一種重組β-hNGF-Fc融合蛋白、制備方法及用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組β?hNGF?Fc融合蛋白、制備方法及用途。其依次由人βNGF、短肽接頭和人IgG Fc所示氨基酸序列組成。所述重組β?hNGF?Fc融合蛋白在摩爾基礎(chǔ)上，具有與人NGF相當(dāng)或更高的體外生物活性。本發(fā)明還保護(hù)含有所述重組β?hNGF?Fc融合蛋白的重組子和細(xì)胞株，具有用于周圍神經(jīng)病變、神經(jīng)損傷的恢復(fù)及神經(jīng)生長(zhǎng)因子長(zhǎng)效化應(yīng)用的用途。
【專利說(shuō)明】
一種重組β-hNGF-Fc融合蛋白、制備方法及用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及重組生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)計(jì)一種重組β-hNGF-Fc融合蛋白、制備方法 及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)作用廣泛，其中β亞單位是NGF的活性區(qū)。目前商品化的β-mNGF 如恩經(jīng)復(fù)?>(Ν0ΒΕΧ)，是從成年雄性小鼠頌下腺分離和純化獲得。廣泛應(yīng)用于眼科、神經(jīng)外 科、骨科、神經(jīng)內(nèi)科、兒科、內(nèi)分泌科神經(jīng)萎縮、神經(jīng)變性、外傷修復(fù)等疾病的治療。正因?yàn)樽?射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的需求不斷增長(zhǎng)，而今的NGF產(chǎn)品具有兩點(diǎn)潛在的缺陷：1、由于是鼠源 蛋白質(zhì)，其具有潛在的免疫原性;2、需要大量的合格的雄性小鼠頌下腺，這成了保證產(chǎn)量需 求的一大瓶頸。而通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)（如E.coli)重組表達(dá)NGF，具有無(wú)法進(jìn)行蛋白翻譯后修 飾的缺點(diǎn)。
[0003] 通常所說(shuō)的β-hNGF是118個(gè)氨基酸成熟肽。在人體內(nèi)，β-NGF的表達(dá)有下列過(guò)程:1. β-NGF編碼序列（723bp)翻譯為prepr〇-hNGF(241aa)，包括信號(hào)肽（l-18aa)、導(dǎo)肽（19-121aa)、成熟肽（122-241aa);2。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，信號(hào)肽被水解，形成pro-hNGF，包括導(dǎo)肽與成熟 肽。導(dǎo)肽末端有4個(gè)氨基酸殘基（118-121aa)Arg-Ser-Lys-Arg，為哺乳動(dòng)物前提蛋白加工酶 識(shí)別位點(diǎn)，導(dǎo)肽在高爾基體中被前體蛋白加工酶水解，形成hNGF(120aa); 3.hNGF在7S hNGF 中γ亞基作用下切除C端的ArgAla形成成熟肽（118aa)。
[0004] IgG類的免疫球蛋白是人體內(nèi)豐富的蛋白質(zhì)。其體內(nèi)半衰期可高達(dá)21天。已有許多 將IgGde Fc區(qū)域與其他蛋白質(zhì)結(jié)合成融合蛋白從而提高半衰期的報(bào)導(dǎo)。原型融合蛋白通過(guò) IgG Fc鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基連接為二聚體，是蛋白質(zhì)類似于IgG分子。Fc融合蛋白在體內(nèi) 表現(xiàn)出同種類型人IgG相當(dāng)?shù)捏w內(nèi)外外物動(dòng)力學(xué)特征。這種方法已用于一些臨床上很重要 的細(xì)胞因子(如IL-2)。
[0005] 在NGF臨床應(yīng)用中，存在著注射部位疼痛或注射測(cè)下肢疼痛的不良反應(yīng)，這與NGF 參與疼痛神經(jīng)反應(yīng)有關(guān)。因此開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效化NGF，減少患者給藥次數(shù)與頻率，有利于緩解患者 的不良反應(yīng)。綜上所述，開(kāi)發(fā)重組人β神經(jīng)生長(zhǎng)因子Fc融合蛋白的制備方法，具有重要的臨 床價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種與人NGF相當(dāng)或更高的體外生物活性的重組β-hNGF-Fc融合蛋白。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種重組β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述重 組β-hNGF-Fc融合蛋白依次由人0NGF、短肽接頭和人IgG Fc所示氨基酸序列組成。
