明包括提供一種操作簡捷快速、可半自動化的總核酸(DNA和RNA)提取試劑， 并提供一種通過實時熒光PCR法區(qū)分檢測DNA與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄RNA的擴增試劑，并以結(jié)核病診 斷為例，詳述本發(fā)明的具體內(nèi)容。就結(jié)核病的致病菌MTC來說，根據(jù)本發(fā)明的方法，可以得 到結(jié)核患者標(biāo)本中細(xì)胞質(zhì)RNA和染色體DNA相對數(shù)量的雙重信息，便于了解患者體內(nèi)結(jié)核 桿菌的生長繁殖狀態(tài)，是死菌還是活菌，同時克服傳統(tǒng)微生物檢測及蛋白檢測的缺陷和不 足，而且彌補了現(xiàn)有國內(nèi)外診斷產(chǎn)品的缺陷。就基因表達(dá)而言，可以借助本發(fā)明研究某個基 因與其轉(zhuǎn)錄RNA的數(shù)量，從而在基因表達(dá)調(diào)控研究領(lǐng)域獲得精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)。本發(fā)明基本內(nèi)容如下1.建立了一種專一檢測RNA而不能混有其相應(yīng)DNA信息的方法。本發(fā)明的發(fā) 明人在長期實踐中建立了一種專一檢測單鏈RNA而不能檢測其相應(yīng)DNA的末端序列依賴 TSD-RT-PCR方法，其特征是檢測RNA的末端，或者說依賴于RNA末端的存在。原理類似于 真核生物表達(dá)文庫構(gòu)建時采用的全長m RNA克隆的SMART技術(shù)，但有別于該技術(shù)(SMART是 一種對未知序列的m RNA全長進行克隆為目標(biāo)的擴增技術(shù)，而本技術(shù)是對已知全長序列的 某基因進行表達(dá)研究)。具體如下(如附

圖1所示)設(shè)計一條與檢測RNA末端部分互補的 輔助寡核苷酸，該寡核酸序列由位于5’端的S區(qū)與位于3’端的T區(qū)組成，其T區(qū)序列與檢 測靶RNA的末端互補，S區(qū)的序列與人工引物一致，S與T中間可隔幾個堿基；人工引物是 用作擴增的引物之一，其序列可由設(shè)計者自由引入。整個檢測體系中含有RT引物、人工引 物、輔助寡核酸、TaqMan探針等4種寡核酸。其中由RT引物與人工引物組成一對有效的擴 增引物對；輔助寡核酸只用作逆轉(zhuǎn)錄后的延伸，PCR擴增前為UNG消化降解，不進入擴增檢 測環(huán)節(jié)，為防止輔助寡核酸自行延伸，將其3’端封閉或修飾其自由羥基；TaqMan-MGB探針 用作擴增產(chǎn)物的檢測。具體步驟如下a)逆轉(zhuǎn)錄與RNA 5’末端轉(zhuǎn)換模板合成RT引物(16R)以16S rRNA為模板，在逆 轉(zhuǎn)錄酶作用下延伸，當(dāng)延伸至5’末端時，與反應(yīng)體系中的輔助寡核苷酸雜交而通過SMART 機制繼續(xù)合成至輔助寡核苷酸的5’末端。SMART ^"Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript"
通常用在以微量mRNA為起始模板，逆轉(zhuǎn)錄后擴增得到全長cDNA的表達(dá)文庫構(gòu)建中。由于 mRNA含有5，帽子結(jié)構(gòu)與3，Poly A，在合成cDNA的反應(yīng)中事先加入的3，末端帶Oligo (dG) 的SMART引物，由于逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達(dá)mRNA的5，末端時碰到真核 mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)”，即甲基化的G時會連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個(dC)，SMART 引物的Oligo (dG)與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板，逆轉(zhuǎn)錄酶 會自動轉(zhuǎn)換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得 到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo (dT)的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序 列，合成第二鏈后可以利用通用引物進行擴增。