一種新布尼亞病毒的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種針對(duì)新布尼亞病毒核酸的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)，適合對(duì)新布尼 亞病毒的定性檢測(cè)。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 新布尼亞病毒是發(fā)熱伴血小板減少綜合征的重要病原體，其主要通過(guò)蜱蟲(chóng)叮咬傳 播。電鏡下病毒顆粒呈球形或橢圓形，直徑約80nm?100nm，其基因組由大（L)、中（M)、小 (S) 3個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成。病人感染新布尼亞病毒后引起發(fā)熱伴血小板減少綜合征， 主要表現(xiàn)為急性起病、發(fā)熱、惡心、腹瀉、乏力、全身不適、嘔吐、肌肉酸痛等，可因多器官功 能衰竭死亡。新布尼亞病毒可以通過(guò)蜱蟲(chóng)叮咬傳播，也可通過(guò)接觸病人血液等傳播。新布 尼亞病毒感染需要實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)加以確診，因此建立快速、準(zhǔn)確的診斷方法十分重要。目 前新型布尼亞病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)主要基于針對(duì)病毒RNA的核酸檢測(cè)技術(shù)（如熒光定量 PCR等技術(shù)），但由于需要昂貴的熒光定量PCR儀，使得難以廣泛使用。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是繼 PCR技術(shù)后近年發(fā)展起來(lái)的一種新的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，本發(fā)明技術(shù)研制了恒溫?cái)U(kuò)增新布 尼亞病毒核酸，并結(jié)合核酸試紙條顯色來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果，且整個(gè)反應(yīng)過(guò)程不打開(kāi)反應(yīng)管蓋 子，試紙條流動(dòng)檢測(cè)過(guò)程密閉，杜絕了核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染外界的可能性。本發(fā)明研發(fā)的新布 尼亞病毒核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間短、反應(yīng)靈敏、方法特異，為新 布尼亞病毒檢測(cè)提供了一種可靠的快速檢測(cè)方法。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測(cè)新布尼亞病毒核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢 測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0004] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0005] 本發(fā)明提供一種新布尼亞病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒組成包括：
[0006] (I) RNA提取液，優(yōu)選德國(guó)QIAGEN RNA提取試劑盒（Qia-74104);
[0007] (2)恒溫PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，包括：正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交 叉擴(kuò)增引物、IXThermol buffer、MgS04、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無(wú)菌 雙蒸水；其中：
[0008] 所述正向外圍引物為：5' -TTGCTGCTTACAGGTTCCTG-3';
[0009] 反向外圍引物為：5，-GAGGAGCCAGCAAGACAGA-3，；
[0010] 所述兩條探針的序列分別為：
[0011] 正向5'端Biotin標(biāo)記探針
[0012] 5， -Biotin-GTCCCCAGCAGAGCTGCTGAG-3，；
[0013] 反向3'端Fitc標(biāo)記探針
[0014] 5' -Fitc-GGGAAGAAGACAGAGTTCACAG-Sr ；
[0015] 所述兩條擴(kuò)增交叉引物分別為：
[0016] 擴(kuò)增正向引物：
[0017] 5' -AGGGAATCCTTGGCCCAGATGTAAGCAGCGGCAGCAAC-3';擴(kuò)增反向引物：
[0018] 5r -TGGCCTTCAGCCACTTCACCTCAGGGATCCTCTCCATGC-3r ；
[0019] (3)陽(yáng)性對(duì)照：含有新布尼亞病毒的S基因片段的DNA質(zhì)粒；
[0020] ⑷陰性對(duì)照：無(wú)菌雙蒸水。
[0021] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述的 I X Thermol buffer 組成為：20mM 的 Tris-HCl、IOmM 的 KClUOmM 的（NH4)2S04、2mM 的 MgSO4以及質(zhì)量濃度為 0· 1% 的 Triton X-100, pH 8. 8。
[0022] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽(yáng)性對(duì)照為含有長(zhǎng)189bp的新布尼亞病毒S片段基因序列，序 列如（SEQ ID NO. 1):
[0023] TTGCTGCTTACAGGTTTCTGTAAGCAGCAGCAGCAACCTCA GCAGCTCTGCTGGGGACCCCATCTGGG CCAAGGATCCCCTTGGCCTTCAGCCACTTCACCCGAACATCATTGGGAAAGAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAG AGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACCTCTGTCTTGCTGGCTCCTC。
[0024] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽(yáng)性對(duì)照按如下步驟制備：
[0025] 以包含擴(kuò)增區(qū)域的新布尼亞病毒S基因片段（即SEQ ID NO. 1所示）為模板，通過(guò) 兩條外圍引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； 將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)T-easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒構(gòu)建完整的含有目的基因的質(zhì)粒序列， 用分光光度計(jì)對(duì)所抽提的質(zhì)粒測(cè)A 28tl定量并稀釋至10個(gè)拷貝/ μ 1，獲得陽(yáng)性對(duì)照，-20°C保 存。