[0008] 進(jìn)一步，所述短肽接頭序列為不多于20個(gè)氨基酸的序列;優(yōu)選的，所述短肽接頭含 有甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸中至少兩個(gè)氨基酸的序列；更優(yōu)選的，所述短肽接頭序 列為賴氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-纈 氨酸-谷氨酸所示序列。
[0009] 進(jìn)一步，所述的人IgG Fc片段含人IgG鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。
[0010]進(jìn)一步，所述融合蛋白所示序列如SEQ ID N0:1所示;優(yōu)選的，所述融合蛋白所對(duì) 應(yīng)的核酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0011] 進(jìn)一步，所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白在摩爾基礎(chǔ)上，具有與人NGF相當(dāng)或更高的 體外生物活性。
[0012 ]本發(fā)明還提供一種重組子，其特征在于，含有所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白序列。
[0013] 本發(fā)明還提供一種細(xì)胞株，其特征在于，含有權(quán)利要求6所述重組子。
[0014] 進(jìn)一步，所述細(xì)胞株為哺乳動(dòng)物細(xì)胞株;優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞株為CH0細(xì)胞 衍生的細(xì)胞株。
[0015] 本發(fā)明還提供一種重組β-hNGF-Fc融合蛋白制備方法，其特征在于，所述方法包 括:構(gòu)建含β-hNGF-Fc融合蛋白的重組表達(dá)載體；
[0016] 將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并篩選高效穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株；
[0017] 發(fā)酵培養(yǎng)所得高效穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，收集培養(yǎng)液并純化細(xì)胞分泌出的β-hNGF-Fc融合蛋白。
[0018] 進(jìn)一步，所述β-hNGF-Fc的蛋白序列如SEQ ID NO: 1所示，優(yōu)選的，所對(duì)應(yīng)的β-hNGF-Fc核酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0019] 進(jìn)一步，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CH0細(xì)胞、人ΝΙΗ293細(xì)胞、COS細(xì)胞或MDCK細(xì)胞及它們 的衍生細(xì)胞系。
[0020] 所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白，所述重組子或所述細(xì)胞株用于周圍神經(jīng)病變、神經(jīng) 損傷的恢復(fù)及神經(jīng)生長(zhǎng)因子長(zhǎng)效化應(yīng)用的用途。
[0021] hNGF-hFc融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。其中l(wèi)-18aa為信號(hào)肽，19-121aa為前導(dǎo)肽，122-239aa為成熟肽，240-251aa為連接短肽，252-478aa為人IgG Fc片段， 其中252-270aa為鉸鏈區(qū)，271-376aa為CH2區(qū)，377-478aa為CH3區(qū)。經(jīng)重組分泌表達(dá)獲得的 hNGF-hFc融合蛋白結(jié)構(gòu)為成熟肽-連接短肽-hFc。所對(duì)應(yīng)的核酸序列如SEQ ID N0:2所示， 其中l(wèi)-54bp為hNGF信號(hào)肽序列；55-363bp為hNGF導(dǎo)肽序列；364-717bp為hNGF成熟肽序列； 718-753bp為連接短肽序列，該序列為賴氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘 氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-纈氨酸-谷氨酸;754-1437bp為hlgG Fc段序列。
[0022]人NGF在體內(nèi)以前體的形式合成，包括信號(hào)肽、前導(dǎo)肽和成熟肽。前導(dǎo)肽在NGF的表 達(dá)、折疊、分泌中起到了重要作用。前導(dǎo)肽中有兩個(gè)保守區(qū)域?yàn)镹GF表達(dá)、酶解形成成熟肽以 及分泌所必須的。研究證明，前導(dǎo)肽在NGF折疊過(guò)程中，起到了分子內(nèi)分子伴侶的作用，有助 于NGF的正確折疊。前導(dǎo)肽包含潛在的N糖基化位點(diǎn)，N糖基化修飾后，有助于NGF轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)。因而與直接表達(dá)成熟hNGF序列相比，本發(fā)明中添加前導(dǎo)肽序列將利于hNGF的外源重組 表達(dá)，促進(jìn)蛋白進(jìn)行正確的表達(dá)后折疊、修飾及分泌，形成具有生物學(xué)活性的成熟hNGF。
