本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中抗CTLA-4的納米抗體Nb91及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxicTlymphocyticassociatedantigen,CTLA-4/CTLA4)又名CD152，是一種白細(xì)胞分化抗原，是活化T細(xì)胞表面表達(dá)的一種跨膜糖蛋白分子，屬免疫球蛋白超家族成員，對T細(xì)胞增殖起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，在免疫應(yīng)答中起重要調(diào)節(jié)作用。CTLA-4Ig可在體內(nèi)外有效、特異地抑制細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，對移植排斥反應(yīng)、腫瘤及各種自身免疫性疾病有顯著的治療作用，毒副作用極低，是目前被認(rèn)為較有希望的新的免疫抑制藥物。抗體藥物應(yīng)用存在很多問題，比如研發(fā)周期長，生產(chǎn)成本過高；難以大規(guī)模生產(chǎn)；穩(wěn)定性差易降解，貯存成本高；容易被污染，維護(hù)成本費用高昂；并具有免疫原性等，限制了其在臨床上的應(yīng)用范圍。納米抗體技術(shù)，是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)家在傳統(tǒng)抗體的基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合納米粒子科學(xué)的概念進(jìn)行的抗體工程革命，從而研發(fā)出的最新和最小的抗體分子。1993年Hamers等報道，駱駝體內(nèi)存在著天然缺失輕鏈和重鏈恒定區(qū)1(CH1)的重鏈抗體，克隆其可變區(qū)得到只由一個重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，稱為VHH(variabledomainofheavychainofheavy-chainantibody)，現(xiàn)已被重新命名為“納米抗體”(nanobody，Nb)。納米抗體具有完整功能的最小的抗原結(jié)合片段，其晶體結(jié)構(gòu)呈橢圓形，直徑2.5nm，長4nm。Nb具有許多獨特的性質(zhì)，很適合進(jìn)行基因改造，在疾病的精確診斷和靶向治療等方面展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。納米抗體在化學(xué)組成和形狀上比抗體簡單許多，不具有化學(xué)疏水性，其抗熱性和抗酸堿性更強(qiáng)，更容易相互結(jié)合或與其他化合物結(jié)合，能被單基因編碼，容易用微生物合成。納米抗體對環(huán)境具有良好的耐受性，具備高度的構(gòu)象穩(wěn)定性，而且分子質(zhì)量更小，臨床的治療效果更好，同時這些小蛋白分子更容易合成，價格也更低。納米抗體的獨特的性質(zhì)，使其在疾病的精確診斷和免疫靶向治療等方面展現(xiàn)了更為廣闊的應(yīng)用前景。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何治療腫瘤。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了納米抗體。本發(fā)明所提供的納米抗體，其名稱為Nb91，包含決定簇互補(bǔ)區(qū)；所述Nb91的決定簇互補(bǔ)區(qū)由CDR1、CDR2和CDR3組成；所述CDR1的氨基酸序列為序列表中SEQIDNo.7的第26-32位氨基酸；所述CDR2的氨基酸序列為序列表中SEQIDNo.7的第48-55位氨基酸；所述CDR3的氨基酸序列為序列表中SEQIDNo.7的第94-106位氨基酸。上述納米抗體中，所述Nb91由所述決定簇互補(bǔ)區(qū)和框架區(qū)組成。上述納米抗體中，所述Nb91為下述a)或b)：a)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.7的第1-117位氨基酸的納米抗體；b)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.7的納米抗體。為了使所述Nb91便于純化，可在序列表中SEQIDNo.7的第1-117位氨基酸所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDLHA9YPYDVPDYA所述Nb91可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。所述Nb91的編碼基因可通過將序列表中SEQIDNo.8的第1-351位核苷酸或SEQIDNo.8所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。其中，SEQIDNo.8的第1-351位核苷酸編碼SEQIDNo.7的第1-117位氨基酸的納米抗體，SEQIDNo.8的第352-408位核苷酸編碼SEQIDNo.7的第118-136位氨基酸的納米抗體，SEQIDNo.8所示的DNA編碼SEQIDNo.7所示的納米抗體。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與所述Nb91相關(guān)的生物材料。