本發(fā)明屬于生物化工領域，具體地說，涉及生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸酯富集的耦合工藝。

背景技術：

多元不飽和脂肪酸(PUFAs)是指分子中含有多于一個雙鍵的長鏈脂肪酸，屬于人體必需的脂肪酸，需從食物中攝取。根據PUFA雙鍵位置，將其分為ω-3和ω-6系列，從脂肪酸分子中距離羧基最遠的甲基段的碳原子計數，第一個雙鍵出現在第三和第四個碳原子之間的稱為ω-3PUFA，如α-亞麻酸(C18:3)、二十二碳六烯酸(DHA，C22:6)、二十碳五烯酸(EPA，C20:5)等；第一個雙鍵出現在第六和第七個碳原子之間的稱為ω-6PUFA，如亞油酸(C18:2)和花生四烯酸(C20:4)等。

研究發(fā)現，很多ω-3PUFAs是具有多種生理活性的功能因子，因此被廣泛應用于各領域。然而，大多數ω-3PUFA來源于深海魚油，但含量比較低，目前ω-3PUFAs的分離方法主要集中在尿素包合法、分子蒸餾、陰離子絡合法、超臨界萃取、高效液相色譜法、生物酶法等幾種方法。其中尿素包合法較為常用，在有機溶劑中尿素可以與直鏈飽和脂肪酸形成尿素包合復合物在低溫下結晶析出，但該過程需要使用大量有機溶劑，增添了后續(xù)提純步驟；分子蒸餾可在低溫下汽化待分離物，嚴格控制溫度得到不同溫度的餾分，可得到較高的ω-3PUFAs，但該過程能耗大；陰離子絡合法中硝酸銀陰離子可與ω-3PUFAs絡合，產物親水性強，因此ω-3PUFAs可以以陰離子絡合物的形式進入水相，從而實現分離，但硝酸銀價格昂貴，故僅限于實驗室小量制備；利用超臨界CO₂萃取具有ω-3PUFA不發(fā)生氧化等優(yōu)點，但對設備的要求比較高?？傊?，以上采用物理或者化學的方法富集ω-3PUFA存在選擇性差、過程能耗高等問題，迫切需要開發(fā)具有高度選擇性的環(huán)境友好的生物酶法工藝進行ω-3PUFAs的富集。但目前關于酶法工藝富集多元不飽和脂肪酸的工藝繁瑣，成本高，選擇性差，工業(yè)化應用前景不明朗。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸酯富集的耦合工藝。

為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸酯富集的耦合工藝，包括以下步驟：

S1、將油脂、短鏈醇、水和液體脂肪酶在一級或多級酶反應器中進行反應，反應結束后，將所得反應液分成重相和輕相；

S2、將S1中的輕相轉移至蒸餾塔內進行蒸餾，分離出碳鏈長度為C14-C18的脂肪酸酯，用作生物柴油，塔釜液用于進一步轉化；

S3、將S2中的塔釜液流入裝有固定化脂肪酶的一級或多級酶反應器中，并加入短鏈醇進行反應，得到碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸酯。

其中，S1具體為：向一級或多級酶反應器中加入油脂、油脂摩爾數4-8倍的短鏈醇、油脂質量2％-20％的水以及基于油脂質量200-2000個標準酶活單位的液體脂肪酶，于30℃-55℃反應3-8小時，反應結束后，所得反應液經離心或靜置分層，得到重相和輕相。

S3具體為：將塔釜液和基于油脂摩爾數1-3倍的短鏈醇流入裝有基于油脂質量200-1000個酶活單位的固定化脂肪酶的一級或多級酶反應器中，于20℃-55℃反應3-10小時。

前述的工藝，在反應全過程或部分反應步驟中采用在線脫水。例如，可用膜進行在線脫水，所用的膜包括有機膜、無機膜或陶瓷膜；可用分子篩進行在線脫水，所用的分子篩為或分子篩；可用低溫短鏈醇進行在線脫水，即反應器一側直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應器的另一側與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。

前述的工藝，S1還包括回收再利用重相中脂肪酶的步驟。可以用膜分離回收重相中的脂肪酶，所用的膜包括金屬膜、有機膜、無機膜或陶瓷膜等。

本發(fā)明中使用的脂肪酶包括來源于酵母、霉菌、細菌或其它微生物的脂肪酶；脂肪酶為單種脂肪酶或多種脂肪酶的組合；優(yōu)選地，所述脂肪酶選自由南極假絲酵母(Candida antarctica)、嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)和米根霉(Rhizopus oryzae)所產生的脂肪酶中的至少一種。