[0023]人免疫球蛋白的Fc區(qū)域在免疫反應(yīng)中起到重要作用。IgG的效應(yīng)子功能由Fc介導(dǎo) 的兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn):1.結(jié)合細(xì)胞表面Fc受體(FcgRs)，引起抗體依賴的細(xì)胞毒性作用(ADCC)途 徑，由殺傷細(xì)胞通過(guò)吞噬作用或裂解作用而攝食病原體;2.與第一補(bǔ)體成分C1的Clq部分結(jié) 合，引發(fā)依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性（CDC)途徑，從而裂解病原體。在IgG四種亞型中，IgGl和 IgG3能有效地結(jié)合FcgR，IgG4與FcgR的親和力比IgGl或3低一個(gè)數(shù)量級(jí)，IgG2則不結(jié)合 FcgR。人IgGl和3可有效結(jié)合Clq，并激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而IgG2對(duì)補(bǔ)體的結(jié)合作用很弱， IgG4不激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。hNGF-hFc用于人體治療時(shí)，其與受體結(jié)合時(shí)，應(yīng)避免較強(qiáng)的免疫 效應(yīng)子作用而引起的細(xì)胞裂解。故本發(fā)明中，經(jīng)比對(duì)IgG四種亞型序列，設(shè)計(jì)了一種來(lái)自人 IgG2及IgG4的混合人IgG Fc序列，用于減弱其免疫效應(yīng)子作用。該序列混合了人IgG2的鉸 鏈區(qū)及IgG4的CH2區(qū)和CH3區(qū)序列，并進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。
[0024]本發(fā)明其中一實(shí)施例顯示β-hNGF-Fc具有比hNGF更強(qiáng)的體外穩(wěn)定性，提示其具有 長(zhǎng)效化應(yīng)用的潛力。
[0025]本發(fā)明提供一種重組人β神經(jīng)生長(zhǎng)因子Fc融合蛋白（β-hNGF-Fc)的制備方法，其特 征在于，包括如下步驟：
[0026] 1)表達(dá)載體的構(gòu)建：
[0027] 可使用多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，表達(dá)載體中包含以下可操作性相連的元件： 啟動(dòng)子、外源序列插入位點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因。優(yōu)選的，啟動(dòng)子與插入片段間包含增強(qiáng)子或內(nèi) 含子等調(diào)控原件，以增強(qiáng)插入片段的表達(dá)。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、 RSV啟動(dòng)子或SV40啟動(dòng)子中的任意一種及它們的衍生啟動(dòng)子，用于啟動(dòng)β-hNGF-Fc與篩選標(biāo) 記基因的表達(dá)。所述篩選標(biāo)記基因?yàn)槎淙~酸還原酶(DHFR)基因、谷氨酰胺合成酶(GS)基 因和抗生素抗性基因（新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、博來(lái)霉素抗性基因或多色霉素 抗性基因）中的任意一種。
[0028] 人工合成β-hNGF-Fc序列，插入表達(dá)載體得到融合蛋白表達(dá)載體。插入方式可為限 制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的克隆、TA克隆、非依賴性克隆(Ligase IndependnetClone)。
[0029] 獲得的重組融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入E.coli T0P10,挑取陽(yáng)性克隆，PCR鑒定、質(zhì) 粒酶切鑒定和測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。鑒定獲得的陽(yáng)性克隆凍存于15%甘油中。
[0030] 2)工程細(xì)胞株的構(gòu)建；
[0031] 可使用多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。優(yōu)選地，所述細(xì)胞系為中國(guó)倉(cāng)鼠 CH0細(xì)胞、人NIH293 細(xì)胞、C0S細(xì)胞或MDCK細(xì)胞及它們的衍生細(xì)胞系。
