從含酶切位點的融合蛋白中純化蛋白的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本申請涉及一種從融合蛋白純化蛋白的方法，具體涉及一種節(jié)約程序與成本的酶 切純化蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶固定化技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域已有使用的先例，比如生物柴油技術(shù)，食品工程，廢 水處理等，但是在制藥領(lǐng)域還沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)的技術(shù)報道。融合蛋白技術(shù)是為獲得大量標(biāo)準(zhǔn) 蛋白而進行的有目的性的基因融合，利用融合蛋白技術(shù)，可構(gòu)建和表達具有多種功能的新 型目的蛋白。例如，有些融合蛋白是含有凝血酶或者腸激酶酶切位點的硫氧還蛋白和目的 蛋白融合表達，在后續(xù)純化中采用凝血酶或者腸激酶將硫氧還蛋白和目的蛋白切開，并采 用多步柱層析將這兩種蛋白分開，達到預(yù)期的純化效果。因此要得到目的蛋白需分為兩個 步驟:酶切和純化。目前通過基因工程手段表達有特殊標(biāo)記的融合蛋白技術(shù)已經(jīng)非常成熟， 現(xiàn)有技術(shù)中采用靜態(tài)酶切法，將目的蛋白置換到相應(yīng)的酶切溶液內(nèi)，靜態(tài)酶切一定的時間， 然后用不同的層析柱達到分離純化的目的。
[0003] 目前的酶切技術(shù)通常采用的靜態(tài)酶切法，是將酶和底物蛋白充分混勻后，在合適 的酶切條件下酶將融合蛋白切成目的蛋白和融合頭，此時，酶只對它周圍能接觸到的蛋白 產(chǎn)生酶切作用，酶切效率低，酶用量大，另外，酶和蛋白同時溶解在一種溶媒內(nèi)，后續(xù)目的蛋 白純化中會有酶殘留的問題。而且酶切時間長，酶和蛋白同時溶解在一種溶媒內(nèi)，不僅給后 續(xù)目的蛋白純化帶來影響，而且殘留的酶對蛋白有進一步的酶切，使酶切終點不好控制，酶 切的變異性增加。經(jīng)過酶切的蛋白通常需要采用進一步的層析進行純化，如果接下來純化 不能有效去除酶，則殘留的酶會繼續(xù)發(fā)揮作用，從而引入額外的雜質(zhì)，無法有效的純化目的 蛋白。經(jīng)過酶切的蛋白溶液內(nèi)成分較復(fù)雜，如果按照常規(guī)的層析方法，目的蛋白吸附在層析 介質(zhì)上，然后再根據(jù)其不同的表面電荷和疏水性等物理性質(zhì)將目的蛋白和雜蛋白分開，勢 必要經(jīng)過多步層析，每一步層析柱都需要至少五種溶液來完成層析步驟，整個層析工藝比 較復(fù)雜。每增加一步柱層析，會增加很多工作量，同時蛋白的回收率也會下降，因此用盡可 能少的層析步驟達到相同的純化效果是純化工藝的最佳境界。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本申請在蛋白純化工藝中，發(fā)明人巧妙地設(shè) 計了一種可以一步純化的方法:采用串聯(lián)的兩個層析柱一次純化目的蛋白，大大縮減了成 本和時間。具體而言，首先，將酶固定在介質(zhì)上，然后將介質(zhì)裝到層析柱內(nèi)，制成酶切層析 柱，將固定有酶的層析柱和另一根有特定介質(zhì)的層析柱串聯(lián)，當(dāng)融合蛋白在特定的緩沖條 件下流經(jīng)該串聯(lián)的裝置，目的蛋白直接從串聯(lián)柱流穿，雜蛋白吸附在層析介質(zhì)上，這樣一步 層析就可以得到高純度的目的蛋白。
[0005] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種一步從含有酶切位點的融合蛋白中純化蛋 白的方法，包括如下步驟：
[0006] 將能夠?qū)λ雒盖形稽c特異性酶切的酶固定在第一層析柱內(nèi)的介質(zhì)上；
[0007] 將固定有酶的第一層析柱與第二層析柱串聯(lián)，所述第二層析柱能夠吸附所述融合 蛋白的非目的蛋白（下文中也稱為融合頭)部分，并且不會吸附目的蛋白；
[0008] 將含有所述融合蛋白的樣品依次流經(jīng)第一層析柱和第二層析柱。依照此方法，可 以一步獲得高純度的目的蛋白，大大節(jié)省了成本，并且避免了多種雜蛋白的產(chǎn)生。
[0009] 在一個優(yōu)選的實施方式中，所述酶為凝血酶、腸激酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰 蛋白酶。在實際操作中，可以根據(jù)這些酶的酶切位點來設(shè)計融合蛋白的結(jié)構(gòu)，以便能夠利用 上述酶有效切得目的蛋白。
[0010] 在一個進一步優(yōu)選的實施方式中，所述第一層析柱內(nèi)的介質(zhì)選自高交聯(lián)的瓊脂 糖、葡聚糖和纖維素中的一種。采用適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ軌驅(qū)⒚腹潭ǖ竭@些介質(zhì)上。
[0011] 在又一個優(yōu)選的實施方式中，所述第二層析柱選自用于純化含有標(biāo)簽蛋白的親和 層析填料、離子交換類填料和分子篩類填料中的一種。具體而言，第二層析柱內(nèi)的介質(zhì)的選 擇有幾種情況：