本發(fā)明中使用的油脂為含有多元不飽和脂肪酸的生物油脂，包括植物油脂、動物油脂、廢食用油、酸化油、油脂精練下腳料和微生物油脂，優(yōu)選魚油和/或微藻油脂等。所述多元不飽和脂肪酸是指分子中含有多于一個雙鍵的長鏈脂肪酸，包括但不限于α-亞麻酸(C18:3)、二十二碳六烯酸(C22:6)、二十碳五烯酸(C20:5)，花生四烯酸(C20:4)等。

本發(fā)明中使用的短鏈醇包括甲醇、乙醇、丙醇或丁醇等。所述短鏈醇為勻速或變速添加，從反應初始計時，3-8小時內流加完畢。

本發(fā)明提供的生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸酯富集的耦合工藝，在液體酶催化的前段反應過程中，無需對油脂原料進行任何的預處理，即可使脂肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂有效轉化為對應的脂肪酸酯(轉化率達到90％以上)；進而通過蒸餾將C14-C18脂肪酸酯分離，余下的塔釜液進而用于第二階段的固定化脂肪酶催化，通過在全過程或部分反應過程中引入在線脫水，可以將C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂有效轉化為對應的脂肪酸酯，轉化率達到98％以上。本工藝具有油脂原料適用性強，過程環(huán)保清潔，產品得率高等優(yōu)點。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

在本工藝的第一階段，將C14-C18的油脂有效轉化為對應的脂肪酸酯，產生的副產物甘油在水相(重相)中，油相(輕相)進而通過蒸餾除去C14-C18脂肪酸酯，余下的塔釜液主要為含多元不飽和脂肪酸的油脂，這樣過程不僅有效減少了副產物甘油對后續(xù)固酶反應的負面影響；同時，經過中間的蒸餾分離，還大大降低了產物(脂肪酸酯)對酶促反應的抑制，從而可以促進含多元不飽和脂肪酸油脂的徹底轉化，顯著提高了多元不飽和脂肪酸的轉化效果。該工藝可以適用于各種各樣的油脂，后續(xù)產品的分離純化方便易行，能實現生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸富集酯的高效耦合，具有非常好的工業(yè)化應用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸酯富集的耦合工藝流程圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實施例1

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸、基于油脂質量10％的水以及基于單位油脂質量200個標準酶活(200U/g大豆油)的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為4.5：1的乙醇在3個小時內勻速加入。反應6小時后，脂肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為92％)，然后對反應液進行分相，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數1倍的甲醇，進行反應，控溫20℃，甲醇在1小時內勻速加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(采用包括有機膜、無機膜或陶瓷膜在內的膜脫水裝置以及包括或分子篩在內的吸水裝置)。反應4小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98.5％。

實施例2

將10g C.vulgaris微藻油脂(含有二十碳五烯酸)，基于油脂質量5％的水以及入基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的甲醇在4個小時內勻速加入。反應8小時后，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸甲酯(轉化率為93％)。然后對反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數2倍的甲醇，進行反應?？販?0℃，甲醇在1小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括有機膜的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為99％。

實施例3

將10g魚油(含有花生四烯酸，C20:4)基于油脂質量2％的水以及基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液體脂肪酶以及基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在2個小時內勻速加入。反應5小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為93％)，然后對反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的無機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數1倍的乙醇，進行反應。控溫20℃，乙醇在1小時內勻速加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水即反應器一側直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應器的另一側與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸乙酯的轉化率為98％。

實施例4

將10g魚油、基于油脂質量3％的水以及基于單位油脂質量100個標準酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶以及基于單位油脂質量300個標準酶活的來源于嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為4：1的甲醇在2個小時內勻速加入。反應5小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸甲酯(轉化率為92％)。然后對反應液進行靜置分相，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的陶瓷膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數2倍的甲醇，進行反應?？販?5℃，甲醇在1小時內勻速加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括陶瓷膜的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98％。