[0032] 將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，一種優(yōu)選的轉(zhuǎn)染方法是脂轉(zhuǎn)染，也 可以使用其它方法，包括磷酸鈣共沉淀、電穿孔、原生質(zhì)融合。
[0033] 轉(zhuǎn)染后，依照篩選標(biāo)記基因，篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)極限稀釋法對(duì) 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，并通過(guò)IgG Fc ELISA測(cè)定各單克隆表達(dá)量，篩選出表達(dá)量較高 的穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞株。
[0034] 3)純化分離 β-hNGF-Fc
[0035] 發(fā)酵培養(yǎng)高效穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，一種優(yōu)選的培養(yǎng)模式為流加方式進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)。 至細(xì)胞活力低于70 %結(jié)束。
[0036]收集發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物，并純化分離β-hNGF-Fc。多種層析方法均可以用于β-hNGF-Fc 的分離純化，包括離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠過(guò)濾。優(yōu)選的方法是使用 Protein A親和層析純化分離β-hNGF-Fco
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1是pCHOl.O載體圖譜圖；
[0038] 圖2是β-hNGF-Fc陽(yáng)性克隆PCR驗(yàn)證電泳圖譜；
[0039] 圖3是β-hNGF-Fc陽(yáng)性克隆質(zhì)粒酶切驗(yàn)證電泳圖譜；
[0040] 圖4是AKTAPuriferlOO層析系統(tǒng)Protein A親和層析純化β-hNGF-Fc譜圖；
[0041 ]圖 5是 SDS-PAGE 分析 β-hNGF-Fc 圖；
[0042]圖6是β-hNGF-Fc融合蛋白刺激TF-1細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng)曲線圖。
[0043] 圖7是β-hNGF-Fc與hNGF體外活性與時(shí)間曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附 圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例 中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0045] 實(shí)施例1 :pCH01.0-hNGF-hFc表達(dá)載體的構(gòu)建
[0046] hNGF-hFc核酸序列如SEQIDN0:2所示，翻譯所得的氨基酸序列如SEQIDN0:l所 不。
[0047] SEQ ID N0:1 如下所示：
[0048] 1 MSM.FYTLIT AFLIGIQAEP HSBSNVPAGH TIPQAHWTKL QHSLDTALRR ARSAPAAAIA 61 ARVAGQTRNI TVDPRLFKKR RLRSPR￥LFS TQFPREMDT QDLDFEVGGA APFNRTHRSK 121 KSSSHFIFHR GEFSVCDSVS VWVaDKTTAT D1KGKEVMVL GEVNiNNSVF KQYFFETKCK 181 DPNPVDSGCR GIDSKHTOSY CTTTHTFVKA LTMDGKQAAW RFIRIDTACV CYLSRKAVRK 241 丁GGGSGGGSV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSQE 3:D1 DPEVQFMYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP 301 SSIEKTISKA KGQPREPQyY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN 421 NYKTTPPVLD S0GSFFLYSR LTYDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK*
[0049] 其中l(wèi)-18aa為信號(hào)肽，19_121aa為前導(dǎo)肽，122_239aa為成熟肽，240_251aa為連接 短肽，252-478aa為Fc片段，經(jīng)重組分泌表達(dá)獲得的hNGF-hFc融合蛋白結(jié)構(gòu)為成熟肽-連接 短肽 -hFc。
[0050] SEQ ID NO:2如下所示：
