本發(fā)明涉及病毒防控領(lǐng)域，具體涉及一種融合蛋白、其制備方法及一種豬用口服疫苗。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠狀病毒科豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的各年齡段豬腹瀉、嘔吐、脫水和哺乳仔豬高度致死為特征的一種高度接觸性腸道傳染病。本病在亞洲地區(qū)特別是我國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)的感染非常嚴(yán)重，其感染率明顯高于另外的兩個(gè)豬病毒性腹瀉病原---豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PRV)。由于PED對(duì)仔豬的嚴(yán)重危害，國(guó)內(nèi)、外學(xué)者相繼研制了PEDV的疫苗，并應(yīng)用于現(xiàn)在豬場(chǎng)PED的免疫預(yù)防。然而，在PEDV疫苗廣泛應(yīng)用的同時(shí)，PED仍然存在并經(jīng)常發(fā)生，其免疫失敗的原因，目前仍不明確。

抗原表位能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體進(jìn)而保護(hù)機(jī)體免受病原的侵害，抗原分子的抗原表位分類方法有多種，例如B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，線性表位和構(gòu)象表位，中和表位和非中和表位等?？乖砦换蚝椭泻捅砦换蚓鶠椴《净蚬こ桃呙绲暮蜻x靶基因。PEDVS蛋白在介導(dǎo)感染宿主產(chǎn)生中和抗體的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員先后對(duì)PEDVS基因進(jìn)行了的研究。2002年Chang等據(jù)PEDV S基因的中和表位序列，推測(cè)出了PEDVS基因的一個(gè)抗原表位區(qū)(499－638aa)，并命名為COE，隨后也被用于基因工程疫苗的制備。但這樣的疫苗的效果仍然有限。

因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員需要在豬流行性腹瀉領(lǐng)域做出更多努力，開(kāi)發(fā)出免疫效果明顯且穩(wěn)定的PEDV疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先提供一種融合蛋白，所述融合蛋白為由布魯氏菌外膜蛋白(OMP16)和豬流行性腹瀉病毒S蛋白(PEDV-S)中的全部或部分片段融合而得。

本發(fā)明融合蛋白中的Omp16蛋白起到免疫增強(qiáng)劑的作用，特別是增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答；PEDVS蛋白起到保護(hù)性免疫原的作用，以獲取更好的免疫作用。

在一種具體的實(shí)施方式中，布魯氏菌外膜蛋白片段和豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段間用接頭連接起來(lái)；優(yōu)選所述接頭由甘氨酸和絲氨酸組成，且所述接頭的序列為GGGGSGGGGSGGGGS，其中甘氨酸端與布魯氏菌外膜蛋白片段連接，絲氨酸端與豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段連接。

在一種具體的實(shí)施方式中，所述融合蛋白是在包含豬流行性腹瀉病毒S蛋白493-708位氨基酸序列的片段前用接頭連接了包含布魯氏菌外膜蛋白Omp16蛋白26-168位氨基酸的片段。優(yōu)選地，所述融合蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID No.2所示序列，或所述融合蛋白基因的核苷酸序列包含如SEQ ID No.1所示序列。

在一種具體的實(shí)施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列包括不間斷地截取Omp16蛋白26-168位氨基酸鏈中60％以上氨基酸數(shù)形成的肽段一，且所述融合蛋白的氨基酸序列包括不間斷地截取豬流行性腹瀉病毒S蛋白493-708位氨基酸鏈中60％以上氨基酸數(shù)形成的肽段二，肽段一和肽段二間以接頭連接形成所述融合蛋白的氨基酸序列；所述融合蛋白基因的核苷酸序列為前述融合蛋白的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。

在一種具體的實(shí)施方式中，所述融合蛋白中包括由肽段A產(chǎn)生一處或多處突變而形成的肽段B，所述肽段A為不間斷地截取豬流行性腹瀉病毒S蛋白493-708位氨基酸鏈中60％～100％氨基酸數(shù)形成的肽段，且所述多處突變所涉及的總突變氨基酸數(shù)目為肽段A總氨基酸數(shù)的10％以內(nèi)；而融合蛋白基因的核苷酸序列中包括與肽段B相應(yīng)的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供一種上述融合蛋白的制備方法，包括將所述融合蛋白的基因克隆至原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)宿主菌上，再經(jīng)純化得到融合蛋白。