實施例5

將10g T.fluviatilis微藻油脂(含有花生四烯酸和二十碳五烯酸)、基于油脂質量8％的水以及基于單位油脂質量800個標準酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在2個小時內勻速加入。反應5小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為93％)。然后對反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為95％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的固定化脂肪酶以及基于單位油脂質量50個標準酶活的來源于南極假絲酵母的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數1倍的甲醇，進行反應?？販?0℃，甲醇在1小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水，即反應器一側直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應器的另一側與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。反應4小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸乙酯的轉化率為98％。

實施例6

將10g T.pseudonana微藻油脂(含有二十二碳六烯酸(DHA，二十碳五烯酸和花生四烯酸)、基于油脂質量20％的水以及基于單位油脂質量500個標準酶活的來源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在3個小時內勻速加入。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為92％)，然后對反應液進行離心分離。分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的無機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器器(裝有基于單位油脂質量400個標準酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數1.5倍的甲醇，進行反應。控溫25℃，甲醇在1小時內勻速加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括分子篩在內的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98.5％。

實施例7

將10g T.fluviatilis微藻油脂(含有花生四烯酸和二十碳五烯酸)、基于油脂質量6％的水以及基于單位油脂質量500個標準酶活的來源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中。控溫35℃，然后將基于油脂摩爾比為5：1的乙醇在4個小時內勻速加入。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為93％)。然后對反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的陶瓷膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為95％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量100個標準酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶以及基于單位油脂質量100個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數1倍的乙醇，進行反應?？販?5℃，乙醇在2小時內勻速加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(采用包括有機膜、無機膜或陶瓷膜在內的膜脫水裝置以及包括或分子篩在內的吸水裝置)。反應4小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸乙酯的轉化率為99％。

實施例8

將10g Chlorella vulgaris微藻油脂(含有DHA，二十二碳六烯酸)、基于油脂質量3％的水以及基于單位油脂質量500個標準酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為5：1的丙醇在3個小時內勻速加入。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸丙酯(轉化率為92％)，然后對反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸丙酯(丙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量500個標準酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數2倍的甲醇，進行反應?？販?5℃，甲醇在1小時內勻速加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括有機膜的膜脫水裝置以及包括分子篩在內的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98.5％。

實施例9

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質量8％的水以及基于單位油脂質量800個標準酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中。控溫45℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在3個小時內勻速加入。反應6小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為92％)，然后對反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數1倍的甲醇，進行反應?？販?0℃，甲醇在2小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括無機膜的膜脫水裝置以及包括分子篩在內的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98％。

實施例10

將10g C.vulgaris微藻油脂(含有二十碳五烯酸)、基于油脂質量12％的水以及基于單位油脂質量2000個標準酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為5：1的甲醇在2個小時內勻速加入。反應5小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸甲酯(轉化率為92％)，然后對反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的無機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數2倍的乙醇，進行反應。控溫30℃，乙醇在2小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水，即反應器一側直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應器的另一側與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。反應4小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸乙酯的轉化率為98.5％。

實施例11

將10g魚油(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質量6％的水以及基于單位油脂質量1000個標準酶活的來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中。控溫40℃，然后將基于油脂摩爾比為5：1的乙醇在3個小時內勻速加入。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為92％)，然后對反應液進行靜置或離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的陶瓷膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量100個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶以及基于單位油脂200個標準酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數2倍的甲醇，進行反應?？販?5℃，甲醇在1小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括有機膜的膜脫水裝置以及包括分子篩在內的吸水裝置)。反應4小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98.5％。

實施例12

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質量12％的水以及基于單位油脂質量600個標準酶活的來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的甲醇在3個小時內勻速加入。反應6小時，有效油脂到生物柴油的轉化率為92％，然后將反應液進行靜置或離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率為95％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于米黑根毛霉Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數2倍的甲醇，進行反應。控溫20℃，甲醇在2小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水，即反應器一側直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應器的另一側與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。反應4小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98％。

實施例13

將10g Chlorella vulgaris微藻油脂(含有DHA，二十二碳六烯酸)、基于油脂質量8％的水以及基于單位油脂質量500個標準酶活的來源于嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中。控溫45℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在4個小時內勻速加入。反應6個小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為92％)，然后將反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數1倍的乙醇進行反應。控溫25℃，乙醇在1小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括陶瓷膜的膜脫水裝置以及包括分子篩在內的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸乙酯的轉化率為98.5％。