[0051] 1 ATGTCCATGT TGTTCTACAC TCTGATCACA GCTTTTCTGA TCGGCATACA GGCGGAACCA 61 CACTCAGAGA GG^aTGTCCG TGCAGGACAG ACCATCCCCC AAGCCCACTG GACTftAACTT 121 CAGCATTCCC TTGACACTGC CCTTCGCAGA GCCCGCAGCG CCCCGGCAGC GGCGATAGCT 181 GCACGCGTGG CGGGGCAGAC CCGCAACATT ACTGTGGACC CCAGGCTGTT TAAAAAGCGG 241 CGACTCCGTT CACCCCGTGT GCTGTTTAGC ACCCAGCCTC CCCGTGAAGC TGCAGACACT 301 CAGGATCTGG acttcgaggt cggtggtgct gcccccttca acaggactca caggagcaag
[0052] 361 CGGTCATCAT CCCA'rCCC燈 CneCACAGG GGCGMlTCr Cem'GTGTta CAGTGTCAGC 421 GTGTGGGTTG GGGAJAAGAG CAGGGCCACA GACATCAAGG GCAAGaGGT GATGGTGTTG 481 GGAGAGCTGA ACATTAACAA CAGTOTATTC AAACACTACT TTTTTGAaC GAAGTGCGGS 54:1 GAC€CAAATC CCGTTGACM GGGSTGCCGG GGCATTGACT CAAAGCACTG GMCTGATAT 601 TGTACCACGA CTCACACCTT TGTCAAGGCG CtGACCATeG ATGGGASGCA GGCTGCCTGG 661 C6GTTXATGG GGATAGATAC GGGCTGTGTG TGTaiGCTCA GGAGGAAGGC TGTGAGAAAA 72:1 ACXGGCGGCG GCTCAGGAGG AGGAXCAGTG GAACGGAAAT GCTGCGXCGA AXGCCeACCA 781 TGCCCAGCTC CACCAGTCGC TGGACCAAGC GTCTTCTTGT TCCCACCAAA GCCAAAGGAC 84:1 ACCTTGATGA TTAGCCGGAC CCCAGAAGTC ACCTGCGTCG TCGTCGACGT CAGCCAGGAA 901 GACCCAGAAG TCCAGTTCAA CTGGTACGTC GACGGAGTCG AAGTCCACAA CGCTAAGACC 961 AAGCCACGGG AAGAACAGTT CAACAGCACC TACCGGGTCG TCAGCGTCTT GACCGTCTTG 1021 CACCAGGACT GGTTGAACGG AAAGGAATAC AAGTGCAAGG TCAGCAACAA GGGATTGCCA 1081 AGCAGCATTG AAAAGACCA丁 TAGCAAGGCT AAGGGACAGC CACGGGAACC ACAGGTCTAC 1141 ACCTTGCCAC CAAGCCAGGA AGAAATGACC AAGAACCAGG TCAGCl'TGAC CTGCTTGGTC 1201 AAGGGATTCT ACCCAAGCGA CATTGCTGTC GAATGGGAAA GCAACGGACA GCCAGAAAAC 12S1 AACTACAAGA CCACCCCACC AGTCTTGGAC AGCGACGGAA GCTTCTTCTT GTACAGCCGG 1321 TTGACCGTCG ACAAGAGCCG GTGGCAGGAA GGAAACGTCT TCAGCTGCAG CGTCATGCAC 1381 GAAGCTTTGC ACAACCACTA GACCCAGAAG AGCTTGAGCT TGAGCTTGGG AMGTGA
[0053] 其中l(wèi)-54bp為hNGF信號(hào)肽序列；55-363bp為hNGF導(dǎo)肽序列；364-717bp為hNGF成熟 肽序列；718-753bp為連接短肽序列，該序列為賴氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲 氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-纈氨酸-谷氨酸;754-1437bp為hlgG Fc段序列。 [0054] 通過(guò)化學(xué)合成的辦法合成序列SEQ ID N0:3,序列的上下游分別引入Xba I酶切位 點(diǎn)和BstZ17I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，Xba I酶切位點(diǎn)與ATG起始序列間引物Kozak序列 GCCACC。其中，TCTAGA為Xba I酶切位點(diǎn)（一 -所示），agacccaagctggctagc為保護(hù)堿基 (__所示hGTATAC為BstZ17I酶切位點(diǎn)（一-------._所示），ctagactcgagcggccgc為保護(hù)堿基（ 所示）。
[0055] SEQ ID N0:3如下所示：