在一種具體的實(shí)施方式中，所述原核表達(dá)載體為pET28a，所述原核表達(dá)宿主菌為BL21(DE3)。

本發(fā)明的另一目的是克服現(xiàn)有PEDV疫苗免疫效果不穩(wěn)定的缺陷，提供一種新的豬用口服疫苗。因此，本發(fā)明還提供一種豬用口服疫苗或藥物，包括如上任意一項(xiàng)所述融合蛋白裝入乳酸菌表達(dá)載體后，將乳酸菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中并培養(yǎng)所述菌株而得到所述豬用口服疫苗或藥物；優(yōu)選所述乳酸菌表達(dá)載體為pVE5523，所述干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為ATCC393。本發(fā)明提供的上述豬用口服疫苗為一種重組干酪乳桿菌基因工程亞單位口服乳酸菌疫苗，特別是一種安全有效、能在腸道黏膜定居的豬流行性腹瀉基因工程亞單位口服疫苗。

在一種具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一、一種OMP16-PEDVS融合蛋白，是在布魯氏菌Omp16蛋白26-168位氨基酸序列后用Linker蛋白(GGGGSGGGGSGGGGS)連接了豬流行性腹瀉病毒S蛋白的493-708位氨基酸，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

二、編碼上述的OMP16-PEDVS融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

三、上述的OMP16-PEDVS融合蛋白基因5’端添加Sal I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端添加Eco RV限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將上述的基因亞克隆至pVE5523乳酸菌分泌表達(dá)載體中，同時(shí)轉(zhuǎn)化ATCC393干酪乳桿菌，獲得重組OMP16-PEDVS干酪乳桿菌。

四、上述的OMP16-PEDVS融合蛋白基因5’端添加Nco I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端添加X(jué)ho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將上述的基因亞克隆至pET28a(+)原核表達(dá)載體中，同時(shí)轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)和純化。另外，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PEDVS_493-708基因，5’端添加Nco I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端添加X(jué)ho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將上述的基因亞克隆至pET28a(+)原核表達(dá)載體中，同時(shí)轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)和純化。

五、上述三中的重組OMP16-PEDVS干酪乳桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，制備豬流行性腹瀉口服疫苗。

在一種具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及制備一種布魯氏菌外膜蛋白(outer membrane protein 16，OMP16)和豬流行性腹瀉病毒S蛋白(spike glycoprotein，棘突糖蛋白)的融合蛋白的乳酸菌基因工程疫苗。本發(fā)明中，將布魯氏菌外膜蛋白(OMP16_26-168)和豬流行性腹瀉病毒S蛋白肽段(S_493-708)用Linker(GGGGSGGGGSGGGGS)接頭連接起來(lái)，即ATG-Omp16_26-168-Linker-PEDVS_493-708-HHHHHH-TGA基因(命名為Omp16-PEDV)，其中ATG和TGA是核苷酸，H是組氨酸。之后將融合蛋白Omp16-PEDV裝到pVE5523乳酸菌表達(dá)載體的Sal I和Eco RV酶切位點(diǎn)(命名為pVE5523-Omp16-PEDVS)，并將該乳酸菌表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC393中即得到本發(fā)明所述的豬用口服疫苗。將攜帶pVE5523-Omp16-PEDVS質(zhì)粒的干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC393(命名為Omp16-PEDVS/ATCC393)對(duì)小鼠進(jìn)行口服免疫，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫表達(dá)水平都很高。說(shuō)明本發(fā)明提供了一種很好的預(yù)防豬流行性腹瀉用口服疫苗，為下一步乳酸菌口服疫苗的臨床使用和治療豬流行性腹瀉性疾病奠定了堅(jiān)實(shí)地基礎(chǔ)。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

合成Omp16_26-168-PEDVS_493-708(Omp16-PEDV)基因，將基因克隆到pVE5523的Sal I和Eco RV多克隆位點(diǎn)，并將其轉(zhuǎn)化到乳酸菌ATCC393中。