[0026] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述恒溫PCR擴(kuò)增反應(yīng)液組成為：兩條外圍引物各自15pmol，兩條 探針各自 20pmol，兩條交叉引物各自 30pmol，lXThermol buffer，MgS04S6mmol，dNTPsS 液各〇. 4mmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U，無(wú)菌雙蒸水組成補(bǔ)足至25 μ 1。
[0027] 本發(fā)明還提供一種所述新布尼亞病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，所述應(yīng)用為：
[0028] a)用試劑盒中RNA提取試劑從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取RNA ;
[0029] b)將步驟a)提取得到的RNA作為模板加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在 60°C下擴(kuò)增反應(yīng)35分鐘；將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板（即陽(yáng)性對(duì)照）加入陽(yáng)性對(duì)照PCR管中，將標(biāo)準(zhǔn) 陰性模板（即陰性對(duì)照）加入陰性對(duì)照PCR管中，所述陽(yáng)性對(duì)照模板為含有新布尼亞病毒 的S基因片段的質(zhì)粒，所述陰性對(duì)照模板為無(wú)菌雙蒸水；
[0030] C)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸試紙條防污染檢測(cè)裝置（杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公 司3號(hào)裝置）中進(jìn)行檢測(cè)（也可以采用其它核酸試紙條進(jìn)行檢測(cè)），2分鐘以后判讀結(jié)果， 當(dāng)試紙條的檢測(cè)線呈陽(yáng)性時(shí)，說(shuō)明樣品中含有新布尼亞病毒核酸。本發(fā)明所述核酸試紙條 防污染檢測(cè)裝置中試紙條包括在帶有不干膠的襯墊上按順序設(shè)有樣品墊（即圖1中玻纖）、 有色顆粒結(jié)合物墊（即圖1中乳膠）、纖維膜和吸水濾紙墊，上述各部分在相鄰處部分重疊， 纖維膜上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其中有色顆粒結(jié)合物墊上的有色顆粒有抗Fitc抗體包被， 檢測(cè)線上有親和素包被，質(zhì)控線上有抗Fitc抗體，有色顆粒選自膠體金顆粒、乳膠顆粒。2 分鐘以后判讀結(jié)果，當(dāng)試紙條的檢測(cè)線呈陽(yáng)性時(shí)，說(shuō)明樣品中含有新布尼亞病毒核酸。
[0031] 在本發(fā)明提供的試劑盒中，有兩條外圍引物，兩條交叉引物和兩條檢測(cè)探針。RNA 由逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，本試劑盒中的6條寡聚核苷酸序列依靠 Bst DNA聚合酶的高 活性的鏈置換特性，使得鏈置換DNA合成不斷的自我擴(kuò)增循環(huán)。在本發(fā)明提供的新布尼亞 病毒核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中，對(duì)不同的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，如引物和探針的濃度， Mg2+濃度，反應(yīng)溫度等的優(yōu)化，并將本發(fā)明與核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，建立了新布 尼亞病毒核酸恒溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)的方法。該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出100 個(gè)拷貝，可以滿足快速檢測(cè)新布尼亞病毒的要求。
[0032] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0033] (1)本發(fā)明所述新布尼亞病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的特異性好，靈敏度高，步驟簡(jiǎn) 單，可重復(fù)性高；
[0034] (2)反應(yīng)速度快，單個(gè)樣本從樣本處理到完成檢測(cè)，僅需1小時(shí)左右；
[0035] (3)整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)過(guò)程中不需要打開(kāi)PCR管蓋，減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)；整 個(gè)反應(yīng)過(guò)程不需要復(fù)雜的儀器。 (四）
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1為核酸檢測(cè)試紙條原理示意圖。
[0037] 圖2為本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)新布尼亞病毒的特異性，1-4依次為登革熱病毒；基 孔肯雅熱病毒；西尼羅熱病毒；陽(yáng)性對(duì)照（1〇 3拷貝/反應(yīng)）。
[0038] 圖3為本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)新布尼亞病毒的靈敏度，1-5依次為空白對(duì)照、IO1 拷貝/微升、IO2拷貝/微升、10 3拷貝/微升、10 4拷貝/微升。 (五）
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0040] 實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的組成與配制
[0041] a)RNA提取試劑：德國(guó)QIAGEN RNA提取試劑盒（Qia-74104);
[0042] b)新布尼亞病毒核酸恒溫PCR擴(kuò)增反應(yīng)液：兩條外圍引物（15pmol)，兩條探針 (20pmol)和兩條交叉引物（30pmol)，lXThermolbuffer，MgS0 4(6mmol)，dNTPs 溶液（各 0. 4mmol)，Bst DNA聚合酶（8U)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（5U)和無(wú)菌雙蒸水組