[0056] .1 AGACCCAAGC TGGCTAGCTC TAGAGCCACC ATGTCCATGT TGTTCTACAC TCTGAICACA 61 GCTTTTCTGA TCGGCATACA GGCGGAACCA CACTCAGAGA GCAATGTCCC TGCAGGACAC 121 ACCATCCCCC AAGCCCACTG GACTAAACTT CAGCATTCCC TTGACACTGC CCTTCGCAGA 181 GCCCGCAGCG CCCCGGCAGC GGCGATAGCT GCACGCGTGG CGGGGCAGAC CCGCAACAH
[0057] 241 ACTGTGGACC CQGGCTGIT TAAAAAGCGG CGACTCCGTT CACCCCC/FGT GCTGTTTAGC 301 ACCCAGCCTC CCCGTGAAGC TGCAGACACT CAGGATCTGG ACTTCGAGGT CGGTGGTGCT 361 GCCCCCTTCA ACAGGACTCA CAGGAGCAAG CGGTCATCAT CCCATCCCAT CTTCCACAGG 421 GGCGAATTCT CGGTGTGTGA CAGTGTCAGC GTGTGGGTTG GGGATAAGAC CACCGCCACA 481 GACATCAAGG GCAAGGAGGT GATGGTGTTG GGAGAGGTGA ACATTAACAA CAGTGTATTC 541 AAACAGTACT TTTTTGAGAC CAAGTGCCGG GACCCAMTC CCGTTGACAG CGGGTGCCGG 6Q1 GGCATTGACT CAAAGCACTG GAACTCATAT TGTACCACGA CTCACACCTT TGTCAAGGCG 661 CTGACCATGG ATCGCAAGCA GGCTGCCTGG CGGTTTATCC GGATAGATAC GGCCTGTGTG 721 TGTGTGCTCA GCAGGAAGGC TGTGAGAAAA ACTGGCGGCG GCTCAGGAGG AGGATCAGTG 7&1 GAACGGAAAT GCTGCGTCGA ATGCCCACCA TGCCCAGCTC CACCAGTCGC TGGACCAAGC 841 GTCTTCTTGT TCCCACCAAA GCCMAGGAC ACCTTGATGA TTAGCCGGAC CCCAGAAGTC 901 ACCTGCGTCG TCGTCGACGT CAGCCAGGAA GACCCAGAAG TCCAGTTCAA CTGGTACGTC 961 GACGGAGTCG /\AGTCC7\CAA CGCTAAGACC AAGCCACGGG AAGAACAGTT CAACAGCACC 1021 TAGCGGGTCG TCAGCGTCTT GACCGTCTTG CACCAGGACT GGTTGAACGG AAAGGAATAC 1081 AAGTGGMGG TCAGCAACM. GGGATTGCCA AGGAGCATT6 AAMGACGAT TAGCAJGGCI 1141 AAGGGACAGG CACGGGAACC AGAGGTCTAC ACCTTGCGAC CAAGCGAGGA AGAAATGACG 1201 AAGAACCAGG 丁CA6CTTGAC CTGCTT€fiTC AAGG6ATTCT ACCCAAGCGA CATTGCTGTC 1261 GMTGGGMA GCMCGGAGA GGCAGAAAAC AACTACMGA CCACCCCACC AGTCTTGGAC 1321 AGCGACGGAA GCTTCTTCTT GTACAGCCGG TTGACCGTCG ACMGAGCCG GTGGCMGAA 1381 GGAAilCGTGT TGAGCTGCAG CGTCATGGAC GAASCTTTGC ACMCCACTA CACCGAGAAG 1441 AGCTTGAGCI TGAGCTTG6G AAAGTGACXA TACCTAGACT CgAfiCGGCCG C
[0058] 本實(shí)施例中使用的表達(dá)載體為pCHO 1.0，載體圖譜如圖1所示。由位點(diǎn)1開(kāi)始，該載 體含PGK啟動(dòng)子-DHFR基因表達(dá)框，用于表達(dá)DHFR基因；EF2/CMV混合啟動(dòng)子-插入序列表達(dá) 框，用于表達(dá)插入的的β-hNGF-Fc序列;PGK啟動(dòng)子-嘌呤霉素抗性基因表達(dá)框，用于表達(dá)嘌 呤霉素抗性基因。含該載體的細(xì)胞克隆可使用甲氨蝶呤(MTX)及嘌呤霉素進(jìn)行雙重篩選。 [0059] 利用限制性內(nèi)切酶Xba I與BstZ17I雙酶切合成序列，利用限制性內(nèi)切酶Avr Π 與 BstZl71雙酶切質(zhì)粒pCHOl. 0，其中Xba I與Avr Π 為同尾酶。然后乙醇沉淀回收純化酶切產(chǎn) 物。使用T4DNA Ligase將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)得到重組表達(dá)載體pCHOl .Ο-hNGF-hFc。將 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliToplO(Novagen)，經(jīng)菌液PCR鑒定(結(jié)果見(jiàn)圖2，Μ為marker，1和2為檢 測(cè)的菌落，均有1500bp左右的明顯條帶，說(shuō)明1和2均為PCR鑒定陽(yáng)性的菌落）、質(zhì)粒酶切鑒定 (結(jié)果見(jiàn)圖3，M為marker，1為檢測(cè)質(zhì)粒的酶切結(jié)果，從圖中可以看到有1500bp左右的清晰條 帶，說(shuō)明檢測(cè)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果正確）和測(cè)序鑒定后，將序列正確的pCHOl.O-hNGF-hFc克 隆-80°C凍存于15%甘油中，備用。