本發(fā)明所提供的與所述Nb91相關(guān)的生物材料，為B1)至B12)中的任一種：B1)編碼所述Nb91的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；B4)含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物；B6)含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物；B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系；B10)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系；B11)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系；B12)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系。上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述生物材料中，B2)所述的含有編碼所述Nb91的核酸分子的表達(dá)盒(Nb91基因表達(dá)盒)，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)Nb91的DNA，該DNA不但可包括啟動Nb91基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止Nb91基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述Nb91基因表達(dá)盒的重組載體。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述重組載體可為將B1)所述核酸分子導(dǎo)入到pComb3中得到的重組載體。在本發(fā)明的一個實施例中，B3)所述重組載體為將所述Nb91的編碼基因(核苷酸序列為序列表中SEQIDNo.8的第1-351位核苷酸)導(dǎo)入pComb3中得到的重組載體pComb3-Nb91，重組載體pComb3-Nb91表達(dá)SEQIDNo.7所示的納米抗體Nb91。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌。上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞系不包括繁殖材料；所述重組微生物可為將B1)所述核酸分子導(dǎo)入到大腸桿菌WK6中得到的重組微生物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點突變的方法，對本發(fā)明的B1)所述Nb91的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明的B1)所述Nb91的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要編碼所述Nb91且具有Nb91活性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼SEQIDNo.7或SEQIDNo.7的第1-117位氨基酸所示的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機(jī)軟件進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述Nb91的CDR1的編碼序列為序列表中SEQIDNo.8的第75-96位核苷酸；所述Nb91的CDR2的編碼序列如序列表中SEQIDNo.8的第142-165位核苷酸；所述Nb91的CDR3的編碼序列為序列表中SEQIDNo.8的第280-318位核苷酸。上述生物材料中，B1)所述核酸分子為下述1)或2)或3)或4)：1)核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.8的cDNA分子或DNA分子；2)核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.8的第1-351位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；3)與1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述Nb91的cDNA分子或基因組DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述Nb91的cDNA分子或基因組DNA分子。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述Nb91的衍生抗體。本發(fā)明所提供的所述Nb91的衍生抗體，為下述a)或b)或c)或d)或e)：a)含有所述Nb91的單鏈抗體；b)含有a)所述單鏈抗體的融合抗體；c)含有所述Nb91的融合抗體；d)含有所述Nb91的Fab；e)含有所述Nb91的完整抗體。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述Nb91的制備方法。本發(fā)明所提供的所述Nb91的制備方法，包括將編碼所述Nb91的核酸分子導(dǎo)入受體細(xì)胞得到表達(dá)所述Nb91的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，得到所述Nb91。上述Nb91的制備方法中，所述編碼所述Nb91的核酸分子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.8的第1-351位核苷酸或SEQIDNo.8所示。上述Nb91的制備方法中，所述受體細(xì)胞可為微生物細(xì)胞，如大腸桿菌，具體可為大腸桿菌WK6。