預(yù)擴(kuò)增試驗(yàn)的制作方法
【專利說(shuō)明】預(yù)擴(kuò)増?jiān)囼?yàn) 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0001] 本申請(qǐng)要求2014年5月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/987,921的優(yōu)先權(quán)，在此 引入以供所有目的的參考。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸分析常常需要在進(jìn)一步下游分析前擴(kuò)增一條序列或一組序列。這可能是由于 被調(diào)查的序列在樣品中是稀有的，或因?yàn)橄掠畏治鲂枰罅康钠鹗疾牧?。然而獲自生物來(lái) 源或環(huán)境的樣品可能包含抑制擴(kuò)增的因子。此外，樣品之間也有差異.例如來(lái)自一個(gè)個(gè)體 的血樣可能比來(lái)自另一個(gè)個(gè)體的血樣含有更多抑制因子，使得在第一種樣品中預(yù)擴(kuò)增步驟 效果更差。這些問(wèn)題可能會(huì)使下游分析更困難，或?qū)е聵悠烽g的不一致結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本文提供了能用于建立擴(kuò)增反應(yīng)效力的方法和成分?？稍跇悠吩囼?yàn)（assay)中加 入這些成分，作為擴(kuò)增反應(yīng)的內(nèi)部對(duì)照。
[0004] 本文提供了檢測(cè)第一核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的狀況（例如由于異?；蛞种苿┰斐蓴U(kuò)增 比預(yù)期少）的方法，該方法包括： 配制第一混合物，其中第一混合物包含第一核酸模板（例如單鏈或雙鏈核酸）、第二核 酸模板、和對(duì)第一核酸模板特異性的第一組引物（例如能與第一核酸模板雜交）； 對(duì)第一混合物進(jìn)行第一循環(huán)數(shù)的第一擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生產(chǎn)物（例如包含第一核酸模板的 擴(kuò)增產(chǎn)物）； 配制第二混合物，其中第二混合物包含所述產(chǎn)物（例如所述產(chǎn)物的等份或稀釋等份）、 對(duì)第二核酸模板特異性的第二組引物、和對(duì)第一核酸模板的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的第三組引 物； 對(duì)第二混合物進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)； 確定第一核酸模板擴(kuò)增達(dá)到Cq所需循環(huán)數(shù)（Cql)和第二核酸模板擴(kuò)增達(dá)到Cq所需循 環(huán)數(shù)（Cq2);和 當(dāng)達(dá)到Cq2所需的循環(huán)數(shù)和達(dá)到Cql的循環(huán)數(shù)之間的差異（ACq)小于（例如小2%、 5%、10%、20%、30%、40%、1-20%、或5-30%)循環(huán)數(shù)閾值（例如當(dāng)?shù)谝缓怂崮０搴偷诙?核酸模板在第一混合物中以相同量存在時(shí)的第一循環(huán)數(shù)）時(shí)，在第一擴(kuò)增反應(yīng)中檢測(cè)到狀 況。
[0005] 在一些實(shí)施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在分開(kāi)的核酸分子上。在一些 實(shí)施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板是一條核酸分子上不重疊的模板。參見(jiàn)例如圖 1C。在一些實(shí)施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板是一條核酸分子上重疊的模板。參 見(jiàn)例如圖ID。
[0006] 在一些實(shí)施方式中，第一混合物還包含樣品（例如生物樣品或其它懷疑含有感興 趣核酸的樣品）。在一些實(shí)施方式中，第一混合物還包含對(duì)樣品核酸模板（例如包含于懷疑 的感興趣核酸內(nèi)的模板）特異性的第四組引物。在一些實(shí)施方式中，樣品核酸模板包含遺 傳變體（例如CNV、SNP或突變）。在一些實(shí)施方式中，第二混合物還包含對(duì)樣品核酸模板特 異性的第五組引物。在一些實(shí)施方式中，第四和第五組引物是相同的。在一些實(shí)施方式中， 第四和第五組引物是不同的（例如與樣品核酸模板上的不同序列互補(bǔ)，或不同地標(biāo)記）。