[0060] 實(shí)施例2:0-hNGF_Fc重組細(xì)胞株的構(gòu)建與篩選
[0061 ]質(zhì)粒純化:使用質(zhì)粒大提試劑盒提取純化質(zhì)粒PCH01.0-hNGF-hFc，使用Bio-Spec-Nano測(cè)定質(zhì)粒的濃度及純度。用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒其濃度需彡1.Oyg/yl，A260/A280 = 1.7-1.9。 若濃度不足，使用異丙醇沉淀質(zhì)粒并濃縮至適當(dāng)濃度。
[0062] CH0細(xì)胞活化:從液氮中取出凍存的CH0細(xì)胞，去除保護(hù)液，加適量⑶FortiCHO培 養(yǎng)基至細(xì)胞密度為5 X 105，于125ml搖瓶中，37°C，100r/min，5 %⑶2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞密度 至2 X 106時(shí)，使用適量培養(yǎng)基稀釋至5 X 105，直至細(xì)胞活力達(dá)90 %以上。
[0063]轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞密度為IX 106,活力應(yīng)大于90%。細(xì)胞、轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒的比 例見(jiàn)表1:
[0064] 表1轉(zhuǎn)染體系配置
[0065]
[0066] 按上表，準(zhǔn)備15ml CH0細(xì)胞，取1.5ml CD FortiCHO培養(yǎng)液，加入15yg質(zhì)粒 pCHOl. 0-hNGF-hFc，混勻，加入45μ1轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫靜置20min，然后將轉(zhuǎn)染反應(yīng)混合 物加入至細(xì)胞中，輕輕混勻。細(xì)胞置于37°C，100r/min，5%C02條件下培養(yǎng)。任意體積的細(xì)胞 均可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑與DNA也可以其它比例進(jìn)行混合。
[0067] 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的篩選:轉(zhuǎn)染24h后，將細(xì)胞密度稀釋至3 X105,加入MTX至終濃度 100nM，37 °C，100r/min，5 % C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞密度至5 X 105時(shí)，稀釋至3 X 105，直至 細(xì)胞活力達(dá)80 %以上，表明細(xì)胞已適應(yīng)該濃度選擇壓力。然后遞增MTX的濃度，依次為 200nM、500nM、1000nM。通過(guò)極限稀釋法進(jìn)行亞克隆，通過(guò)抗IgGFcELISA測(cè)定β-hNGF-Fc表 達(dá)量，挑選分泌表達(dá)水平高的單克隆。
[0068] 實(shí)施例3 :f3-hNGF-Fc的重組表達(dá)、分離純化及定性
[0069] 重組表達(dá)
[0070]將實(shí)施例2中獲得的β-hNGF-Fc重組細(xì)胞株進(jìn)行流加培養(yǎng)。種子細(xì)胞培養(yǎng)至密度2 X106,活力90%以上即可接種發(fā)酵，發(fā)酵初始密度5X105。每天測(cè)定細(xì)胞的密度、活力以及 培養(yǎng)液中葡萄糖含量，并補(bǔ)充FeedC培養(yǎng)基，使培養(yǎng)液中葡萄糖終濃度為4g/L。細(xì)胞活力< 70 %時(shí)發(fā)酵結(jié)束。離心收集培養(yǎng)液，用于分離純化。
[0071 ] Protein A親和層析分離純化β-hNGF-Fc
[0072] 使用AKTAPuriferlOO層析系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行親和層析，色譜柱為HiTrapMabSelect lmL。 儀器操作按操作指南進(jìn)行，A1栗為Buffer A( 50mM磷酸鹽緩沖液，lOOmMNaCl，pH7.0)，B1栗 為Buf f er B(50mM醋酸鹽緩沖液，pH3.5)。