本發(fā)明提供的豬用口服疫苗的有益效果：可以口服，能有效刺激腸道局部免疫細(xì)胞產(chǎn)生分泌型IgA，這適用于腸道中細(xì)菌，病毒、寄生蟲(chóng)等黏膜病原的清除，避免了常規(guī)注射疫苗引起的應(yīng)激以及抗體無(wú)法到達(dá)病原所在部位的缺陷。該疫苗采取活的乳酸菌載體系統(tǒng)，避免了滅活苗在到達(dá)小腸黏膜之前被降解和失去作用的可能性。本發(fā)明中Omp16蛋白起到免疫佐劑的作用，PEDVS起到抗原的作用，ATCC393乳酸菌作為載體，能最有效的保護(hù)豬流行性腹瀉病毒的感染導(dǎo)致的疾病。

附圖說(shuō)明

圖1為OMP16-PEDVS融合蛋白結(jié)構(gòu)圖；

圖2為合成的pUC57-OMP16-PEDVS質(zhì)粒雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1為pUC57-OMP16-PEDVS雙酶切結(jié)果，1134bp對(duì)應(yīng)的片段為OMP16-PEDVS，上面的片段為pUC57載體片段；M為DNA Marker DL8000；

圖3為重組質(zhì)粒pVE5523-OMP16-PEDVS質(zhì)粒雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1為pVE5523-OMP16-PEDVS雙酶切結(jié)果，1134bp對(duì)應(yīng)的片段為OMP16-PEDVS，上面的片段為pVE5523載體片段；M為DNA Marker DL8000；

圖4為重組質(zhì)粒pET28a-OMP16-PEDVS質(zhì)粒雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1為pET28a-OMP16-PEDVS雙酶切結(jié)果，1134bp對(duì)應(yīng)的片段為OMP16-PEDVS，上面的片段為pET28a載體片段；2為pET28a-PEDVS雙酶切結(jié)果，660bp對(duì)應(yīng)的片段為PEDVS，上面的片段為pET28a載體片段；M為DNA Marker DL8000；

圖5為重組OMP16-PEDVS以及PEDVS蛋白表達(dá)及純化結(jié)果。圖A為OMP16-PEDVS，1為IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-OMP16-PEDVS沉淀；2為IPTG誘導(dǎo)后的pET-28a-OMP16-PEDVS上清；3為蛋白質(zhì)Marker，4和5為蛋白純化結(jié)果。圖B為PEDVS，M為蛋白質(zhì)Marker；1為未誘導(dǎo)的BL21(DE3)菌；2為誘導(dǎo)的帶pET-28a的BL21(DE3)菌；3為未誘導(dǎo)的pET-28a-PEDVS重組菌；4為IPTG誘導(dǎo)后的pET-28a-PEDVS重組菌；5為蛋白純化結(jié)果。

圖6為免疫后小鼠血清中IgG亞類(IgG1、IgG2a和IgG2b)的分析結(jié)果，圖中F’代表弗氏完全佐劑。

圖7為免疫后小鼠脾臟細(xì)胞中IFN-γ(γ干擾素，縱坐標(biāo)單位為pg/10⁶個(gè)細(xì)胞)、IL-10(白細(xì)胞介素10，縱坐標(biāo)單位為pg/ml)和IL-4(白細(xì)胞介素4，縱坐標(biāo)單位為pg/ml)的分泌水平。

具體實(shí)施實(shí)例

本發(fā)明通過(guò)以下具體實(shí)施例并結(jié)合附圖說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于下述實(shí)施例和附圖。

本發(fā)明首先提供一種融合蛋白，所述融合蛋白為由布魯氏菌外膜蛋白(OMP16)和豬流行性腹瀉病毒S蛋白(PEDV-S)中的全部或部分片段融合而得。

在一種具體的實(shí)施方式中，布魯氏菌外膜蛋白片段和豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段間用接頭連接起來(lái)；優(yōu)選所述接頭由甘氨酸和絲氨酸組成，且所述接頭的序列為GGGGSGGGGSGGGGS，其中甘氨酸端與布魯氏菌外膜蛋白片段連接，絲氨酸端與豬流行性腹瀉病毒S蛋白片段連接。