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述A1-A12中的任一種用途：A1、所述Nb91在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用；A2、所述生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用；A3、所述納米抗體的衍生抗體在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用；A4、所述Nb91的制備方法在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用；A5、所述Nb91在制備抑制CTLA-4活性或促進(jìn)T細(xì)胞增殖產(chǎn)品中的應(yīng)用；A6、所述生物材料在制備抑制CTLA-4活性或促進(jìn)T細(xì)胞增殖產(chǎn)品中的應(yīng)用；A7、所述衍生抗體在制備抑制CTLA-4活性或促進(jìn)T細(xì)胞增殖產(chǎn)品中的應(yīng)用；A8、所述Nb91的制備方法在制備抑制CTLA-4活性或促進(jìn)T細(xì)胞增殖產(chǎn)品中的應(yīng)用；A9、所述Nb91在制備與CTLA-4結(jié)合產(chǎn)品中的應(yīng)用；A10、所述生物材料在制備與CTLA-4結(jié)合產(chǎn)品中的應(yīng)用；A11、所述衍生抗體在制備與CTLA-4結(jié)合產(chǎn)品中的應(yīng)用；A12、所述Nb91的制備方法在制備與CTLA-4結(jié)合產(chǎn)品中的應(yīng)用。上述產(chǎn)品可為藥物。擴(kuò)增編碼序列表中SEQIDNo.7所示的氨基酸序列或其任一片段氨基酸序列的核酸分子的引物對，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明公開了針對于CTLA-4多肽分子抗原表位的一種納米抗體(Nb91)，同時還公布了編碼該納米抗體的基因序列以及能夠表達(dá)該納米抗體的宿主細(xì)胞。通過本發(fā)明所公布的納米抗體基因序列及宿主細(xì)胞，該納米抗體(Nb91)能夠在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)，可以與T細(xì)胞及CTLA-4結(jié)合，可應(yīng)用于CTLA-4分子檢測試劑的研發(fā)，制備腫瘤抑制劑或腫瘤細(xì)胞抑制劑以及制備抑制CTLA-4活性和促進(jìn)T細(xì)胞增殖的藥物。附圖說明圖1為納米抗體Nb16的SDA-PAGE電泳圖。其中，泳道M表示蛋白分子量Marker。圖2為納米抗體Nb30的SDA-PAGE電泳圖。其中，泳道M表示蛋白分子量Marker。圖3為納米抗體Nb36的SDA-PAGE電泳圖。其中，泳道M表示蛋白分子量Marker。圖4為納米抗體Nb91的SDA-PAGE電泳圖。其中，泳道M表示蛋白分子量Marker。圖5為納米抗體Nb16與抗原的結(jié)合實驗結(jié)果。圖6為納米抗體Nb30與抗原的結(jié)合實驗結(jié)果。圖7為納米抗體Nb36與抗原的結(jié)合實驗結(jié)果。圖8為納米抗體Nb91與抗原的結(jié)合實驗結(jié)果。圖5-圖8中，CTLA-4mAb表示PEmouseanti-humanCD152。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的大腸桿菌WK6(Yanetal.,CharacterizationandapplicationsofNanobodiesagainsthumanprocalcitoninselectedfromanovelNanobodyphagedisplaylibrary，JournalofNanobiotechnology(2015)13:33)經(jīng)東南大學(xué)生命科學(xué)研究院萬亞坤實驗室同意后，公眾可從廣西醫(yī)科大學(xué)獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。實施例1、納米抗體的制備本發(fā)明提供了來源于駱駝的四種納米抗體，其名稱分別為Nb16、Nb30、Nb36和Nb91。其中，Nb16的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示，由SEQIDNo.2的核苷酸序列編碼；Nb30的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示，由SEQIDNo.4的核苷酸序列編碼；Nb36的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.5所示，由SEQIDNo.6的核苷酸序列編碼；Nb91的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.7所示，由SEQIDNo.8的核苷酸序列編碼。將載體pComb3(Biovector產(chǎn)品)的PstI和NotI識別序列間的DNA片段替換為SEQIDNo.2所示的DNA分子，其他序列均不變，得到重組載體pComb3-Nb16，pComb3-Nb16與pComb3的差別僅在于將pComb3的PstI和NotI識別序列間的DNA片段替換為SEQIDNo.2所示的DNA分子。重組載體pComb3-Nb16表達(dá)SEQIDNo.1所示的納米抗體Nb16。將pComb3-Nb16導(dǎo)入大腸桿菌WK6中，得到重組菌WK6-pComb3-Nb16。將載體pComb3(Biovector產(chǎn)品)的PstI和NotI識別序列間的DNA片段替換為SEQIDNo.4所示的DNA分子，其他序列均不變，得到重組載體pComb3-Nb30，pComb3-Nb30與pComb3的差別僅在于將pComb3的PstI和NotI識別序列間的DNA片段替換為SEQIDNo.4所示的DNA分子。重組載體pComb3-Nb16表達(dá)SEQIDNo.3所示的納米抗體Nb30。將pComb3-Nb30導(dǎo)入大腸桿菌WK6中，得到重組菌WK6-pComb3-Nb30。將載體pComb3(Biovector產(chǎn)品)的PstI和NotI識別序列間的DNA片段替換為SEQIDNo.6所示的DNA分子，其他序列均不變，得到重組載體pComb3-Nb36，pComb3-Nb36與pComb3的差別僅在于將pComb3的PstI和NotI識別序列間的DNA片段替換為SEQIDNo.6所示的DNA分子。