該技術(shù)實際上是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端 轉(zhuǎn)移酶活性。類似地，本發(fā)明采用的輔助寡核苷酸其T區(qū)相當(dāng)于Oligo(dG)，S區(qū)相當(dāng)于SMART 引物。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄進行至16S r RNA的5’末端時，轉(zhuǎn)錄出的新生鏈可與預(yù)設(shè)的單鏈輔助寡 核酸互補雜交，逆轉(zhuǎn)錄酶會自動轉(zhuǎn)換模板，以該互補寡核酸作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單 鏈，直到該互補寡核酸末端。不同之處在于，本輔助寡核苷酸的3’端采用生物素或其它修飾封閉掉可能的延伸反應(yīng)，為不干擾后續(xù)PCR反應(yīng)，將輔助寡核苷酸中的T以U代替，PCR 開始前的UNG步驟將含U的輔助寡核苷酸清除。輔助寡核苷酸的S區(qū)序列可以自由設(shè)計， 與用作擴增的“人工引物”序列一致。另外，由于原核細(xì)菌RNA的5’末端不含帽子結(jié)構(gòu)，不 能直接應(yīng)用SMART技術(shù)擴增，而可以通過本設(shè)計方案進行有效擴增，更為重要的是，相應(yīng)的 16S rDNA由于不具備上述游離的5’末端而不能被有效擴增(如附圖2所示)，所以本項發(fā) 明為一種專一檢測RNA末端而不能檢測相應(yīng)DNA的方法。b)取上述步驟產(chǎn)生的新模板加入到熒光PCR體系中，體系中的UNG酶將輔助寡核 苷酸消化。c)由“逆轉(zhuǎn)錄引物16R”與“人工引物”組成的引物對新模板進行有效的PCR擴增。 用設(shè)計于16S rRNA上的特異性TaqMan探針對擴增產(chǎn)物進行實時檢測。2.為了同步給出相應(yīng)DNA的信息，提供結(jié)核分枝桿菌染色體核酸的數(shù)量，在 RT-PCR體系中引入另一對引物，針對其染色體DNA，且該DNA序列不存在于MTC RNA中。 16S-23S r DNAITS序列和插入序列IS6110序列是最佳的候選之一，因其不被轉(zhuǎn)錄，沒有 RNA階段，類似于真核生物斷裂基因中的內(nèi)含子；更為合適地，IS6110序列和ITS序列均為 MTC特異，可以區(qū)分于NTM及其它細(xì)菌，近年來有較多報道利用IS6110序列或ITS序列作 為MTC的TaqMan探針法PCR特異檢測，甚至用作與NTM鑒別檢測。為此，本發(fā)明還公開了 一種以MTC ITS或IS6110序列為靶基因的TaqMan或TaqMan MGB PCR法檢測引物與探針， 用以輔助前述發(fā)明的有效實施。3.就結(jié)核核酸診斷而言，選擇合適的檢測靶基因尤為重要，以16s rRNA的5’端區(qū) 域最為合適。由于16s rRNA在分支桿菌中的拷貝數(shù)為lOOO-lOOOOcopies/cell，因此選擇 16s rRNA作為靶序列容易獲得很高的檢測靈敏度，例如Gen-Probe公司的Amplified MTD 就是以16s rRNA為TMA擴增的靶核酸，臨床試驗表明其檢出率高于Roche的TB Amplicor, FDA批準(zhǔn)其為唯一可用于涂陽標(biāo)本與涂陰標(biāo)本檢測的試劑。但Amplified MTD也有缺陷， 僅能檢測16s rRNA而不能檢測16s rDNA ；TMA方法學(xué)限制，僅能定性檢測而不用作定量檢 測；價格昂貴。4.就16s rRNA靶序列而言，應(yīng)選擇合適類型的檢測探針。設(shè)計專一性高的TaqMan MGB探針用作檢測MTC的16S r RNA。核糖體是細(xì)菌唯一的細(xì)胞器，是蛋白質(zhì)合成的場所。 編碼rRNA的基因是按5’16S-23S-5S 3’方式排列的，由兩個非編碼的間隔區(qū)序列(ITS)所 分開。16S rDNA及23S rDNA序列均可作為一個較理想的分類學(xué)靶基因。