在一種具體的實(shí)施方式中，所述融合蛋白是在包含豬流行性腹瀉病毒S蛋白493-708位氨基酸序列的片段前用接頭連接了包含布魯氏菌外膜蛋白Omp16蛋白26-168位氨基酸的片段。優(yōu)選地，所述融合蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID No.2所示序列，或所述融合蛋白基因的核苷酸序列包含如SEQ ID No.1所示序列。

在一種具體的實(shí)施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列包括不間斷地截取Omp16蛋白26-168位氨基酸鏈中60％以上氨基酸數(shù)形成的肽段一，且所述融合蛋白的氨基酸序列包括不間斷地截取豬流行性腹瀉病毒S蛋白493-708位氨基酸鏈中60％以上氨基酸數(shù)形成的肽段二，肽段一和肽段二間以接頭連接形成所述融合蛋白的氨基酸序列；所述融合蛋白基因的核苷酸序列為前述融合蛋白的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可知的，Omp16蛋白中一共有超過(guò)300個(gè)氨基酸，取包含26-168位氨基酸(例如取整條Omp16蛋白或例如取第20～300位氨基酸)這143個(gè)氨基酸的方案是必然可行的，而且包含26-168位氨基酸的氨基酸鏈越長(zhǎng)效果可能會(huì)越好，這些方案的效果可能會(huì)優(yōu)于只取26-168位氨基酸的方案。同樣地，取包含豬流行性腹瀉病毒S蛋白493-708位氨基酸這215個(gè)氨基酸的方案是必然可行的，而且包含493-708位氨基酸的氨基酸鏈越長(zhǎng)效果可能會(huì)越好，這些方案的效果可能會(huì)優(yōu)于只取493-708位氨基酸的方案。

此外，融合蛋白中即使不包含Omp16蛋白的第26-168位這143個(gè)氨基酸的全部，而只是不間斷地截取其中一段氨基酸序列，這樣的方案也是可行的，只是效果可能會(huì)比取融合蛋白中包含Omp16蛋白的第26-168位這143個(gè)氨基酸的效果略差些。具體地，至少要不間斷地截取Omp16蛋白26-168位氨基酸鏈中60％以上氨基酸數(shù)形成的肽段一，同樣的，需要不間斷地截取豬流行性腹瀉病毒S蛋白493-708位氨基酸鏈中60％以上氨基酸數(shù)形成的肽段二。例如取Omp16蛋白的第80～160位氨基酸為肽段一和取豬流行性腹瀉病毒S蛋白520-688位氨基酸為肽段二，二者用接頭連接起來(lái)即得所述融合蛋白。

此外，如果含豬流行性腹瀉病毒的豬體內(nèi)的豬流行性腹瀉病毒S蛋白493-708位氨基酸中的任意一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)生了氨基酸突變，則相應(yīng)的疫苗中融合蛋白的該處氨基酸序列也同樣需要做相應(yīng)的突變，這樣才會(huì)產(chǎn)生很好的免疫效果。因此，在一種具體的實(shí)施方式中，所述融合蛋白中包括由肽段A產(chǎn)生一處或多處突變而形成的肽段B，所述肽段A為不間斷地截取豬流行性腹瀉病毒S蛋白493-708位氨基酸鏈中60％～100％氨基酸數(shù)形成的肽段，且所述多處突變所涉及的總突變氨基酸數(shù)目為肽段A總氨基酸數(shù)的10％以內(nèi)；而融合蛋白基因的核苷酸序列中包括與肽段B相應(yīng)的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供一種上述融合蛋白的制備方法，包括將所述融合蛋白的基因克隆至原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)宿主菌上，再經(jīng)純化得到融合蛋白。

在一種具體的實(shí)施方式中，所述原核表達(dá)載體為pET28a，所述原核表達(dá)宿主菌為BL21(DE3)。

本發(fā)明還提供一種豬用口服疫苗或藥物，包括如上任意一項(xiàng)所述融合蛋白裝入乳酸菌表達(dá)載體后，將乳酸菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中并培養(yǎng)所述菌株而得到所述豬用口服疫苗或藥物；優(yōu)選所述乳酸菌表達(dá)載體為pVE5523，所述干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為ATCC393。