[0007] 在一些實(shí)施方式中，第一擴(kuò)增反應(yīng)是多重的，例如設(shè)計(jì)為擴(kuò)增多個(gè)樣品核酸模板。 在一些實(shí)施方式中，第一混合物由此還包含對(duì)多條/種樣品核酸模板特異性的多組引物。 在一些實(shí)施方式中，所述第二擴(kuò)增反應(yīng)是多重的。在一些實(shí)施方式中，第二混合物還包含對(duì) 獲自第一擴(kuò)增反應(yīng)的樣品核酸模板的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的多組引物。在一些實(shí)施方式中，第 一擴(kuò)增產(chǎn)物分成多種"第二"混合物，每種設(shè)計(jì)用于檢測(cè)來(lái)自第一擴(kuò)增反應(yīng)的樣品核酸模板 的一種或多種不同的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0008] 在一些實(shí)施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在第一混合物中以等量存在。 在一些實(shí)施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在同一條核酸分子（單鏈或雙鏈）上。在 一些實(shí)施方式中，第一和第二核酸模板長(zhǎng)度相同，或長(zhǎng)度差別在卜50個(gè)核苷酸內(nèi)。在一些 實(shí)施方式中，第一和第二核酸模板長(zhǎng)50-2000個(gè)核苷酸，例如80-120或100-500個(gè)核苷酸， 或長(zhǎng)約100、200、250、300、500或750個(gè)核苷酸。
[0009] 在一些實(shí)施方式中，第一組引物與第三組引物相同。在一些實(shí)施方式中，第一和第 三組引物是不同的（例如與第一核酸模板上的不同或重疊序列互補(bǔ)，或不同地標(biāo)記）。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，所述第一擴(kuò)增反應(yīng)是PCR。在一些實(shí)施方式中，第一循環(huán)數(shù)在 1-25之間（例如4-10、5-15、2-8、6-20、10-24等）。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)達(dá)到Cq2所需循 環(huán)數(shù)和達(dá)到Cql所需循環(huán)數(shù)之間的差異比循環(huán)數(shù)閾值小約0. 01-5個(gè)循環(huán)（例如0. 1-1，小 于1、0. 01-2、3、4、5、2-5)時(shí)，檢測(cè)到狀況（例如異常或抑制）。在一些實(shí)施方式中，所述第 一擴(kuò)增反應(yīng)是逆轉(zhuǎn)錄。在一些實(shí)施方式中，第一核酸模板是RNA，而第二核酸模板是DNA。在 一些實(shí)施方式中，當(dāng)達(dá)到Cq2所需循環(huán)數(shù)和達(dá)到Cql所需循環(huán)數(shù)之間的差異是0. 01-2(例 如第一和第二核酸模板量相等（或盡可能接近））時(shí)，檢測(cè)到狀況（例如異?；蛞种疲?。在 一些實(shí)施方式中，第二擴(kuò)增反應(yīng)是PCR，例如qPCR (實(shí)時(shí)PCR或數(shù)字PCR)。在一些實(shí)施方式 中，進(jìn)行第二循環(huán)數(shù)的第二擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，第二循環(huán)數(shù)相當(dāng)于或大于第一循 環(huán)數(shù)。
[0011] 在一些實(shí)施方式中，在配制第二混合物前，至少部分從產(chǎn)物中除去第一組引物。在 一些實(shí)施方式中，產(chǎn)物在第二混合物中稀釋至少2倍（例如5倍、10倍、20倍、10-100倍）， 例如作為等分的結(jié)果。
[0012] 還提供了在第一擴(kuò)增反應(yīng)中檢測(cè)狀況（例如比預(yù)期擴(kuò)增少）的方法，該方法包 括： 配制第一混合物，其中第一混合物包含第一核酸模板、第二核酸模板、和對(duì)第一核酸模 板特異性的第一組引物； 對(duì)第一混合物進(jìn)行第一循環(huán)數(shù)的第一擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生產(chǎn)物； 配制第二混合物，其中第二混合物含有所述產(chǎn)物、進(jìn)行第二核酸試驗(yàn)的試劑； 對(duì)第二混合物進(jìn)行第二核酸試驗(yàn)； 測(cè)定第二混合物中第一核酸模板量的指示信號(hào)和第二混合物中第二核酸模板量的指 不?目號(hào)；和 當(dāng)?shù)诙旌衔镏械谝缓怂崃坎伙@著高于第二核酸模板量（例如至少I. 5倍、2倍、5倍、 10倍、20倍等）時(shí)，檢測(cè)到狀況。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，第二核酸試驗(yàn)是定量雜交試驗(yàn)。在一些實(shí)施方式中，進(jìn)行第二 核酸試驗(yàn)的試劑包括對(duì)第一核酸模板或其互補(bǔ)物特異性的帶標(biāo)記探針或引物。在一些實(shí)施 方式中，進(jìn)行第二核酸試驗(yàn)的試劑包括對(duì)第二核酸模板或其互補(bǔ)物特異性的帶標(biāo)記探針或 引物。在一些實(shí)施方式中，進(jìn)行第二核酸試驗(yàn)的試劑包括對(duì)第一和第二核酸模板特異性的 帶標(biāo)記探針和/或引物。
[0014] 在一些實(shí)施方式中，第一混合物還包含樣品（例如生物樣品或其它懷疑含有感興 趣核酸的樣品）。在一些實(shí)施方式中，第一混合物還包含對(duì)樣品核酸模板（例如包含于懷疑 的感興趣核酸內(nèi)的模板）特異性的一組引物。在一些實(shí)施方式中，樣品核酸模板包含遺傳 變體（例如CNV、SNP或突變）。
