一種體外套式環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法的檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的試劑及檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種體外檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的試劑及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]嗜肺軍團(tuán)菌(Leg1nella pneumophila )于1976年首次在美國被發(fā)現(xiàn)，是一種革蘭氏陰性條件致病菌，主要通過污染建筑物中的水系傳播，易大規(guī)模爆發(fā)和流行。該菌感染后發(fā)病進(jìn)程快，死亡率高。在西歐國家，每年軍團(tuán)菌的發(fā)病人數(shù)接近10萬例。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，中央空調(diào)的普遍使用，軍團(tuán)菌爆發(fā)的危險(xiǎn)性日益增加，已有多個(gè)國家將軍團(tuán)肺炎列為法定傳染病。我國衛(wèi)生部2003年頒布了《集中式空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》，目的就是為了切斷嗜肺軍團(tuán)菌的傳染源和傳播途徑。目前該菌是國境口岸微小環(huán)境重點(diǎn)關(guān)注的微生物病原體，也是衛(wèi)生檢疫在口岸衛(wèi)生監(jiān)督的重要環(huán)節(jié)，2007年曾經(jīng)在杭州機(jī)場(chǎng)口岸有報(bào)道檢出。
[0003]軍團(tuán)菌病的傳播特點(diǎn)與軍團(tuán)菌的生存方式有很大關(guān)系。在人工水體中，供水溫度較高，或者供水管道和蓄水池的管壁和池壁上形成積垢和生物膜，就會(huì)為軍團(tuán)菌的大量增殖提供適宜的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件。冷卻塔的循環(huán)水和空調(diào)的冷凝水，由于水溫較高，管道中容易藏污納垢，且容易形成死水區(qū)，為軍團(tuán)菌提供了良好的棲息和繁殖環(huán)境。空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)中軍團(tuán)菌大量繁殖容易形成微生物氣溶膠，如遇管道滲漏，冷卻塔或蒸發(fā)凝水中染有軍團(tuán)菌，送風(fēng)時(shí)，帶菌的水即被吹成細(xì)小微粒或氣溶膠。在夏秋季節(jié)，軍團(tuán)病容易發(fā)生在配備有封閉式中央空調(diào)的公共場(chǎng)所中，人群普遍易感。嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)要求苛刻，生長(zhǎng)緩慢，一般從水樣收集到培養(yǎng)鑒定需要7?10天。培養(yǎng)結(jié)果受標(biāo)本采集質(zhì)量、操作技術(shù)的影響，陽性率不一。血清免疫學(xué)方法靈敏度和特異性不高。新型等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法應(yīng)用于嗜肺軍團(tuán)菌，可對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行快速檢測(cè)，提高檢測(cè)效率，并控制在比較低的成本，并對(duì)儀器設(shè)備的要求較低，有利于在基層單位中的推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種體外套式環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法的檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的試劑，可以用于快速準(zhǔn)確地檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
它包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r，套弓丨物FNP、套引物BNP;引物基因序列如下:
外弓 I 物F3:GCTGCAACCGATGCCACA；
外引物B3: TTGGGCCAATAGGTCCGC ；
內(nèi)引物FIP:
TTGCTGTTCGGTTAAAGCCAATTGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCG；
內(nèi)引物BIP:
ACTGAAAACAAAAACAAGCCAGGCGCGTTGCTGGCTTACCAGTTT；
環(huán)引物L(fēng)oop-f: CATGCAAGACGCTATGAGTGG ；環(huán)引物L(fēng)oop-r: CGGGTTTAACACCATTTCCA ；
套引物FNP:
TTCAGCAGTACGCTTAGCCATCAAAATCAAGGCATAGATGTTAATCCG；
套引物BNP:
AAGCGGATGAAAATAAAGTAAAAGGGCCATCAATCAGACGACCAGTAT。
[0005]本發(fā)明第二個(gè)目的是提供運(yùn)用上述試劑的體外新型高效等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的方法，可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
反應(yīng)體系如下:引物混合物叫1，10\131^6^.541^，模板0嫩lyL，BstDNA聚合酶1 yL，濃度為8mol/L的甜菜堿2yL，濃度為100mmol/L的dNTP 1 yL，濃度為100mmol/L的MgSOU.2yL，Eva_greenlyL，加入滅菌去離子H20補(bǔ)足25yL混勻；各引物在引物混合物中濃度分別如下:F3、B3 各 lymol/L，F(xiàn)IP、BIP 各 15“11101/1丄00?^00?1各5411101/1，卩陬、8陬各15411101/1;
所述方法的步驟為:將陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和待測(cè)樣本分別按上述反應(yīng)體系孵育63°C40-45分鐘進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果判斷可采用以下方式:
在熒光定量PCR儀上觀察實(shí)時(shí)熒光曲線，出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線者含有嗜肺軍團(tuán)菌，結(jié)果為陽性，未出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線者，則為沒有嗜肺軍團(tuán)菌，結(jié)果為陰性;或者:
取擴(kuò)增產(chǎn)物觀察電泳結(jié)果，陽性對(duì)照孔產(chǎn)生階梯狀的條帶，陰性對(duì)照孔則沒有條帶產(chǎn)生，檢測(cè)樣本孔中如產(chǎn)生階梯狀條帶則含有嗜肺軍團(tuán)菌，反之沒有嗜肺軍團(tuán)菌。
