1.1.世界研究現(xiàn)狀

最近“人豬嵌合胚胎”的新聞轟動世界，但本發(fā)明認為該技術(shù)路線不可行。

曾溢滔院士和黃淑幀教授課題組：首次將人的造血干細胞移植到山羊身上，登上2006年美國科學院報(PNAS同《科學》和《自然》雜志齊名)。據(jù)課題組介紹，美國科學家將人胎肝造血干細胞通過開腹后宮內(nèi)移植方法，移植到胎齡為49～54天的胎綿羊體內(nèi)，建立了人/綿羊異種移植嵌合體，移植的干細胞可以在山羊體內(nèi)存活2年之久。也有科研人員將人可無限增值的癌細胞已同樣方法試驗，但隨著動物免疫系統(tǒng)逐漸完善，癌細胞全部死亡。

本人也曾在90年代從事了先天免疫耐受的實驗，并申請過專利說明書中有這樣一段話……以求形成徹底的天然免疫耐受，導(dǎo)入兔子胚胎的正常細胞懸液可采用微型注射器，并在B超的監(jiān)視下進行。我這段話的目的在告訴從事胚胎期先天免疫耐受的科研工作者，我們都犯了一個大錯誤，異種細胞或異種抗原是不可能在羊或豬的胚胎內(nèi)建立起真正的天然免疫耐受機制的。

理論和實踐顯示外來抗原在動物胚胎期有的能夠建立天然免疫耐受，有的則不能。似乎與動物胚胎“自我”抗原的模擬度有關(guān)。為此早在2001年我就與所崇敬的知識淵博的著名老一輩免疫學家余傳霖老師通過書信往來，在余老師鐵血的事實根據(jù)面前，最終確認動物胚胎期攝取動物胚胎“自身”抗原的APC細胞，存在著“自我”識別受體這一事實，這一發(fā)現(xiàn)表明動物胚胎期“自我”識別機制的建立，是通過“自我”識別受體的功能完成對“自身”抗原的檢測和呈遞，完成天然免疫耐受的。異種抗原不能通過“自我”識別受體被動物胚胎期APC細胞所攝取和呈遞的。也就是說外來抗原是很難在動物體內(nèi)建立類似“自我”天然免疫耐受的。遺憾的是有關(guān)動物胚胎期建立天然免疫耐受途徑， 這一有重大缺陷的理論一直應(yīng)用和影響到今天，這說明理論研究的滯后對科研研究的影響。

1.1.1.結(jié)論：

(1)本發(fā)明認為理論和時間表明“種抗原”是“天然免疫耐受”的分界線。

(2)如果將人的待移植器官細胞轉(zhuǎn)換成豬或羊自身抗原，就可以在豬或羊身上真正“種”出異種器官。

1.2.本發(fā)明理論依據(jù)：

1.2.1.抗體獨特型與抗獨特型抗體模擬抗原理論

數(shù)字龐大的Id或AId抗體可以摸擬整個外來抗原世界，這是構(gòu)建“Ab2β抗體庫”的主要理論基礎(chǔ)。利用這一理論，特別是通過創(chuàng)造性應(yīng)用相關(guān)理論和免疫學實驗技術(shù)，就可以制備模擬本發(fā)明人肝臟細胞膜表面全部抗原分子的易接觸的空間結(jié)構(gòu)，的全部Ab2β抗體。

1.2.2.天然免疫耐受理論

1.2.2.1.在免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟前如胚胎期接觸某種抗原，出生后當再次遇到相同抗原時，表現(xiàn)對該抗原的特異性無反應(yīng)性，稱天然免疫耐受。其中中樞耐受：指胚胎期及出生后，T和B細胞未成熟時遇到自身抗原所形成的耐受。

1.2.2.2.大量試驗證明同種外來抗原在動物胚胎期能夠建立天然免疫耐受(即“自我與非我”識別系統(tǒng))，原因存在種抗原的“自我識別受體”。

1.2.3多態(tài)性MHC免疫識別理論

多態(tài)性MHC的生物學功能和意義，決定了同種動物不同品系特別是某些品系動物具有更廣和更深的免疫識別功能，應(yīng)用多態(tài)性MHC免疫識別理論，就是為最大限度增加免疫識別能力，并以此制備模擬靶細胞膜表面全部抗原的Ab2β抗體，構(gòu)建Ab2β抗體庫。多態(tài)性MHC免疫識別理論同樣是構(gòu)建“Ab2β抗體庫”的 重要理論基礎(chǔ)。

1.2.4.模擬人肝臟細胞表面抗原所需要的“Ab2β抗體”