[0015] 還提供了在預(yù)擴(kuò)增中檢測(cè)狀況（例如異?；蛞种疲┑脑噭┖?。在一些實(shí)施方式 中，所述試劑盒包含：裝有對(duì)第一核酸模板特異性的第一組引物的第一容器；裝有對(duì)第二 核酸模板特異性的第二組引物的第二容器；和對(duì)第一核酸模板的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的第三組 引物。在一些實(shí)施方式中，第三組引物在第二容器內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，容器是孔、管、包 裝、可破裂包裝（burst pack)或被包含和確定的區(qū)域（例如在表面上干燥）。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，第一和第三組引物是不同的。在一些實(shí)施方式中，第一和第三 組引物是相同的。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還包含對(duì)第一核酸模板的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的 第一帶標(biāo)記探針。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還包含對(duì)第二核酸模板的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的 第二帶標(biāo)記探針。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還包含對(duì)第一核酸模板的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的 第一帶標(biāo)記探針，和對(duì)第二核酸模板的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的第二帶標(biāo)記探針。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，第二組引物中的至少一種引物被標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，第 三組引物中的至少一種引物被標(biāo)記。
[0018] 在一些實(shí)施方式中，該試劑盒還包含擴(kuò)增酶。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還包含第 一核酸模板和第二核酸模板，例如，在同一核酸分子（單鏈或雙鏈）或在不同核酸分子（單 鏈或雙鏈）上的第一核酸模板和第二核酸模板。在一些實(shí)施方式中，第一和第二核酸模板 在至少一個(gè)獨(dú)立容器內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，第一和第二核酸模板在第一容器內(nèi)。 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0019] 圖 1A、1B、IC 和 ID 描述了 PASIC (預(yù)擴(kuò)增加標(biāo)對(duì)照，PreAmp Spike-In Control) 技術(shù)的一些實(shí)施方式。圖IA顯示了 Cl和C2DNA模板與其各自的擴(kuò)增引物。圖IB顯示了 PASIC實(shí)施方式的示范步驟。在預(yù)擴(kuò)增混合物中加入Cl和C2模板和Cl擴(kuò)增引物，用Cl模 板進(jìn)行擴(kuò)增。下游分析是實(shí)時(shí)PCR，同時(shí)使用兩組引物。由于Cl模板經(jīng)預(yù)擴(kuò)增，Cl的定量 循環(huán)數(shù)（Cq)將在C2的Cq之前到達(dá)。圖IC顯示了可在一條核酸分子上用Cl和C2模板進(jìn) 行該技術(shù)，其中Cl和C2模板不重疊。圖ID顯示了可在一條核酸分子上用Cl和C2模板進(jìn) 行該技術(shù)，其中Cl和C2模板重疊。在上述任一個(gè)方面，當(dāng)Cl和C2模板重疊，可用插入型 染料（例如SYBR綠）或寡核苷酸探針（例如TAQMN或分子信標(biāo)探針）進(jìn)行qPCR定量檢 測(cè)。當(dāng)Cl和C2重疊時(shí)，在使用寡核苷酸探針的實(shí)施方式中，可以對(duì)Cl和C2模板使用不同 探針，或可使用同時(shí)檢測(cè)Cl和C2模板擴(kuò)增子的共同探針。
[0020] 圖2A、2B、2C、2D和2E顯示了使用PASIC擴(kuò)增TBP (TATA結(jié)合蛋白）的代表性數(shù)據(jù)。 這些圖顯示了在血液（圖2B)或巧克力提取物（圖2C)樣品上進(jìn)行的預(yù)擴(kuò)增，其水平是在 某些情況下已知抑制實(shí)時(shí)PCR(圖2C)，或在無(wú)抑制劑的對(duì)照（圖2A)上進(jìn)行的預(yù)擴(kuò)增。預(yù) 擴(kuò)增進(jìn)行10輪循環(huán)。Cql和Cq2分析顯示血液并不抑制預(yù)擴(kuò)增，因?yàn)镃q(Cq2_Cql)和沒(méi)有 抑制劑的對(duì)照一樣，為9. 6。相反，巧克力提取物顯著抑制預(yù)擴(kuò)增，其Cq是0.3。后一結(jié)果 顯示Cl模板在預(yù)擴(kuò)增中并未被顯著擴(kuò)增。圖2D和2E顯示了在血樣和無(wú)抑制劑對(duì)照中TBP 表達(dá)似乎一樣（圖2D中軌跡重疊），而巧克力提取物樣品與無(wú)抑制劑對(duì)照相比，TBP表達(dá)似 乎低得多（圖2E中對(duì)于巧克力提取物更高的Cql和Cq2)。 發(fā)明詳述 A.引g
[0021] 本文提供了測(cè)定預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)是否有效、如何有效、在特定樣品中是否存在抑制因 子的方法和組合物