此兩段基因序列 均由保守區(qū)和可變區(qū)組成，由于承擔(dān)重要的生物學(xué)功能因而在進化壓力下保持了高度的保 守性，普遍存在于各種細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，最能符合通用性的要求，常用于細(xì)菌同源性分析，是理 想的引物和探針來源。16S rRNA及23SrRNA基因的保守區(qū)對真細(xì)菌界的所有細(xì)菌均具有 同源性，所以要滿足能夠檢測出所有病原菌的臨床需要，可在該區(qū)選擇探針和引物。而要檢 測特異的種，可以在16S rRNA基因的變異區(qū)中設(shè)計探針與引物在變異區(qū)中，科、屬、種間 具備特征性變異，可根據(jù)需要設(shè)計不同分類等級特異的引物和探針，將病原菌鑒別開來，甚 至能設(shè)計出型特異的探針。本發(fā)明人通過基因序列分析比較及臨床試驗驗證，以16S r RNA 為靶基因，設(shè)計出只檢測結(jié)核復(fù)合群的引物和探針。由于可變區(qū)內(nèi)其它非結(jié)核分支桿菌也 有同源性較高的核酸序列，與結(jié)核復(fù)合群的核酸序列區(qū)別僅幾個堿基，為了取得較高的分 辨率和優(yōu)秀的信噪比，選用了 TaqMan MGB探針。MGB探針其顯著優(yōu)點是探針短，信噪比好；為非熒光淬滅基團，性能穩(wěn)定而熒光干擾??；分辨率高，可以區(qū)分一個堿基(一個堿基不同 即可引起Tm值的大幅降低如20°C，錯配即可為陰性結(jié)果，被廣泛用于基因的單堿基突變分 析(SNP:Single Nucleotide Polymorphism，即單核苷酸多態(tài)性)；而常規(guī)的TaqMan探針具 有一定的“容錯”能力，單個甚至兩個、三個堿基錯配有可能不影響到檢測，Tm相差不大，結(jié) 果仍為陽性，如 Yao Y ( "Evaluation of minor groove binding probeand Taqman probe PCR assays :Influence of mismatches and template complexity onquantification", Mol Cell Probes, 2006)等人研究表明=TaqMan探針可以在高達(dá)五個堿基錯配時仍有檢測 信號，而設(shè)計合理的MGB探針有一個堿基錯配即無檢測信號。通過設(shè)計合適的TaqMan MGB 探針來區(qū)分結(jié)核分支桿菌復(fù)合體(MTC)和非結(jié)核分支桿菌(NTM)，保證NTM檢測結(jié)果為陰性 (引物可以擴增MTC和部分NTM)，MTC結(jié)果均為陽性。5.本發(fā)明還提供了一種快速簡捷的核酸提取試劑，以硅膠為吸附核酸的介質(zhì)，簡 單、快速、方便、操作難度低。由胍鹽組成的強力裂解液使待測樣品中的細(xì)胞迅速裂解、蛋白 變性、核酸釋放，核酸酶被滅活。加入硅膠顆粒，核酸被吸附，經(jīng)過洗滌液洗滌兩次，吸附有 核酸的硅膠顆粒直接用作逆轉(zhuǎn)錄，并在輔助寡核苷酸的作用下完成末端轉(zhuǎn)換模板合成。提 取試劑經(jīng)過優(yōu)化，對DNA與RNA均有相同的得率，經(jīng)證實該試劑對于MTC DNA與RNA具有相 同的提取效率，是一種純化總核酸的提取試劑。根據(jù)上述的發(fā)明所述，優(yōu)選的特異性擴增檢測MTC 16S r RNA的引物、TaqMan MGB 探針如下輔助寡核苷酸Hl:5'-ccg cag aac acg ggt tea utt tgt ttg gag agu ttg ate ctg gcu cag g-3'SEQ ID NO 1 ；人工弓丨物 API :5，-ccg cag aac acg ggt tca_3，SEQ ID NO 2 ；逆轉(zhuǎn)錄引物 16R :5，-gcc ttg gta ggc cgt cac_3， SEQ ID NO 3 ；檢測探針16P :Rl-aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQ SEQ ID NO :4。根據(jù)上述的發(fā)明所述，優(yōu)選的特異性擴增檢測MTC ITS DNA的引物、TaqMan MGB探 針如下ITSF 5' -acc tcc ttt cta agg age acc a_3'SEQ ID NO 5 ；ITSR 5' -gat get cgc aac cac tat cca_3'SEQ ID NO 6 ；ITSP :Rl(R2)-aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQSEQ ID NO :7。