本發(fā)明涉及生物熒光探針領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺雙靶點(diǎn)熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銅和鐵是人類(lèi)生產(chǎn)生活中被廣泛使用的金屬，兩者作為過(guò)渡元素具有顯著的生物相關(guān)性。它們常常作為輔酶或其他輔助因子參與生物體的生長(zhǎng)代謝。過(guò)量的Cu²⁺和Fe³⁺會(huì)引起機(jī)體代謝障礙及其他嚴(yán)重疫病。Cu²⁺和Fe³⁺引起的代謝障礙疾病主要包括器官功能紊亂或者神經(jīng)退行性疾病。因此對(duì)于過(guò)渡金屬的檢測(cè)十分重要。

熒光檢測(cè)具有高靈敏度、高選擇性、操作簡(jiǎn)易、快速響應(yīng)等優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞熒光成像作為生物和藥物科學(xué)領(lǐng)域里一種高效的探測(cè)手段備受關(guān)注。而用于細(xì)胞成像的熒光物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)有良好的水溶性、高亮度、光穩(wěn)定性和低毒性。熒光小分子由于其良好的生物相容性、優(yōu)越的光物理特性被應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)成像檢測(cè)。喹啉是一個(gè)大的共軛體系，可以很容易地產(chǎn)生π到π*的電子躍遷，喹啉基衍生物不僅具有較強(qiáng)的熒光，而且其雜環(huán)氮原子能參與配位，即同時(shí)具有識(shí)別和熒光功能。近年來(lái)基于喹啉骨架特異性識(shí)別Zn²⁺，Ag⁺，F(xiàn)e³⁺，Cu²⁺等離子的小分子熒光探針被廣泛報(bào)道。然而，同時(shí)識(shí)別雙靶點(diǎn)或多靶點(diǎn)的熒光探針被較少報(bào)道。雙靶點(diǎn)熒光探針具有高效、低成本、操作簡(jiǎn)易的優(yōu)勢(shì)，因此，設(shè)計(jì)一種能夠同時(shí)識(shí)別雙靶點(diǎn)、生物相容性好的熒光探針顯得日益重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺雙靶點(diǎn)熒光探針，以及提供該雙靶點(diǎn)熒光探針的制備方法和其在細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一方面是提供一種基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺雙靶點(diǎn)熒光探針(以下簡(jiǎn)稱(chēng)QLBM)，該雙靶點(diǎn)熒光探針具有式I所示的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明的第二方面是提供該雙靶點(diǎn)熒光探針的制備方法，該方法包括：

(i)在第一有機(jī)溶劑存在下，使喹哪啶酸與草酰氯反應(yīng)，得到式II所示化合物；

(ii)在第二有機(jī)溶劑存在下，使式II所示化合物與2-氨基苯并咪唑反應(yīng)，得到式I所示化合物。

本發(fā)明的第三方面是提供該雙靶點(diǎn)熒光探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

本發(fā)明的效果表現(xiàn)在：

(1)QLBM對(duì)Cu²⁺和Fe³⁺的識(shí)別具有高靈敏度和高選擇性。

(2)該探針的反應(yīng)體系為純水相。

(3)首次提出利用抗壞血酸對(duì)Cu²⁺和Fe³⁺進(jìn)行區(qū)分。

(4)利用質(zhì)譜、DFT分析了其作用機(jī)制，并將其作為Cu²⁺和Fe³⁺雙靶點(diǎn)探針應(yīng)用于細(xì)胞成像。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

通過(guò)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述，本發(fā)明的上述以及其它目的、特征和優(yōu)勢(shì)將變得更加明顯。

圖1為本發(fā)明雙靶點(diǎn)熒光探針的氫譜。

圖2為本發(fā)明雙靶點(diǎn)熒光探針的碳譜。

圖3為本發(fā)明雙靶點(diǎn)熒光探針的紫外吸收譜圖。

圖4(a)示出了將200μM的不同金屬離子加入QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液后的熒光發(fā)射譜圖；圖4(b)示出了將200μM的不同金屬離子加入QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液后紫外光下的顏色圖。圖4(c)和圖4(d)分別示出了QLBM(20μM)在Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中與Cu²⁺(200μM)，F(xiàn)e³⁺(200μM)和其他金屬離子(500μM)的熒光發(fā)射譜圖。黑條代表其他競(jìng)爭(zhēng)金屬離子。紅條代表在加入競(jìng)爭(zhēng)金屬離子后加入Cu²⁺(200μM)和Fe³⁺(200μM)。

