一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，特別涉及一種不依賴于高能能量分子的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]1983年，Mullis等發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，30多年間，PCR技術(shù)得到長足發(fā)展，由于其在靈敏度和特異性方面的優(yōu)勢，PCR技術(shù)被迅速運(yùn)用到科學(xué)研究和臨床研究的各個(gè)方面。這種類似于DNA的天然復(fù)制過程的PCR技術(shù)，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。主要包括三個(gè)基本反應(yīng)步驟:(I)模板DNA的變性:通過加熱一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，成為單鏈；(2)模板DNA與引物的退火(復(fù)性):溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；(3)引物的延伸:DNA模板一引物結(jié)合物在72°C、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。這一技術(shù)的開發(fā)極大地促進(jìn)了生物研究的進(jìn)展。
[0003]PCR在技術(shù)應(yīng)用上也有幾點(diǎn)限制:第一，PCR技術(shù)需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室儀器，同時(shí)儀器要具備精細(xì)的溫度控制程序和加熱模板，從而實(shí)現(xiàn)很高的溫度下的DNA模板鏈的變性，較低的溫度下引物探針退火延伸模板，這樣重復(fù)溫度變化幾十個(gè)循環(huán)之后實(shí)現(xiàn)模板量的放大。由于每一個(gè)循環(huán)時(shí)間都較短，儀器必須能快速準(zhǔn)確升降溫度，這就需要銀制或金制的加熱模塊，加大儀器研制的成本。第二，PCR擴(kuò)增體系中有用的聚合酶必須具有耐受高溫的能力，否則則必須在每一個(gè)循環(huán)中重新加入新酶，以實(shí)現(xiàn)下一循環(huán)的擴(kuò)增，這樣極容易造成污染也加大了成本。第三，在PCR循環(huán)中，每一個(gè)循環(huán)引物退火的時(shí)間都很短(幾秒到十幾秒)這就要求引物必須快速找到模板上同源匹配的區(qū)段，以實(shí)現(xiàn)延伸。這就要求PCR體系必須有過量的PCR引物。過量的引物會與模板錯(cuò)配，錯(cuò)誤引發(fā)擴(kuò)增，引物二聚體等等，進(jìn)而抑制PCR擴(kuò)增，特別是在模板量低的情況，會使這種情況加劇。
[0004]與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要利用重組酶的活性，不進(jìn)行核酸解鏈和退火即可在恒溫條件下(如37°C)進(jìn)行核酸的擴(kuò)增，因此不需要昂貴的儀器，也避免了高溫對酶的損耗。同時(shí)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在體系中不需要加入過量的引物，降低了引物與模板錯(cuò)配或生成引物二聚體的可能性。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)日益受到重視。
[0005]常見的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有以下幾種:滾環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增(RCA)，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)，依賴解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增(HDA)等?，F(xiàn)有的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)體系比較復(fù)雜，同時(shí)絕大部分恒溫?cái)U(kuò)增體系要么依賴于ATP，要么依賴于肌酸激酶和磷酸肌酸，或其他高能能量分子，所需的試劑種類繁多，擴(kuò)增速度受限于能量的供給，這導(dǎo)致恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)成本比較高，限制了其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種不依賴于高能能量分子的核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑及方法。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，溶劑為水，其組成如下:
Tris-H2SO4OmM-500mM
硫酸銨0mM—250mM
乙酸鎂3mM—50mM
二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-5M
Tween200%-10%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—1mg/mL
dNTPs180uM—100uM
聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶，各適量；
重組酶為不依賴于能量分子ATP系統(tǒng)的重組酶。
[0008]優(yōu)選的，其組成如下:
Tris-H2SO41mM-150mM
硫酸銨0mM—150mM
乙酸鎂5mM—20mM
二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-2M
Tween200%-1%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—lmg/mL
dNTPs200uM—500uM
聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶，各適量。
[0009]作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，所使用的Tris-H2SOj^ pH為7?9。