根據(jù)上述的發(fā)明所述，優(yōu)選的特異性擴增檢測MTC IS6110 DNA的引物、TaqMan MGB探針如下ISF 5' -ggg tag cag acc tea cct atg-3'SEQ ID NO 8 ；ISR :5，-cgt agg cgt egg tga caa a_3，SEQ ID NO 9 ；ISP :Rl(R2)-tgt cga cct ggg cag g-MGB NFQ SEQ ID NO :10。上述探針中的R 為熒光報告基團，如 FAM、VIC、HEX、ΤΕΤ、JOE、CY3、CY5、NED、ROX 等熒光基團，Rl與R2分別代表兩種熒光報告基團，其中的一種為FAM，另一種根據(jù)使用的熒 光PCR儀擁有的第二檢測波長而定。如ABI7500/7000等，R2優(yōu)選為VIC ；如MJ0PTIC0N2， R2優(yōu)選為HEX等，使用者可以根據(jù)需要選擇合適的R2，使得同管PCR/RT-PCR的兩種檢測熒 光均為儀器識別(有的儀器需要校正后方能使用)且無干擾。
基于上述核酸擴增檢測方法，本發(fā)明還提供相應(yīng)的核酸檢測試劑盒。該核酸檢測 試劑盒核酸檢測試劑盒包含裂解液、核酸提取液、溶菌酶溶液、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶系、 結(jié)核DNA PCR反應(yīng)液、結(jié)核RNA PCR反應(yīng)液和質(zhì)控對照試劑；其中，所述裂解液為裂解細(xì)菌 的硫氰酸胍溶液；所述核酸提取液為二氧化硅顆粒；所述PCR反應(yīng)液含結(jié)核DNA/RNA引物、 Taqman-MGB探針和dNTP、耐熱聚合酶及緩沖鹽溶液；所述逆轉(zhuǎn)錄酶系為多酶組份體系；所 述質(zhì)控對照試劑為選擇使用，包括強陽性對照、弱陽性對照、活菌對照、死菌對照；所述陽性 對照為含有結(jié)核核酸的一段DNA或RNA ；所述活菌對照為卡介苗；所述死菌對照為滅活的卡 介苗；結(jié)合本發(fā)明提供的用于MTC RNA/DNA檢測的引物、探針，本發(fā)明的試劑盒中的組分 如下①裂解液6MGTC,5 % NP_40、5 % Triton X-100U % 肌氨酸鈉、50m M Tris-HCI(pH 6.0)②核酸提取液5%SILICA(sigma)③溶菌酶溶液500KU/ml溶菌酶 50 mM Tris-HCI (ρ Η7. 5)④逆轉(zhuǎn)錄緩沖液RTBuffer 中含 1. 6m M d NTPs,2mM DTT,4mM MgC12,0. 3 μ M it 轉(zhuǎn)錄引物即SEQ ID NO :3。⑤逆轉(zhuǎn)錄酶系 υ/μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶，5υ/μ 1 RNasin，0. 5 μ M輔助寡核苷酸Hl即 SEQID NO :1。⑥MTC-DNA PC R 反應(yīng)液PCR Buffer 中含 0. 8m M d NTPs,4mM MgC12，0. 1 0· 4μ M 引物探針組合 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7(或 SEQ ID NO 8、SEQ ID NO :9、SEQID NO 10 組合)。⑦MTC-RNA PC R 反應(yīng)液PCR Buffer 中含 0. 8m M d NTPs,4mM MgC12，0.1 0. 4μΜ 引物探針組合 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO 3, SEQID NO :4。⑧強陽性對照適量基因工程技術(shù)獲得的DNA及其體外轉(zhuǎn)錄的RNA，溶于核酸穩(wěn)定 儲存液。⑨弱陽性對照適量基因工程技術(shù)獲得的DNA及其體外轉(zhuǎn)錄的RNA，溶于核酸穩(wěn)定 儲存液。⑩活菌對照(減毒株)小于lOOng/ml卡介苗，BSA、蔗糖、甘油，含有防腐劑的TE 溶液。經(jīng)定標(biāo)后還可制成定量工作標(biāo)準(zhǔn)品。 