圖5(a)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中不斷滴加Cu²⁺的熒光發(fā)射譜圖。圖5(b)示出了在QLBM(20μM)在Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中不斷滴加Cu²⁺在508nm處的熒光值與Cu²⁺滴加濃度的滴定曲線(xiàn)。內(nèi)部曲線(xiàn)為QLBM熒光值與Cu²⁺離子濃度的線(xiàn)性區(qū)間曲線(xiàn)。圖5(c)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中不斷滴加Fe³⁺的熒光發(fā)射譜圖。圖5(d)示出了在QLBM(20μM)在Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中不斷滴加Fe³⁺在508nm處的熒光值與Fe³⁺滴加濃度的滴定曲線(xiàn)。內(nèi)部曲線(xiàn)為QLBM熒光值與Fe³⁺離子濃度的線(xiàn)性區(qū)間曲線(xiàn)。

圖6(a)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中加入Fe³⁺(200μM)離子后，又加入抗壞血酸(500μM)后的熒光發(fā)射譜圖變化。圖6(b)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中加入Cu²⁺(200μM)離子后，又加入抗壞血酸(500μM)后的熒光發(fā)射譜圖變化。圖6(c)示出了在包含Cu²⁺(200μM)和Fe³⁺(200μM)的QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中加入抗壞血酸(500μM)后最大發(fā)射波長(zhǎng)處(508nm)時(shí)間梯度的熒光值變化。圖6(d)示出了在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液中加入Cu²⁺(200μM)和Fe³⁺(200μM)后加入抗壞血酸(500μM)紫外燈照射下的顏色變化。

圖7示出了QLBM-CuCl₂與2當(dāng)量QLBM-FeCl₃的質(zhì)譜結(jié)果。

圖8(a)、圖8(b)、圖8(c)分別示出了DFT計(jì)算分析的QLBM、QLBM-Cu²⁺和QLBM-Fe³⁺的最優(yōu)化結(jié)構(gòu)。

圖9示出了不同濃度QLBM的細(xì)胞毒性。

圖10(a)為HeLa細(xì)胞與20μM QLBM共孵育6h后的共聚焦顯微鏡成像。圖10(b)為HeLa細(xì)胞與20μM QLBM共孵育6h后，加入200μM Cu²⁺孵育30min的共聚焦顯微鏡成像。圖10(c)為HeLa細(xì)胞與20μM QLBM共孵育6h后，加入200μM Fe³⁺孵育30min的共聚焦顯微鏡成像。標(biāo)尺：50μm。

具體實(shí)施方式

下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

本發(fā)明提供一種基于喹啉骨架的Cu²⁺和Fe³⁺雙靶點(diǎn)熒光探針，該雙靶點(diǎn)熒光探針具有式I所示的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明提供上述雙靶點(diǎn)熒光探針的制備方法，該方法包括：

(i)在第一有機(jī)溶劑存在下，使喹哪啶酸與草酰氯反應(yīng)，得到式II所示化合物；

(ii)在第二有機(jī)溶劑存在下，使式II所示化合物與2-氨基苯并咪唑反應(yīng)，得到式I所示化合物。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，步驟(i)中，喹哪啶酸與草酰氯的摩爾比為1：5-20。

步驟(i)中的所述第一有機(jī)溶劑可以為本領(lǐng)域常規(guī)的非質(zhì)子有機(jī)溶劑，優(yōu)選為二氯甲烷、甲苯和正己烷中的至少一種。進(jìn)一步優(yōu)選地，上述有機(jī)溶劑為干燥處理后的有機(jī)溶劑。