本發(fā)明相對于人民衛(wèi)生出版社教科書《天然自身抗體》所闡述：“現(xiàn)代研究庫容量10的7次方可覆蓋百分之99％自身抗原決定基，庫容量超過10的8次方可得到相對親和力較高自身抗體”?？勺鳛閷嶒瀰⒖?。

1.2.5.不同分子生態(tài)環(huán)境對同一個體或不同個體免疫系統(tǒng)的影響

提出這個理論旨在說明僅與本發(fā)明相關(guān)的認識，即經(jīng)過特定抗原免疫和未經(jīng)過特定抗原免疫的同一個體或同一品系動物，除反應(yīng)性和親和力以及抗體效價區(qū)別之外，未必經(jīng)過特定抗原免疫的抗血清就是所需抗特定抗原特定表位的抗體(如腫瘤細胞免疫)，而且識別抗原表位有限，原因在于優(yōu)勢克隆的作用。那么未經(jīng)過特定抗原免疫的同一個體或同一品系動物的血清抗體，則可能識別更多抗原表位這也是區(qū)別。那么不同分子生態(tài)環(huán)境針對不同個體免疫系統(tǒng)的影響則更大。其理論豐富而復(fù)雜，但其相互作用機制都遵循和符合我們?nèi)庋鬯姷降拇笞匀谎莼?guī)律如各種物質(zhì)(包括人)之間相互作用機制。這就是本發(fā)明即采用經(jīng)過免疫的抗血清又采用未經(jīng)過免疫的血清的原因。

1.2.6.有關(guān)本發(fā)明自命標題“Ab2β抗體庫”的相關(guān)理論問題

本發(fā)明提出這個理論問題的目的在于，(1).有的教科書根據(jù)Id與抗Id的血清學反應(yīng)和Ab2功能把Ab2分為α、β、γ和ε四種；也有的教科書直接把Ab2分為Ab2α和Ab2β兩種。本發(fā)明采用后一種教科書Ab2分型模式，即抗Ab1V區(qū)抗原結(jié)合部位即互不決定區(qū)(CDR)的抗體統(tǒng)稱Ab2β抗體，實際包括Ab2β抗體和Ab2γ抗體，原因在于這樣可以使本發(fā)明說明書標題和內(nèi)容簡單化，易理解不易混淆而且更加說明問題。(2).抗Id抗體模擬抗原的模式包 括：高變抗Id區(qū)與抗原間的同源性和基于拓撲相似性的模擬。而且結(jié)構(gòu)上的模擬與功能模擬是一致的，如Ab1的相同表面可與兩種無關(guān)的結(jié)構(gòu)結(jié)合，另外模擬的程度也有完全性模擬和部分模擬之分別。(3).針對抗原結(jié)合部位的AId抗體稱為Ab2γ型，其中有一類抗體能模擬外來抗原(內(nèi)在影像)稱為Ab2β型。(4).Ab2γ型和Ab2β型都能抑制抗原與抗原受體的結(jié)合。

1.2.7.最關(guān)鍵理論：在免疫系統(tǒng)的胚胎發(fā)育期，Aid就能引起免疫耐受《抗體分子與腫瘤》71頁……。

1.3.實驗方案

1.3.1.第一階段試驗

1.3.1.1.選擇純系母豬制備抗人肝臟細胞膜表面不同抗原表位的Ab1抗體。通過如下兩種途徑：

1.3.1.1.1.應(yīng)用保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人肝臟細胞和相應(yīng)腫瘤細胞(包括相應(yīng)永生化細胞)，分別免疫若干只同一純品系母豬，從中分別提取抗人血清和其純化的總抗體。然后應(yīng)用人肝臟細胞分別與這些抗人血清和其純化的總抗體相互作用，接著以人肝臟細胞吸附其中抗體，即抗人肝臟細胞抗體，并采用常規(guī)免疫學實驗技術(shù)或新方法提取和純化這些抗體，本發(fā)明把這些專一抗人肝臟細胞的抗體稱免疫“Ab1抗體”。

1.3.1.1.2.應(yīng)用保有天然正確空間結(jié)構(gòu)的人肝臟細胞分別與上述未經(jīng)免疫的同一純品系母豬的血清和其血清中提取純化的總抗體相互作用，接著以人肝臟細胞細胞吸附其中抗體，即抗人肝臟細胞的抗體，并采用常規(guī)免疫學實驗技術(shù)或新方法提取和純化這些抗體，本發(fā)明把這些專一抗人肝臟細胞的抗體稱天然“Ab1抗體”。