死菌對照(減毒株)小于lOOng/ml滅活處理的卡介苗，BSA、蔗糖、甘油，含有 防腐劑的TE溶液。經(jīng)定標(biāo)后還可制成定量工作標(biāo)準(zhǔn)品。其中組分① ③為標(biāo)本處理試劑(核酸提取)；組分④ ⑦為核酸擴增檢測試劑， ④ ⑦各組分中還包含常規(guī)使用的穩(wěn)定劑和促進劑等。其余為質(zhì)控對照試劑可根據(jù)實際應(yīng) 用情況選用。檢測流程A標(biāo)本預(yù)處理A. 1 痰液A. 1. 1以清晨第一口痰為宜，囑患者用力咳出深部的痰于無菌樣本保存管中。Α. 1. 2痰液中加入2 3倍體積的液化劑(可選用IM NaOH)，振蕩混勻，室溫置15-30分鐘液化。Α. 1. 3取液化后的標(biāo)本1. Oml至1. 5ml離心管，12000rpm離心5分鐘。Α. 1. 4去上清，沉淀加PBS 1ml，混勻，12000rpm離心5分鐘。Α. 1. 5去上清，沉淀加PBS 1ml，混勻，12000rpm離心5分鐘。A. 1.6去上清，沉淀中加PBS 80 μ 1，混勻后備用。Α. 2肺及支氣管灌洗液、尿液、腦脊液、腹水等Α. 2. 1取液體1. Oml至1. 5ml離心管，12000rpm離心5分鐘。A. 2. 2去上清，沉淀加PBS 1ml，混勻，12000rpm離心5分鐘。A. 2. 3去上清，沉淀中加PBS 80 μ 1，混勻后備用。B.病毒核酸提取B. 1實驗前準(zhǔn)備B. 1. 1將裂解液置70°C加熱5分鐘，使試劑瓶內(nèi)的結(jié)晶全部溶解。B. 1. 2配制洗滌液取50ml Corning離心管，加入無水乙醇35ml，補純化水至 50ml，混勻后室溫備用。B. 2實驗步驟B. 2. 1取步驟A預(yù)處理后的樣本，作好標(biāo)記；另取數(shù)個1. 5ml離心管，分別加入 80 μ 1質(zhì)控對照品，并作好標(biāo)記。B. 2. 2在上述樣本管中加入20 μ 1溶菌酶溶液，混勻后置37。C反應(yīng)30分鐘。B. 2. 3分別加入200 μ 1裂解液，蓋上管蓋，上下顛倒混勻或振蕩混勻。B. 2. 4分別加入20 μ 1核酸提取液，蓋上管蓋，振蕩混勻，室溫5 10分鐘。B. 2. 5 2000 4000rpmX lmin,去上清。B. 2. 6分別加入500μ 1洗滌液，振蕩混勻，使沉淀分散，充分懸起。B. 2. 7 2000 4000rpmX lmin,去上清。B. 2. 8分別加入200μ 1洗滌液，振蕩混勻，使沉淀分散，充分懸起。B. 2. 9置4000rpmX lmin,去上清，管壁不得殘留液體。B. 2. 10開蓋后置60 80°C烘干5 10分鐘，目測管內(nèi)不殘留任何液體且固體呈 白色。C.逆轉(zhuǎn)錄及末端交換模板合成C. 1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的配制根據(jù)待檢樣品數(shù)按逆轉(zhuǎn)錄緩沖液逆轉(zhuǎn)錄酶系= 19 1的體積比例配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，混勻后離心，時間5 12秒。C. 2取步驟B. 2. 10中干燥后的沉淀管，加入20 μ 1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液?；靹蚝笾?2C 反應(yīng)30分鐘完成逆轉(zhuǎn)錄及末端交換模板合成反應(yīng)。D. PCR擴增檢測D. IMTC-DNA PCR反應(yīng)液、MTC-RNA PCR反應(yīng)液室溫下(例如15°C "30 °C )融化混 勻，低速離心，時間可為5 20秒。D. 2將其分別分裝至PCR反應(yīng)管中，每管28 μ 1。D. 3加樣在裝有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中，用帶濾芯吸頭分別加入2 μ 1步驟C. 2的 產(chǎn)物，即每個樣品MTC-DNA PCR反應(yīng)管中加2 μ 1，MTC_RNA PCR反應(yīng)管中加2 μ 1，蓋上管蓋 后轉(zhuǎn)移到擴增檢測區(qū)上機。
E.熒光PCR運行參數(shù)如下表所示(可參照各類儀器的操作軟件自行設(shè)置)
權(quán)利要求