具體地，步驟(i)可包括：

將溶解在第一有機(jī)溶劑中的草酰氯滴加到喹哪啶酸溶液中，混合均勻后，在惰性氣體存在下，蒸餾攪拌反應(yīng)。

其中，所述喹哪啶酸溶液優(yōu)選為喹哪啶酸溶解于第一有機(jī)溶劑中形成的溶液，喹哪啶酸溶液的濃度可以根據(jù)需要確定。

所述滴加優(yōu)選在低溫下進(jìn)行，例如冰浴條件。

所述惰性氣體例如可以為氮?dú)狻?/p>

步驟(i)還可以包括常規(guī)的后處理步驟，例如冷卻、旋蒸溶劑等。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(ii)中，式II所示化合物與2-氨基苯并咪唑的摩爾比優(yōu)選為1：1-2。

步驟(ii)中的所述第二有機(jī)溶劑可以為本領(lǐng)域常規(guī)的非質(zhì)子有機(jī)溶劑，優(yōu)選為二氯甲烷、甲苯和正己烷中的至少一種。進(jìn)一步優(yōu)選地，上述有機(jī)溶劑為干燥處理后的有機(jī)溶劑。

優(yōu)選地，步驟(ii)包括：向反應(yīng)體系中加入縛酸劑。所述縛酸劑例如可以為三甲胺或三乙胺。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(ii)的反應(yīng)條件優(yōu)選包括：溫度為-4至5℃，時(shí)間為2-10h。

步驟(ii)還可以包括常規(guī)的后處理步驟，例如冷卻、旋蒸溶劑、柱層析等。

本發(fā)明還提供上述的雙靶點(diǎn)熒光探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施方式，通過(guò)兩步反應(yīng)設(shè)計(jì)合成了熒光探針QLBM，合成過(guò)程如下式所示：

合成方法：將喹哪啶酸溶于干燥的二氯甲烷中，然后將草酰氯溶解在干燥二氯甲烷中，在冰浴條件和磁力攪拌下，將草酰氯溶液滴加于喹哪啶酸溶液中，之后在氮?dú)猸h(huán)境下蒸餾反應(yīng)。隨后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)物喹哪啶酰氯(簡(jiǎn)稱(chēng)為C2)。然后將得到的產(chǎn)物C2與2-氨基苯并咪唑加入到干燥的二氯甲烷與三甲胺的混合溶液中，攪拌反應(yīng)，旋蒸除去溶劑，并通過(guò)硅膠柱層析分離純化，得到QLBM。

通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

將喹哪啶酸(C1，0.38g，2mM)溶于干燥的二氯甲烷(20mL)加入到100mL的兩口瓶中，放入磁力轉(zhuǎn)子。然后將草酰氯(2.60g，20mM)溶解在10mL的干燥二氯甲烷中，在冰浴條件下滴加于喹哪啶酸溶液中，攪拌30分鐘，之后在氮?dú)猸h(huán)境下蒸餾攪拌5個(gè)小時(shí)。隨后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)物喹哪啶酰氯(簡(jiǎn)稱(chēng)為C2)。然后將得到的產(chǎn)物C2與2-氨基苯并咪唑(0.27g，2mM)加入到30mL干燥的二氯甲烷中與0.1mL的三甲胺的混合溶液中，0℃條件下攪拌反應(yīng)5個(gè)小時(shí)，旋蒸除去溶劑，并通過(guò)硅膠柱層析分離純化，得到QLBM黃色固體0.42g，產(chǎn)率為73％。

圖1和圖2分別為QLBM的氫譜及碳譜。

測(cè)試?yán)?

1QLBM的光物理表征

1.1測(cè)試QLBM的吸收譜圖。配置20μM的QLBM的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液，取2mL加入石英比色皿中，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)試其吸收譜圖。

1.2測(cè)試QLBM的熒光發(fā)射譜圖。配置20μM的QLBM溶液于50mM Tris-HCl(pH 7.2)，取1mL加入比色皿中，在熒光分光光度計(jì)上測(cè)試QLBM的熒光發(fā)射譜圖。激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，發(fā)射區(qū)間為400-700nm。

測(cè)試?yán)?