乳酸桿菌(Lacticacid bacteria)是一群桿狀或球狀的革蘭氏陽(yáng)性菌，與動(dòng)物關(guān)系最密切，它是動(dòng)物腸道和陰道中占優(yōu)勢(shì)的菌群之一。乳酸桿菌己知的生理功能主要表現(xiàn)為：阻止病原菌對(duì)腸道的入侵和定植，抑制病原菌，抗感染，維持腸道的微生態(tài)平衡，預(yù)防和抑制腫瘤的發(fā)生，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。pVE5523載體是一種能攜帶功能基因并能在乳酸桿菌中進(jìn)行蛋白分泌表達(dá)的載體。因此，給豬口服攜帶pVE5523-Omp16-PEDVS質(zhì)粒的乳酸桿菌，能充分調(diào)動(dòng)腸道的黏膜免疫應(yīng)答水平，不失為一種方便、有效的預(yù)防PEDV感染的最有效疫苗。

本發(fā)明還提供所述豬用口服疫苗或藥物在預(yù)防和治療豬流行性腹瀉中的應(yīng)用。本發(fā)明中，將所述OMP16-PEDVS乳酸菌制成疫苗時(shí)其效果優(yōu)于將其制成藥物的效果。

實(shí)施例1

本實(shí)施例說(shuō)明重組Omp16-PEDVS/ATCC393乳酸乳桿菌(實(shí)施例3中使用的口服疫苗)的制備方法，包括以下步驟：

1、合成OMP16-PEDVS基因，并在5’端加上Sal I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以及3’加上Eco RV限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，合成的基因克隆在pUC57載體上，命名為pUC57-Omp16-PEDVS(其融合蛋白的序列見(jiàn)序列SEQ.No.2)，pUC57-Omp16-PEDVS質(zhì)粒的Sal I和Eco RV雙酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。

2、pVE5523-Omp16-PEDVS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ATCC393乳酸乳桿菌

將測(cè)序正確的pUC57-Omp16-PEDVS的質(zhì)粒以及pVE5523表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行Sal I和Eco RV雙酶切，膠回收目的片段和pVE5523載體片段，用T4Ligase(T4DNA連接酶)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌。之后挑取陽(yáng)性克隆，搖菌后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(如圖3)，確保基因插入了載體中，將正確的克隆命名為pVE5523-Omp16-PEDVS。

將pVE5523-Omp16-PEDVS質(zhì)粒和ATCC393乳酸乳桿菌感受態(tài)(實(shí)驗(yàn)室保存)輕柔混勻后，冰上放置5min，將其轉(zhuǎn)入直徑1mm的預(yù)冷電轉(zhuǎn)化杯中，迅速電擊，電擊參數(shù)為電壓2.5kV，電擊時(shí)間5ms，電擊后加入800μl冰預(yù)冷的SGM17培養(yǎng)基，混勻，將菌液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，冰上放置10min，28℃厭氧培養(yǎng)2h，取適量菌液涂布于含有5μg/ml紅霉素的GM17瓊脂培養(yǎng)基上，28℃厭氧培養(yǎng)2-3天，于平板上挑取單個(gè)菌落，分別接種于含有5μg/ml紅霉素的GM17液體培養(yǎng)基中，28℃厭氧培養(yǎng)48h后，從ATCC393中提出質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定分析。將正確的克隆命名為重組Omp16-PEDVS/ATCC393乳酸乳桿菌。

3、重組菌保存試驗(yàn)

將重組Omp16-PEDVS/ATCC393乳酸乳桿菌200μl接種于含有5μg/ml紅霉素的150mlGM17液體培養(yǎng)基中。28℃厭氧培養(yǎng)至OD600＝1.2，與150ml含4％蔗糖和10％脫脂乳混合物混合均勻，分裝成1.5ml/管，凍干條件為(降溫1h到-45℃，然后抽真空2.5h，溫度達(dá)到-40℃；自然升溫1h，到-10℃；在此溫度下保溫8h，升溫1h到0℃，保溫1h；升溫1h到30℃保溫6h。)；凍干菌儲(chǔ)存條件分別為4℃，-20℃，-80℃，凍干菌分別經(jīng)過(guò)保存15天，30天，60天，90天后進(jìn)行菌體復(fù)蘇并計(jì)數(shù)，結(jié)果活菌數(shù)均大于10⁸CFU/ml，重組菌保存試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1