1.3.2.第二階段試驗

1.3.2.1.構(gòu)建模擬人肝臟細胞膜表面不同抗原表位的“Ab2β抗體庫”

1.3.2.1.1.專一篩選結(jié)合“Ab1抗體”的同種不同品系的豬“Ab2β抗體”

試驗步驟(1).應(yīng)用常規(guī)免疫學實驗技術(shù)，分別提取純化同種大量不同品系豬的總B細胞。(2).通過本發(fā)明簡單的、獨創(chuàng)性免疫學新試驗技術(shù)，將(1)提取的豬總B細胞與第一階段試驗獲得的免疫和天然“Ab1抗體”，通過兩者之間的相互作用，即從這些B細細中完全清除掉與“Ab1抗體”本身的抗原結(jié)合部位不能結(jié)合的任何無關(guān)的B細胞，目的是保留其它剩余的與本發(fā)明相關(guān)的B細胞。(3).將保留的與本發(fā)明相關(guān)的B細胞與“Ab1抗體”混合，再通過流式細胞術(shù)(FCM)或免疫磁珠技術(shù)，篩選出專一結(jié)合“Ab1抗體”的B細胞，即本發(fā)明所需的“Ab2β抗體”產(chǎn)生細胞。特別說明的是“Ab1抗體”本身既是抗體又是抗原，在免役學理論與實際結(jié)合中不能忘記這一點，否則不能理解本試驗——如何專一篩選出結(jié)合“Ab1抗體”的Ab2β抗體產(chǎn)生細胞。

1.3.2.1.2.制備“Ab2β抗體庫”的三條途徑

第一條途徑：將能夠與Ab1抗體抗原結(jié)合部位結(jié)合的B細胞進行體外培養(yǎng)，在特定的不同時間內(nèi)，將體外培養(yǎng)的B細胞，通過噬菌體抗體庫技術(shù)，制備和構(gòu)建成模擬人肝臟細胞膜表面抗原，來自豬源的噬菌體“Ab2β抗體庫”。

第二條途徑：將能夠與Ab1抗體抗原結(jié)合部位結(jié)合的B細胞進行體外培養(yǎng)，在特定的不同時間內(nèi)，將體外培養(yǎng)的B細胞，通過體外培養(yǎng)B細胞技術(shù)，制備和構(gòu)建成模擬人肝臟細胞膜表面抗原，獲得來自豬源分泌性“Ab2β抗體庫”。

第三條途徑：應(yīng)用前二條途徑的方法和理論，制備來自豬源的各種工程Ab2β抗體庫”。

三條途徑盡可能獲得純系豬免疫系統(tǒng)模擬人肝臟細胞膜表面不同蛋白分子不同表位的全部“Ab2β抗體”，并以此構(gòu)建初級“Ab2β抗體庫”。

1.3.2.2.驗證初級“Ab2β抗體庫”的功能和效果

利用競爭性抑制試驗：如ELISA和流式細胞術(shù)等試驗，通過觀察Ab2β抗體競爭性抑制肝臟細胞與Ab1抗體結(jié)合的能力來進行判定。

1.3.3.第三階段試驗

1.3.3.1.理論和實踐證明：在免疫系統(tǒng)的胚胎發(fā)育期，Aid就能引起免疫耐受。

1.3.3.2.應(yīng)用上述選擇的特定純系已經(jīng)懷孕母豬，在其胚胎特定時間里，將獲得的“Ab2β抗體”，通過如下兩條途徑導(dǎo)入母豬胚胎：

第一條途徑：在豬母體胚胎，特定時間妊娠內(nèi)，在B超監(jiān)視下，將混合Ab2β抗體的人臍血造血干細胞注射到胚胎腹腔內(nèi)。

第二條途徑：將獲得的“Ab2β抗體”，注射到特定純系已經(jīng)懷孕母豬的血管內(nèi)，“Ab2β抗體”將通過母體胎盤進入母體胚胎。

1.4.預(yù)期結(jié)果：

1.4.1.在豬母體胎兒出生并長大后，由于人肝臟細胞膜表面不同抗原，被純系豬免疫系統(tǒng)識別為自身抗原而不會遭受免疫排斥。因此，成為唯一真正可在特定豬體內(nèi)生長的人豬嵌合肝臟器官供人類器官移植用。

1.4.2.人豬嵌合肝臟器官在移植人體后，豬肝臟細胞會被人免疫系統(tǒng)識別和消滅，其空缺將被人肝臟細胞取而代之，成為真正的人肝臟。