2QLBM對(duì)不同金屬離子的選擇性研究

2.1配置QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)的水溶液，向每個(gè)比色皿中加入1mL的溶液，每個(gè)比色皿中依次加入Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，F(xiàn)e²⁺，Mn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Al³⁺，Pd²⁺，Cu²⁺，F(xiàn)e³⁺鹽溶液。加入后混合均勻，各皿中金屬離子濃度為Na⁺(500μM)，K⁺(500μM)，Mg²⁺(500μM)，Zn²⁺(500μM)，Ca²⁺(500μM)，F(xiàn)e²⁺(500μM)，Mn²⁺(500μM)，Hg²⁺(500μM)，Cd²⁺(500μM)，Co²⁺(500μM)，Al³⁺(500μM)，Pd²⁺(500μM)離子鹽溶液。

2.2在熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行熒光強(qiáng)度的檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)為370nm)。

2.3采集并處理數(shù)據(jù)。

測(cè)試?yán)?

3Cu²⁺和Fe³⁺對(duì)QLBM的滴定實(shí)驗(yàn)

3.1配置20μM QLBM溶液，溶劑為50mM Tris-HCl(pH 7.2)，取1mL加入比色皿中。

3.2配置10mM的CuCl₂和FeCl₃水溶液。

3.3向比色皿中分別滴加Cu²⁺，Cu²⁺的濃度范圍為0～300μM，在熒光分光光度計(jì)上依次測(cè)試熒光發(fā)射譜圖。

3.4同法，測(cè)試逐滴加入Fe³⁺的熒光發(fā)射譜圖。

3.5采集并處理數(shù)據(jù)。

測(cè)試?yán)?

4抗壞血酸對(duì)Cu²⁺和Fe³⁺的區(qū)分

4.1配置20μM QLBM溶液，溶劑為50mM Tris-HCl(pH 7.2)，取1mL分別加入兩個(gè)比色皿中。

4.2分別加入200μM的Cu²⁺和Fe³⁺鹽溶液，測(cè)試熒光發(fā)射譜圖。

4.3繼而分別加入500μM抗壞血酸溶液，混合均勻，記錄1h內(nèi)的熒光發(fā)射圖譜，每10分鐘測(cè)試一次。

4.4采集并處理數(shù)據(jù)。

測(cè)試?yán)?

5QLBM與Cu²⁺和Fe³⁺的作用機(jī)制分析

5.1配置QLBM和兩當(dāng)量的CuCl₂和FeCl₃的溶液，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

5.2質(zhì)譜分析得到QLBM與Cu²⁺/Fe³⁺結(jié)合比例。

5.3在計(jì)算機(jī)上利用高斯09軟件進(jìn)行密度泛函理論(DFT)計(jì)算分析。

測(cè)試?yán)?

6細(xì)胞培養(yǎng)方法

將HeLa細(xì)胞放置于37℃，二氧化碳含量為5％的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基為含10％FBS的RPMI-1640。在細(xì)胞密度約為90％時(shí)使用胰酶細(xì)胞消化液進(jìn)行傳代，平均2天傳代一次。

測(cè)試?yán)?

7細(xì)胞毒性檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)期HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞溶液濃度至50000個(gè)/mL，在96孔板中每孔加入100μL。在5％CO₂，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜后，加入不同濃度梯度的QLBM 100μL，使各梯度濃度為(0，2μM，5μM，10μM，20μM，50μM，100μM)。每個(gè)梯度五個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，每孔加入20μL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)的PBS溶液(5mg/mL)，共孵育4h。吸去上清，每孔加入150μL的DMSO，置搖床上低速震蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

測(cè)試?yán)?

8細(xì)胞成像

8.1QLBM與HeLa細(xì)胞作用成像實(shí)驗(yàn)。將HeLa細(xì)胞傳代至直徑為20mm的共聚焦玻底培養(yǎng)皿，在5％CO₂，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后。將QLBM加入培養(yǎng)基中，QLBM的濃度為20μM，孵育6h后，移去培養(yǎng)液，用1×PBS清洗細(xì)胞六次。在共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000-IX81confocal laser scanning microscope)下觀測(cè)。激發(fā)光選用汞激光器(72.0％405nm)。