表1的結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明所述乳酸菌口服疫苗具有良好的保存性能，即使在4℃的條件下，30天內(nèi)細(xì)胞活力的下降也是很小的，保存手段合適時(shí)，該疫苗可以保存很長(zhǎng)一段時(shí)間。

實(shí)施例2

本實(shí)施例說(shuō)明重組Omp16-PEDVS和PEDVS原核表達(dá)蛋白(實(shí)施例3中使用的兩種注射疫苗)的制備方法，包括以下步驟：

1、pET28a-OMP16-PEDVS表達(dá)載體的構(gòu)建

以pVE5523-OMP16-PEDVS基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)擴(kuò)增OMP16-PEDVS的上游引物F1(見(jiàn)序列SEQ.No.3)和下游引物R1(見(jiàn)序列SEQ.No.4)，并在5’端加上Nco I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以及3’加上Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將基因亞克隆在pET28a(+)原核表達(dá)載體上，命名為pET28a-OMP16-PEDVS。結(jié)果如圖4中1所示，并將正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)大腸桿菌。

2、pET28a-PEDVS表達(dá)載體的構(gòu)建

以pVE5523-OMP16-PEDVS基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)擴(kuò)增PEDVS的上游引物F2(見(jiàn)序列SEQ.No.5)和下游引物R2(見(jiàn)序列SEQ.No.6)，并在5’端加上Nco I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以及3’加上Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將基因亞克隆在pET28a(+)原核表達(dá)載體上，命名為pET28a-PEDVS。結(jié)果如圖4中2所示，并將正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)大腸桿菌。

3、蛋白的表達(dá)和純化

將攜帶pET28a-OMP16-PEDVS和pET28a-PEDVS質(zhì)粒的BL21(DE3)大腸桿菌分別接種于含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani液體培養(yǎng)基)中。重組細(xì)菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)至A₆₀₀值為0.6-0.8，加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至終濃度1mM/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4-5h測(cè)定誘導(dǎo)菌的A₆₀₀值。然后，用Promega公司的MagneHisTM蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，純化后蛋白通過(guò)SDS-PAGE來(lái)進(jìn)行純度驗(yàn)證。結(jié)果如圖5所示，圖5為重組OMP16-PEDVS(圖A)以及PEDVS蛋白(圖B)表達(dá)及純化結(jié)果。通過(guò)與蛋白質(zhì)分子量Marker和誘導(dǎo)0h相比對(duì)，純化后的泳道和誘導(dǎo)后的泳道分別出現(xiàn)蛋白質(zhì)分子大小為40KD(OMP16-PEDVS)和23KD(PEDVS)的目的蛋白，說(shuō)明目的蛋白得到了表達(dá)和純化。

實(shí)施例3

本實(shí)施例說(shuō)明OMP16-PEDVS乳酸菌(實(shí)施例1制備的口服疫苗)、OMP16-PEDVS蛋白和PEDVS蛋白(實(shí)施例2制備的兩種注射疫苗)免疫效果對(duì)比。

1、動(dòng)物免疫

取健康的雌性的SPF級(jí)(無(wú)特定病原體動(dòng)物)C57/B6小鼠50只，分成OMP16-PEDVS乳酸菌、OMP16-PEDVS蛋白組、OMP16-PEDVS蛋白+弗氏佐劑組(OMP16-PEDVS+F’)、PEDVS蛋白組和對(duì)照組。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，弗氏完全佐劑一般在注射疫苗中起到免疫效果增強(qiáng)的作用。蛋白免疫使用的濃度為1mg/ml，添加弗氏完全佐劑組以蛋白：弗氏完全佐劑為1：1的比例進(jìn)行乳化，每只200μl小鼠腿部肌肉注射免疫；首次免疫后14d，腿部肌肉注射加強(qiáng)免疫一次。