一種區(qū)分DNA與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄的RNA的核酸擴增檢測方法，其特征在于設(shè)計一條與檢測RNA末端部分互補的輔助寡核苷酸，該寡核酸序列由位于5’端的S區(qū)與位于3’端的T區(qū)組成，其T區(qū)序列與檢測靶RNA的末端互補，S區(qū)的序列與人工引物一致，S與T中間可隔幾個堿基；人工引物是用作擴增的引物之一，其序列可由設(shè)計者自由引入；整個檢測體系中含有RT引物、人工引物、輔助寡核酸、TaqMan探針4種寡核酸；其中由RT引物與人工引物組成一對有效的擴增引物對； 輔助寡核酸只用作逆轉(zhuǎn)錄后的延伸，PCR擴增前為UNG消化降解，不進入擴增檢測環(huán)節(jié)，為防止輔助寡核酸自行延伸，將其3’端封閉或修飾其自由羥基；TaqMan MGB探針用作擴增產(chǎn)物的檢測；具體步驟如下a)逆轉(zhuǎn)錄與RNA 5’末端轉(zhuǎn)換模板合成RT引物(16R)以16S rRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下延伸，當(dāng)延伸至5’末端時，與反應(yīng)體系中的輔助寡核苷酸雜交而通過SMART機制繼續(xù)合成至輔助寡核苷酸的5’末端；b)取上述步驟產(chǎn)生的新模板加入到熒光PCR體系中，體系中的UNG酶將輔助寡核苷酸消化；c)由“逆轉(zhuǎn)錄引物16R”與“人工引物”組成的引物對新模板進行有效的PCR擴增。用設(shè)計于16S rRNA上的特異性TaqMan探針對擴增產(chǎn)物進行實時檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在RT-PCR體系中引入另一對引物，16S-23S r DNA ITS序列和插入序列IS6110序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于選擇16srRNA的5’端區(qū)域為檢測靶基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用TagmanMGB探針作為檢測MTC的 16srRNA的探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于特異性擴增檢測MTC16S r RNA的引物、 TaqMan MGB探針如下輔助寡核苷酸Hl 5' -ccg cag aac acg ggt tea utt tgt ttg gag agu ttg ate ctg gcu cag g-3'SEQ ID NO 1 ；人工弓丨物 API 5' -ccg cag aac acg ggt tca_3'SEQ ID NO 2 ；逆轉(zhuǎn)錄引物 16R: 5，-gcc ttg gta ggc cgt cac_3，SEQ ID NO 3 ；檢測探針 16P Rl-aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQSEQ ID NO 4 ；特異性擴增檢測MTC ITS DNA的引物、TaqMan MGB探針如下 ITSF 5' -acc tcc ttt cta agg age acc a_3' SEQ ID NO 5 ； ITSR 5' -gat get cgc aac cac tat cca~3' SEQ ID NO :6 ； ITSP Rl(R2)-aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQ SEQ ID NO -J ； 特異性擴增檢測MTC IS6110 DNA的引物、TaqMan MGB探針如下 ISF 5' -ggg tag cag acc tea cct atg-3' SEQ ID NO :8 ； ISR 5' -cgt agg cgt egg tga caa a~3'SEQ ID NO :9 ；ISP Rl(R2)-tgt cga cct ggg cag g-MGB NFQ SEQ ID NO 10 ； 上述探針中，Rl與R2分別代表兩種熒光報告基團，其中的一種為FAM，另一種根據(jù)使用 的熒光PCR儀擁有的第二檢測波長而定。