8.2細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)QLBM與Cu²⁺和Fe³⁺細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。將HeLa細(xì)胞傳代至直徑為20mm的共聚焦玻底培養(yǎng)皿，在5％CO₂，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后。將QLBM加入培養(yǎng)基中，QLBM的濃度為20μM，孵育6h后，加入200μM Cu²⁺和Fe³⁺共孵育30min后移去培養(yǎng)液，用1×PBS清洗細(xì)胞六次。在共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000-IX81confocal laser scanning microscope)下觀測(cè)。激發(fā)光選用汞激光器(72.0％405nm)。

9數(shù)據(jù)與分析

9.1QLBM在Tris-HCl(50mM,pH 7.2)溶液體系中的紫外吸收和熒光發(fā)射譜圖

如圖3所示，QLBM擁有300～400nm的吸收范圍。508nm處為其最大發(fā)射波長(zhǎng)。

9.2QLBM在Tris-HCl(50mM,pH 7.2)溶液體系中的紫外吸收和熒光發(fā)射譜圖

如圖3所示，QLBM擁有300～400nm的吸收范圍。508nm處為其最大發(fā)射波長(zhǎng)。

9.3QLBM與不同金屬離子的選擇性研究

QLBM基于喹啉骨架設(shè)計(jì)而成，其雜環(huán)氮原子的喹啉衍生物可以作為金屬離子的螯合位點(diǎn)，所以進(jìn)行QLBM與不同金屬離子之間的選擇性研究，本發(fā)明共選取了14種常見(jiàn)金屬離子(Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，F(xiàn)e²⁺，Mn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Al³⁺，Pd²⁺，Cu²⁺，F(xiàn)e³⁺)。

如圖4(a)-4(d)所示，加入了不同的金屬離子后，Cu²⁺和Fe³⁺對(duì)QLBM的熒光顯示出了顯著的淬滅，而對(duì)其他離子并沒(méi)有明顯的變化。與之對(duì)應(yīng)，紫外燈照射下QLBM-Cu²⁺和QLBM-Fe³⁺的熒光有顯著淬滅，而加入其他離子的QLBM溶液并未明顯的顏色變化。在其他離子的QLBM溶液中繼而分別加入Cu²⁺和Fe³⁺，其他離子的QLBM溶液熒光顯示了明顯的淬滅。以上結(jié)果說(shuō)明QLBM對(duì)Cu²⁺和Fe³⁺有特異響應(yīng)，且在其他離子存在的條件下，不會(huì)干擾QLBM對(duì)Cu²⁺和Fe³⁺的特異響應(yīng)。

9.4Cu²⁺和Fe³⁺對(duì)QLBM的滴定實(shí)驗(yàn)

如圖5(a)-5(d)所示，在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液體系中，隨著Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度不斷增加，QLBM的最大發(fā)射波長(zhǎng)(508nm)處的熒光值不斷下降，當(dāng)Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度達(dá)到200μM時(shí)，QLBM的熒光值淬滅效率達(dá)到約90％。當(dāng)Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度在0～50μM時(shí)，QLBM的最大發(fā)射波長(zhǎng)(508nm)和Cu²⁺/Fe³⁺的滴加濃度呈現(xiàn)較好的線(xiàn)性。通過(guò)LOD＝3*Sb/S計(jì)算其檢測(cè)線(xiàn)，QLBM對(duì)Cu²⁺的檢測(cè)限為1.35×10^-7M，對(duì)Fe³⁺的檢測(cè)限為1.24×10^-7M。在QLBM(20μM)的Tris-HCl(50mM，pH 7.2)溶液體系中，隨著Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度不斷增加，QLBM的最大發(fā)射波長(zhǎng)(508nm)處的熒光值不斷下降，當(dāng)Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度達(dá)到200μM時(shí)，QLBM的熒光值淬滅效率達(dá)到約90％。當(dāng)Cu²⁺和Fe³⁺的滴加濃度在0～50μM時(shí)，QLBM的最大發(fā)射波長(zhǎng)(508nm)和Cu²⁺/Fe³⁺的滴加濃度呈現(xiàn)較好的線(xiàn)性。通過(guò)LOD＝3*Sb/S計(jì)算其檢測(cè)線(xiàn)，QLBM對(duì)Cu²⁺的檢測(cè)限為1.35×10^-7M，對(duì)Fe³⁺的檢測(cè)限為1.24×10^-7M。