[0010]作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，當(dāng)該反應(yīng)體系用于熒光定量分析時(shí)，恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑中還添加有熒光染料。熒光染料為SYBR green I，SYT0-9，SYT0-12, SYT0-60，SYT0-62, SYT0-16, SYT0-82 或 P0P0-3，T0T0-3，T0-PR0-3 中的一種。此外，在該反應(yīng)體系中使用熒光探針時(shí)，也可以實(shí)現(xiàn)熒光定量分析。
[0011]作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，重組酶選自E.coli RecT蛋白；λ ■菌體β蛋白；啤酒酵母S印I /STP β ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STP α蛋白；粟酒裂殖酵母ρ14°/Exo 蛋白以及 Rrp 1、HPP- 1、v-SEP、ICP8 蛋白。
[0012]作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑中添加有逆轉(zhuǎn)錄酶，用于檢測 RNA0
[0013]作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑擴(kuò)增后可以用凝膠電泳、試紙條檢測等方法對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
[0014]一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法，包括將引物、模板與恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合，恒溫?cái)U(kuò)增至預(yù)期量后，將恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的酶滅活，完成恒溫?cái)U(kuò)增
作為上述方法的進(jìn)一步改進(jìn)，恒溫?cái)U(kuò)增的溫度為35?42°C。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增體系，不依賴于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相對現(xiàn)有的恒溫?cái)U(kuò)增體系，其組成更為簡單，成本更為低廉，使用更為方便。
[0016]本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增體系可以對DNA和RNA序列實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，適用于復(fù)雜模板的擴(kuò)增，擴(kuò)增速度快且穩(wěn)定，可以在15 min以內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增的靈敏度和準(zhǔn)確性高，不易出現(xiàn)錯(cuò)配，擴(kuò)增效果好。
[0017]本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增體系可以用于實(shí)時(shí)定量，應(yīng)用范圍更廣。
【附圖說明】
[0018]圖1是不同實(shí)施例的恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖；
圖2是不同實(shí)施例的熒光染料恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖；
圖3是不同實(shí)施例的熒光探針恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]一種恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，溶劑為水，其組成如下:
Tris-H2SO4OmM-500mM
硫酸銨0mM—250mM
乙酸鎂3mM—50mM
二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-5M
Tween200%-10%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—1mg/mL
dNTPs180uM—100uM 聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶，各適量；
重組酶為不依賴于能量分子的重組酶。
[0020]優(yōu)選的，其組成如下:
Tris-H2SO41mM-150mM
硫酸銨0mM—150mM
乙酸鎂5mM—20mM
二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-2M
Tween200%-1%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—lmg/mL
dNTPs200uM—500uM 聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶，各適量。
[0021]更佳的，反應(yīng)體系的組成如下:
Tris-H2SO450mM—10mM
硫酸銨85mM—150mM
乙酸鎂10mM—20mM
二硫蘇糖醇
甜菜喊0M-1M
Tween200%_0.4% (質(zhì)量百分比)
PEG5%—20% (質(zhì)量百分比)
BSAOmg/mL—lmg/mL
dNTPs200uM—500uM
聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶，各適量。
[0022]TriS-H2SOj^作用在于維持一定的pH，以便酶在最適pH或較優(yōu)的pH下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。其濃度可以根據(jù)需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，所使用的Tris-H2SOja pH 為 7 ?9。
[0023]硫酸銨、乙酸鎂在于提供一定的離子強(qiáng)度，其用量可以根據(jù)核酸擴(kuò)增情況進(jìn)行一定的調(diào)整。
[0024]作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，當(dāng)該反應(yīng)體系用于熒光定量分析時(shí)，恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑中還添加有熒光染料。熒光染料為SYBR green I，SYT0-9，SYT0-12, SYT0-60，SYT0-62, SYT0-16, SYT0-82 或 P0P0-3，T0T0-3，T0-PR0-3 中的一種