[0006]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)依賴于4條能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，不需要熱變性的DNA作為模板，在恒溫下就可進(jìn)行高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。
[0007]本發(fā)明所提供的檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌試劑，其引物之間的關(guān)系采用本發(fā)明所提供的體外套式快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法中的方案，利用上述方案建立的套式恒溫?cái)U(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便，高效、快速、特異性高的優(yōu)點(diǎn)；該方法的建立，對(duì)樣本的檢測(cè)只需30-45分鐘左右即可完成，比加入環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時(shí)間縮短30%-50%左右，對(duì)疾病的快速診斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【附圖說明】
[0008]圖1為嗜肺軍團(tuán)菌等溫?cái)U(kuò)增的特異性試驗(yàn)產(chǎn)物電泳結(jié)果，1:marker，2:標(biāo)準(zhǔn)株33152，3-4:嗜肺軍團(tuán)菌，5:長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)株，6:大腸桿菌，7:金黃色葡萄球菌，8:沙門氏菌9:陰性對(duì)照。
[0009]圖2為嗜肺軍團(tuán)菌等溫?cái)U(kuò)增的靈敏度試驗(yàn)產(chǎn)物電泳結(jié)果，Μ為marker，2為3X106拷貝 /VL，3 為3 X 105 拷貝 /VL，4 為3 X 104 拷貝 /yL，5為3 X 103 拷貝 /yL，6為3 X 102 拷貝 /yL，7為3X 101拷貝ΛΛ，8為7為3 X 10°拷貝ΛΛ，9為陰性對(duì)照。
[0010]圖3為嗜肺軍團(tuán)菌不同方式等溫?cái)U(kuò)增比較結(jié)果，1為套式LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，2為加入環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，3為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)。
[0012]引物設(shè)計(jì)。
[0013]根據(jù)嗜肺軍團(tuán)菌mip基因的保守序列，設(shè)計(jì)一系列引物，分別是外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r，套引物FNP、套引物BNP。引物基因序列如下:
外弓 I 物F3:GCTGCAACCGATGCCACA；
外引物B3: TTGGGCCAATAGGTCCGC ；
內(nèi)引物FIP:
TTGCTGTTCGGTTAAAGCCAATTGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCG；
內(nèi)引物BIP:
ACTGAAAACAAAAACAAGCCAGGCGCGTTGCTGGCTTACCAGTTT；
環(huán)引物L(fēng)oop-f: CATGCAAGACGCTATGAGTGG ；
環(huán)引物L(fēng)oop-r: CGGGTTTAACACCATTTCCA ；
套引物FNP:
TTCAGCAGTACGCTTAGCCATCAAAATCAAGGCATAGATGTTAATCCG；
套引物BNP:
AAGCGGATGAAAATAAAGTAAAAGGGCCATCAATCAGACGACCAGTAT。
[0014]在上述引物中，外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP是常規(guī)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)的引物；
加入環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r，可使LAMP反應(yīng)中引物和核酸模板接觸的位置增加2個(gè);等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)不但能用套內(nèi)引物FNP與BNP根據(jù)核酸模板進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)也可以和外側(cè)常規(guī)LAMP引物擴(kuò)增的產(chǎn)物結(jié)合并擴(kuò)增，使和核酸模板接觸的位置又增加了 4個(gè)；
套內(nèi)引物FNP不但可以和套內(nèi)引物的BNP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)也能跟外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物BIP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增，增大了與核酸模板結(jié)合和擴(kuò)增的機(jī)會(huì)，反之，套內(nèi)引物BNP也可以和套內(nèi)引物的FNP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)也能跟外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物FIP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；
利用上述引物對(duì)目的基因進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，常規(guī)LAMP反應(yīng)和加入環(huán)引物的LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物只有1種產(chǎn)物的循環(huán)序列，加入環(huán)引物不改變產(chǎn)物的序列；在加入套內(nèi)引物后，產(chǎn)物就是4種擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)序列，即內(nèi)引物FIP、BIP的擴(kuò)增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP、BNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，內(nèi)引物FIP和套內(nèi)引物BNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP和內(nèi)引物BIP的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[001