9.5抗壞血酸(AA)對(duì)Cu²⁺和Fe³⁺的區(qū)分

如圖6(a)-6(d)所示，Cu²⁺和Fe³⁺對(duì)QLBM均顯示出較好的的淬滅效果(淬滅率～90％)，繼而加入過(guò)量的抗壞血酸(500μM)后，QLBM-Fe³⁺溶液顯示了明顯的熒光回復(fù)，而QLBM-Cu²⁺的熒光并無(wú)顯著變化。這主要是由于抗壞血酸具有較強(qiáng)的還原性，能夠快速將Fe³⁺還原為Fe²⁺。根據(jù)圖4結(jié)果顯示，QLBM對(duì)Fe²⁺沒(méi)有明顯響應(yīng)。而抗壞血酸對(duì)Cu²⁺的還原需要更嚴(yán)苛的條件，因而QLBM-Cu²⁺的熒光并無(wú)顯著變化。紫外燈照射下的溶液顏色變化也與上述結(jié)果相一致?？箟难崤cFe³⁺的反應(yīng)屬于氧化還原反應(yīng)，該反應(yīng)需要一定的時(shí)間，又考察了抗壞血酸與Fe³⁺的作用時(shí)間，發(fā)現(xiàn)當(dāng)達(dá)到1h后，熒光回復(fù)到最大值。

9.6QLBM與Cu²⁺和Fe³⁺的作用機(jī)制研究

圖7(a)-7(b)的質(zhì)譜結(jié)果顯示，m/z＝289.1106(計(jì)算值＝289.1084)對(duì)應(yīng)于[QLBM+H]⁺,m/z＝350.0238(計(jì)算值＝350.0218)對(duì)應(yīng)于[QLBM+Cu²⁺+H]+，m/z＝385.9989(計(jì)算值＝385.9990)對(duì)應(yīng)于[QLBM+Cu²⁺+Cl^-]⁺，m/z＝378.0009(計(jì)算值＝378.0410)對(duì)應(yīng)于[QLBM+Fe³⁺+Cl^-+OH^-]⁺，m/z＝396.0105(計(jì)算值＝396.0071)對(duì)應(yīng)于[QLBM+Fe³⁺+2OH^-]⁺，m/z＝413.9745(計(jì)算值＝413.9732)對(duì)應(yīng)于[QLBM+Fe³⁺+2Cl^-]⁺。結(jié)果顯示QLBM與Cu²⁺及Fe³⁺的結(jié)合比例為1:1。

通過(guò)DFT計(jì)算分析，QLBM、QLBM與Cu²⁺及QLBM與Fe³⁺的結(jié)合位點(diǎn)如圖8(a)、8(b)和圖8(c)所示。Cu²⁺和QLBM結(jié)構(gòu)上的N(1)，N(2)，Cl(3)，Cl(4)原子的距離分別為和Fe³⁺和QLBM結(jié)構(gòu)上的N(1)，N(2)，Cl(3)，Cl(4)原子的距離分別為和圖中結(jié)構(gòu)為QLBM，QLBM-Cu²⁺復(fù)合物和QLBM-Fe³⁺復(fù)合物的最優(yōu)化結(jié)構(gòu)。

9.7細(xì)胞成像

9.7.1細(xì)胞毒性

通過(guò)MTT法研究QLBM的細(xì)胞毒性，如圖9所示，當(dāng)QLBM濃度達(dá)到20μM時(shí)孵育24h后，細(xì)胞存活率達(dá)90％以上。

9.7.2QLBM的細(xì)胞內(nèi)成像

圖10(a)-10(c)中的結(jié)果顯示，當(dāng)HeLa細(xì)胞共孵育后6h后進(jìn)行共聚焦顯微成像，HeLa細(xì)胞顯示明亮的綠色熒光。孵育6h后，分別加入200μM Cu²⁺離子和200μM Fe³⁺離子后進(jìn)行共聚焦顯微成像，HeLa細(xì)胞與圖10(a)相比熒光呈現(xiàn)明顯的淬滅。結(jié)果顯示QLBM能夠用作細(xì)胞內(nèi)成像檢測(cè)Cu²⁺和Fe³⁺。