實施例14

將10g T.pseudonana微藻油脂(含有二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸)、基于油脂質量5％的水以及基于單位油脂質量500個標準酶活的來源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在4個小時內勻速加入。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為92％)。反應結束后，進行靜置或離心分離。分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的無機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有單位油脂質量100個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶以及基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于米黑根毛霉Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數1倍的甲醇，進行反應?？販?5℃，甲醇在1小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括有機膜或無機膜陶瓷膜在內的膜脫水裝置以及包括分子篩在內的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98％。

實施例15

將10g T.fluviatilis微藻油脂(含有花生四烯酸和二十碳五烯酸)、基于油脂質量5％的水以及基于單位油脂質量500個標準酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇變速加入。30％的乙醇在反應前2小時勻速加完，剩下的70％的乙醇在隨后2個小時內勻速加完。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為92％)。然后將反應液進行靜置，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為95％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數1倍的甲醇，進行反應?？販?5℃，甲醇在1小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括有機膜或陶瓷膜在內的膜脫水裝置以及包括分子篩在內的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98.5％。

實施例16

將10g Chlorella vulgaris微藻油脂(含有DHA，二十二碳六烯酸)、基于油脂質量5％的水以及基于單位油脂質量800個標準酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇變速加入。40％的乙醇在反應前2小時勻速加完，剩下的60％的乙醇在隨后2個小時內勻速加完。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為92％)。然后對反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的陶瓷膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量100個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶以及基于單位油脂質量100個標準酶活的來源于米黑根毛霉Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數1倍的甲醇，進行反應?？販?5℃，甲醇在1小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括無機膜或陶瓷膜在內的膜脫水裝置以及包括分子篩在內的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98.5％。

實施例17

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質量5％的水以及基于單位油脂質量800個標準酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中。控溫50℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的丙醇變速加入。40％的丙醇在反應前2小時勻速加完，剩下的60％的丙醇在隨后2個小時內勻速加完。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸丙酯(轉化率為92％)。然后對反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的陶瓷膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸丙酯(丙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數3倍的甲醇，進行反應?？販?5℃，甲醇在2小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括有機膜或無機膜在內的膜脫水裝置以及包括分子篩在內的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98.5％。

實施例18

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質量10％的水以及基于單位油脂質量800個標準酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?0℃，然后加入基于油脂摩爾比為6：1的丁醇變速加入，30％的丁醇在反應前2小時勻速加完，剩下的70％的丁醇在隨后2個小時內勻速加完。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸丁酯(轉化率為92％)。然后將反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸丁酯(丁酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量200個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數3倍的甲醇，進行反應?？販?5℃，甲醇在2小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括有機膜或陶瓷膜在內的膜脫水裝置以及包括分子篩在內的吸水裝置)。反應3小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98.5％。

實施例19

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質量5％的水以及基于單位油脂質量800個標準酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中?？販?5℃，然后加入基于油脂摩爾比為3：1的乙醇。乙醇變速加入，40％的乙醇在反應前2小時勻速加完，剩下的60％的乙醇在隨后2個小時內勻速加完。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為93％)。然后將反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的無機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。分離出的重相經膜回收脂肪酶，以供重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量400個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數2倍的甲醇，進行反應。控溫55℃，甲醇在1小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水，即反應器一側直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應器的另一側與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。反應3小時，鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為98.5％。

實施例20

將10g魚油、基于油脂質量20％的水以及基于單位油脂質量300個標準酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶和基于單位油脂質量600個標準酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級或多級酶反應器中。控溫50℃，然后加入基于油脂摩爾比為5：1的乙醇，乙醇變速加入。40％的乙醇在反應前2小時勻速加完，剩下的60％的乙醇在隨后2個小時內勻速加完。反應8小時，肪酸碳鏈長度為C14-C18的油脂轉化為對應的脂肪酸乙酯(轉化率為92％)。然后將反應液進行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機膜進行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達95％，回收的酶液中副產物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復使用。輕相經過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為95％)，余下塔釜液進而裝入第二階段的固酶反應器(裝有基于單位油脂質量100個標準酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶和裝有基于單位油脂質量900個標準酶活的來源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同時加入基于油脂摩爾數2倍的甲醇，進行反應?？販?0℃，甲醇在1小時內加完。在該反應過程中，進行如圖1所示的在線脫水(包括有機膜、無機膜或陶瓷膜在內的膜脫水裝置以及包括或分子篩在內的吸水裝置)。反應2小時，體系中碳鏈長度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對應脂肪酸甲酯的轉化率為99％。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。