6.一種用于權(quán)利要求1所述檢測方法的試劑盒，其特征在于核酸檢測試劑盒包含裂 解液、核酸提取液、溶菌酶溶液、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶系、結(jié)核DNA PCR反應(yīng)液、結(jié)核RNA PCR反應(yīng)液和質(zhì)控對照試劑；其中，所述裂解液為裂解細(xì)菌的硫氰酸胍溶液；所述核酸提取 液為二氧化硅顆粒；所述PCR反應(yīng)液含結(jié)核DNA/RNA引物、Taqman-MGB探針和dNTP、耐熱 聚合酶及緩沖鹽溶液；所述逆轉(zhuǎn)錄酶系為多酶組份體系；所述質(zhì)控對照試劑為選擇使用， 包括強陽性對照、弱陽性對照、活菌對照、死菌對照；所述陽性對照為含有結(jié)核核酸的一段 DNA或RNA ；所述活菌對照為卡介苗；所述死菌對照為滅活的卡介苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于特異性擴增檢測MTC16S r RNA的引物、 TaqMan MGB探針如下輔助寡核苷酸Hl 5' -ccg cag aac acg ggt tea utt tgt ttg gag agu ttg ate ctg gcu cag g-3'人工引物API 逆轉(zhuǎn)錄引物16R 檢測探針16P 5' -ccg cag aac acg ggt tca_3， 5' -gcc ttg gta ggc cgt cac~3' Rl—aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQ特異性擴增檢測MTC ITS DNA的引物、TaqMan MGB探針如下ITSF ITSR ITSP5' _acc tcc ttt cta agg age acc a_3’ 5' -gat get cgc aac cac tat cca~3' Rl(R2)-aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQ特異性擴增檢測MTC IS6110 DNA的引物、TaqMan MGB探針如下ISF ISR ISP5' -ggg tag cag acc tea cct atg-3' 5' -cgt agg cgt egg tga caa a-3' Rl(R2)-tgt cga cct ggg cag g-MGB NFQ SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 1 ； SEQ ID NO 2 ； SEQ ID NO 3 ； SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5 ； SEQ ID NO 6 ； SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO 9 ；上述探針中，Rl與R2分別代表兩種熒光報告基團，其中的一種為FAM，另一種根據(jù)使用 的熒光PCR儀擁有的第二檢測波長而定。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種區(qū)分DNA與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄的RNA的核酸擴增檢測方法，并提供相應(yīng)的檢測試劑盒。該試劑盒包括裂解液、核酸提取液、溶菌酶溶液、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶系、結(jié)核DNA PCR反應(yīng)液、結(jié)核RNA PCR反應(yīng)液等。其中選用的引物分別針對結(jié)核桿菌染色體DNA的一段ITS序列或IS6110序列、核糖體RNA上的一段16Sr RNA的序列，探針最好為Tagman MGB探針，并選用不同的熒光素標(biāo)記。本發(fā)明的試劑盒，含有UNG酶組分，可以判定每個細(xì)菌內(nèi)含有16S r RNA的相對量，用來判斷標(biāo)本中的結(jié)核桿菌的生長情況以監(jiān)測感染狀態(tài)。本發(fā)明簡便快捷，可專一性RNA及專一性DNA檢測，為臨床提供更全面的信息。
文檔編號C12Q1/68GK101948908SQ20091020098
公開日2011年1月19日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者周科隆, 王縵, 袁青 申請人:上?？迫A生物工程股份有限公司