2、抗體水平

用間接ELISA檢測(cè)分離的血清樣本中IgG亞類(IgG1、IgG2a和IgG2b)。

包被抗原均以10μg/mL濃度，每孔100μL包被96孔酶標(biāo)板，37℃2h，然后用PBST(PBS+吐溫)洗滌。每孔加100μL 5％脫脂乳的PBST封閉液，37℃封閉1h，洗滌；每孔加入PBS稀釋的待檢免疫血清，37℃孵育1h，洗滌；每孔加入PBS稀釋的二抗，37℃孵育1h，洗滌；每孔加入100μL TMB顯色液(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)，室溫顯色10min后每孔加入50μL 2M的硫酸終止反應(yīng)，測(cè)OD450nm吸光值。分析結(jié)果。當(dāng)樣品OD450值≥(陰性血清的OD450值+3倍標(biāo)準(zhǔn)方差)時(shí)即為陽(yáng)性。

將各實(shí)驗(yàn)組抗原以1μg/孔包被好酶聯(lián)免疫吸附板后，將二免14d血清按1:100比例稀釋作為一抗，以HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b以1:2000稀釋后作為二抗，采用間接ELISA方法檢測(cè)抗體水平，酶標(biāo)儀OD₄₅₀下讀取數(shù)值，圖6顯示的結(jié)果表明OMP16-PEDVS乳酸菌、OMP16-PEDVS蛋白和OMP16-PEDVS+F’組抗體效價(jià)相當(dāng)，顯著高于PEDVS組和對(duì)照組。

3、細(xì)胞因子檢測(cè)

用Elispot方法檢測(cè)INF-γ含量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7A。用ELISA方法檢測(cè)IL-10和IL-4含量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7B和7C。按細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒的操作步驟進(jìn)行。

應(yīng)用ELISPOT方法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)免疫組和對(duì)照組小鼠的淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌水平，見(jiàn)圖7A。所得結(jié)果表明：OMP16-PEDVS乳酸菌組、OMP16-PEDVS蛋白組和OMP16-PEDVS+F’組小鼠脾淋巴細(xì)胞上清液中INF-γ分泌量分別與PEDV組相比差異較顯著(P＜0.05)，OMP16-PEDVS乳酸菌組、OMP16-PEDVS蛋白組和OMP16-PEDVS+F’組兩兩相比差異不顯著(P>0.05)。

應(yīng)用ELISA方法測(cè)定各組小鼠脾臟細(xì)胞上清液中IL-4和IL-10分泌水平。所得結(jié)果表明：OMP16-PEDVS乳酸菌組、OMP16-PEDVS蛋白組和OMP16-PEDVS+F’組小鼠脾淋巴細(xì)胞上清液中IL-4(圖7-C)和IL-10(圖7-B)分泌量分別與PEDV組相比差異較顯著(P＜0.05)，OMP16-PEDVS乳酸菌組、OMP16-PEDVS蛋白組和OMP16-PEDVS+F’組兩兩相比差異不顯著(P>0.05)。

以上結(jié)果表明，本發(fā)明提供的重組蛋白OMP16-PEDVS組的免疫效果顯著優(yōu)于PEDVS組的免疫效果。另外，OMP16-PEDVS乳酸菌組的免疫效果和OMP16-PEDVS蛋白組及OMP16-PEDVS+F’組相當(dāng)，說(shuō)明OMP16-PEDVS乳酸菌口服使用能達(dá)到OMP16-PEDVS疫苗的效果，間接表明OMP16具有免疫佐劑的作用。以上對(duì)于疫苗的有效性，已經(jīng)在理論上確認(rèn)了是可行的，下一步需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室攻毒試驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。

相比于兩種效果也不錯(cuò)的注射疫苗來(lái)說(shuō)，OMP16-PEDVS乳酸菌是口服疫苗。口服疫苗中的融合蛋白并非由蛋白質(zhì)純化方式而得，而是通過(guò)乳酸菌的繁殖得到。因這兩種注射疫苗都涉及融合蛋白的純化，因而疫苗的制備成本高(添加弗氏完全佐劑的注射疫苗比單獨(dú)用融合蛋白的注射疫苗的成本更高)；而口服疫苗的融合蛋白存在于乳酸菌中，因而不涉及融合蛋白的純化，因而疫苗的制備成本低。且口服疫苗同樣具有很好的效果，口服疫苗也方便使用。因此，本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種效果明顯且穩(wěn)定的預(yù)防豬流行性腹瀉用口服疫苗。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。