[0012] 當(dāng)融合蛋白表達時含有標(biāo)簽的，第二層析柱選擇用于純化標(biāo)簽蛋白的親和層析填 料，例如，純化his標(biāo)簽蛋白時，就選擇Ni親和填料，純化BMP標(biāo)簽蛋白時，選用Dextrin Sepharose系列的填料，純化Strep(II)標(biāo)簽蛋白時，選擇StrepTactin Sepharose系列填 料，純化GST標(biāo)簽蛋白時選用Glutathione Sepharose FF系列填料；
[0013] 當(dāng)融合蛋白表達沒有標(biāo)簽時，對融合蛋白、目的蛋白和酶切后的非目的蛋白部分 進行分析，當(dāng)目的蛋白等電點偏堿性，而全長融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等電點偏酸 性，則可以選擇陰離子交換系列介質(zhì)作為第二層析柱的介質(zhì)，（例如強陰離子交換Q sepharose系列、弱陰離子DEAE Sepharose FF);當(dāng)目的蛋白等電點偏酸性，而全長融合蛋 白和酶切后的非目的蛋白等電點偏堿性，則可以選擇陽離子交換系列介質(zhì)作為第二層析柱 的介質(zhì)（例如強陽離子層析介質(zhì)SP Sepharose系列和弱陽離子CMSepharoseFF)。
[0014] 當(dāng)酶切后的目的蛋白和融合蛋白分子量差異很大時，第二層析柱可以選擇分子篩 介質(zhì)，流動相經(jīng)過時，收集不同的組分(例如:Superdex系列和Sephacryl系列）。第一層析柱 中所述酶的固定在4±2°C，pH8-8.5條件下進行12-20小時，可以根據(jù)具體的酶和第一層析 柱的選擇具體優(yōu)化固定酶的條件，例如可優(yōu)選4°C，pH8.0，固定16小時。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種純化蛋白的試劑盒，包括第一層析柱和第二層析柱，其中第 一層析柱中的介質(zhì)固定有能夠從融合蛋白酶切得到目的蛋白的酶，第二層析柱中的介質(zhì)能 夠吸附所述融合蛋白被酶切后的非目的蛋白部分，并且不會吸附所述目的蛋白，所述試劑 盒在使用時依次串聯(lián)連接第一層析柱和第二層析柱。酶和層析柱可選的種類如上述方法中 所述。
[0016] 利用所述試劑盒可以實現(xiàn)上述純化方法，并且，對于特定的融合蛋白，有成套的層 析柱存在于試劑盒中，省略了制備上述特定層析柱的步驟，更進一步節(jié)省了純化的時間。
[0017] 本發(fā)明的純化方法相對于現(xiàn)有技術(shù)中的純化方法具有如下優(yōu)勢：1、提高酶切效 率，降低酶反應(yīng)時間，酶可以回收利用;2、酶經(jīng)過固定化，不會對后續(xù)工藝造成污染，無需增 加去除殘余酶步驟;3;酶切體系和串聯(lián)的層析柱平衡條件相同，減少了溶液種類和用量;4、 酶切后的柱層析采用穿透模式，目的蛋白直接從柱上流穿，整個純化工藝簡單緊湊。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明的示意性流程圖；
[0019] 圖2為示例性酶與介質(zhì)偶聯(lián)的化學(xué)方程式；
[0020] 圖3為本發(fā)明實施例1中酶切效率定量測量的結(jié)果，測定了實施例1的方法中不同 流速的酶切效果圖，其中各泳道說明如下:pre:酶切前；l、0.5ml/min流速柱上酶切，保留時 間lOmin; 2、lml/min流速柱上酶切，保留時間5min; 3、2ml/min流速柱上酶切，保留時間 2.5min;4、5ml/min流速柱上酶切，保留時間lmin;
[0021 ]圖4為實施例1中重復(fù)酶切效果圖，其中各泳道說明如下:pre:酶切前；1、酶切第一 次;2、酶切第2次;3、酶切第3次；
[0022] 圖5為實施例2中不同酶切時間的腸激酶酶切效果圖，各泳道說明如下：1、融合蛋 白、2、酶切時間1分鐘;3、酶切時間12分鐘;4、酶切時間10分鐘;5、酶切時間2分鐘;6、酶切時 間4分鐘;7、酶切時間6分鐘;8、酶切時間8分鐘；
[0023] 圖6為根據(jù)實施例3的凝血酶切柱和精純Q柱串聯(lián)純化后樣品的電泳圖；
[0024] 圖7為根據(jù)實施例4的腸激酶切柱和Ni柱串聯(lián)酶切純化效果圖，其中各泳道分別 為：1、分子量標(biāo)記;2、Ni洗脫雜峰;3、Ni柱穿透的目的蛋白l;4、Ni柱穿透的目的蛋白2;各條 帶成分:a、剩余的融合蛋白；b、GH目的蛋白；c、融合頭蛋白；
[0025] 圖8為PTH融合蛋白常規(guī)純化工藝和固定化酶切與陰離子串聯(lián)純化工藝流程圖對 比。
【具體實施方式】
[0026] 為了更詳細地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面通過【具體實施方式】示例性說明本發(fā) 明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，這些實施方式僅僅為說明本發(fā)明的實施，并不構(gòu)成對本發(fā)明的 保護范圍的限定。
[0027] 在蛋白質(zhì)工程化表達的現(xiàn)有技術(shù)中，能夠直接表達出目的蛋白，而不帶有其他雜 質(zhì)的情況很少，很多情況下通常是先表達出融合蛋白，然后通過酶切將融合蛋白上的非目 的蛋白部分酶切掉，再通過純化步驟得到目的蛋白。由于步驟繁瑣，不僅耗