重組載體pComb3-Nb36表達(dá)SEQIDNo.5所示的納米抗體Nb36。將pComb3-Nb36導(dǎo)入大腸桿菌WK6中，得到重組菌WK6-pComb3-Nb36。將載體pComb3(Biovector產(chǎn)品)的PstI和NotI識別序列間的DNA片段替換為SEQIDNo.8所示的DNA分子，其他序列均不變，得到重組載體pComb3-Nb91，pComb3-Nb91與pComb3的差別僅在于將pComb3的PstI和NotI識別序列間的DNA片段替換為SEQIDNo.8所示的DNA分子。重組載體pComb3-Nb91表達(dá)SEQIDNo.7所示的納米抗體Nb91。將pComb3-Nb91導(dǎo)入大腸桿菌WK6中，得到重組菌WK6-pComb3-Nb91。納米抗體的具體制備步驟如下：(1)將WK6-pComb3-Nb16涂布在含有氨芐青霉素和葡萄糖的LB平板(LB平板中，氨芐青霉素和葡萄糖的濃度分別為100μg/mL和20mg/mL)上，37℃培養(yǎng)過夜(12小時)；(2)挑選單個菌落接種在5mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液(LB培養(yǎng)液中，氨芐青霉素的濃度為100μg/mL)中，37℃搖床培養(yǎng)過夜(12小時)；(3)取1mL步驟(2)培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)液接種至330mLTB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.6-1時，加入IPTG，得到WK6-pComb3-Nb16培養(yǎng)液，使WK6-pComb3-Nb16培養(yǎng)液中IPTG的濃度為1mM，將WK6-pComb3-Nb16培養(yǎng)液在28℃下于搖床(搖床的轉(zhuǎn)速為220rpm)上培養(yǎng)過夜(12小時)，得到WK6-pComb3-Nb16誘導(dǎo)液；(4)將步驟(3)的WK6-pComb3-Nb16誘導(dǎo)液于4℃下離心，收集菌體；(5)利用文獻(xiàn)(ZhuM,HuY,LiG,OuW,MaoP,XinS,WanY:CombiningmagneticnanoparticlewithbiotinylatednanobodiesforrapidandsensitivedetectionofinfluenzaH3N2.NanoscaleResLett2014,9:528.)中的滲透法，獲得抗體粗提液；(6)利用文獻(xiàn)(ZhuM,HuY,LiG,OuW,MaoP,XinS,WanY:CombiningmagneticnanoparticlewithbiotinylatednanobodiesforrapidandsensitivedetectionofinfluenzaH3N2.NanoscaleResLett2014,9:528.)中的鎳柱離子親和層析法制備納米抗體Nb16。按照上述步驟(1)-(6)的方法，分別將WK6-pComb3-Nb16替換為WK6-pComb3-Nb30、WK6-pComb3-Nb36和WK6-pComb3-Nb91，其他步驟均不變，分別得到納米抗體Nb30、Nb36和Nb91。納米抗體Nb16、Nb30、Nb36和Nb91的SDA-PAGE電泳圖分別如圖1、圖2、圖3和圖4所示。結(jié)果顯示，上述方法得到的納米抗體Nb16、Nb30、Nb36和Nb91的純度均達(dá)到90％以上。實施例2、納米抗體與CTLA-4結(jié)合率的測定一、納米抗體與CTLA-4結(jié)合率測定(直接法)從健康志愿者人外周血細(xì)胞中分離T細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔板中，將10μg/mLPHA(sigma，L9017)加入T細(xì)胞中共培養(yǎng)72h后，將實施例1的Nb16(1μg)加入1×106個上述T細(xì)胞中4℃避光孵育30min，PBS洗滌三次后，加入1μgPEanti-HAtagantibody(abcam，Clone:16B12)4℃孵育30min，PBS洗滌三次后，將樣品上BACKMAN流式細(xì)胞儀，結(jié)果如圖5中A所示。按照上述方法，將Nb16分別替換為Nb30、Nb36和Nb91，其他步驟均不變，得到Nb30、Nb36和Nb91與CTLA-4的結(jié)合結(jié)果，分別如圖6中A、圖7中A、圖8中A所示。二、納米抗體與CTLA-4結(jié)合率測定(競爭法)1、從健康志愿者人外周血細(xì)胞中分離T細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔板中，將10μg/mlPHA(sigma，L9017)加入T細(xì)胞中共培養(yǎng)72h，得到PHA刺激的T細(xì)胞。2、將PEmouseanti-humanCD152(BDClone:BNI3)(20μl)與1×106個上述T細(xì)胞4℃避光孵育30min，PBS洗滌三次后，將樣品上BACKMAN流式細(xì)胞儀。3、將實施例1的Nb16(1μg)與PEmouseanti-humanCD152(BDClone:BNI3)(20μl)4℃避光孵育30min，然后將該混合物與步驟1的1×106個PHA刺激的T細(xì)胞4℃避光孵育30min，PBS洗滌三次后，將樣品上BACKMAN流式細(xì)胞儀。結(jié)果如圖5中B所示。按照上述方法，將Nb16分別替換為Nb30、Nb36和Nb91，其他步驟均不變，得到Nb30、Nb36和Nb91與CTLA-4的結(jié)合結(jié)果，分別如圖6中B、圖7中B、圖8中B所示。結(jié)果表明，納米抗體Nb16、Nb30、Nb36和Nb91均可以與T細(xì)胞及CTLA-4結(jié)合。當(dāng)前第1頁1 2 3