[0073] 清洗：以0.1M NaOH，流速lml/min，沖洗ProteinA凝膠柱5個(gè)柱體積(CV)，再用超純 水以流速1 m 1 /m i η清洗5 c v，去除P r 〇 t e i η A凝膠上的雜志殘留。
[0074] 平衡:Buffer A以lml/min流速?zèng)_洗10CV，以維持ProteinA凝膠環(huán)境適合β-hNGF- Fc與ProteinA的結(jié)合。
[0075] 上樣:澄清過(guò)濾后的發(fā)酵液以lml/min的速率通過(guò)ProteinA凝膠，使β-hNGF-Fc與 ProteinA能特異性的結(jié)合。
[0076] 沖平:Buffer A以lml/min流速?zèng)_洗至280nm吸收值低于0.01。
[0077] 洗脫：以lml/min流速，Buffer B沖洗ProteinA凝膠，收集洗脫峰。
[0078] 中和:洗脫峰收集樣品用2mol/L Tris-Cl，pH9.0調(diào)pH至5.6。
[0079] 結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中可以看出：pH降低至3.5后，洗脫得到一個(gè)單一的、尖銳的洗脫 峰。SDS-PAGE分析:SDS-PAGE檢測(cè)分析純化得到的β-hNGF-Fc。使用12 %分離膠。結(jié)果顯示， 還原條件下，純化的蛋白迀移至約40kDa，無(wú)顯著聚合物與雜蛋白存在。結(jié)果見(jiàn)圖51為 marker，1為純化的蛋白。
[0080] 實(shí)施例4:體外生物活性分析
[0081] 參照2015版《中國(guó)藥典》鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性測(cè)定法，第二法：TF-1細(xì)胞/ MTS比色法。
[0082] TF-1細(xì)胞法是基于TF-1細(xì)胞系的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)高度依 賴性，利用NGF與TF-1細(xì)胞表面的NGF高親和力受體TrkA結(jié)合后誘導(dǎo)TF-1細(xì)胞增殖的特點(diǎn)， 建立的一種新的NGF活性測(cè)定方法。該方法目前已成為檢測(cè)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(rhNGF) WHO參考品的標(biāo)準(zhǔn)方法。
[0083] TF-1細(xì)胞培養(yǎng):TF-1細(xì)胞株用完全培養(yǎng)基于37°C、5 %二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控 制細(xì)胞濃度為每lml含1.0 X 105~5.0 X 105個(gè)細(xì)胞，傳代后第二天用于NGF生物學(xué)活性測(cè)定。 細(xì)胞懸液制備：取足量細(xì)胞培養(yǎng)液l〇〇〇rpm離心5min，棄去上清，收集TF-1細(xì)胞。加入5ml基 礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，lOOOrpm離心5min后棄去上清，如此洗3次后重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)基并配成 每lml約含6.0X10 4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，置于37°C、5%二氧化碳條件下備用。
[0084] 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備:取1支分裝好的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自英國(guó)國(guó)家 生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控物研究所(NIBSC)，貨號(hào)93/556)，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋10倍，至每lml含 100U〇
[0085] 檢品溶液制備：檢品用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)稀釋，每步稀釋最大不超過(guò)10倍，至每 lml 約含 100U。
[0086]檢品梯度制備：
[0087] 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板選取除第1列和第12列外的相鄰兩列作為標(biāo)準(zhǔn)品列或檢品列； [0088]在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的檢品列和標(biāo)準(zhǔn)品列除A孔外，每孔加入100μ1基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
[0089] 檢品列或標(biāo)準(zhǔn)品列Α孔每孔分別加入150μ1檢品洛液或標(biāo)準(zhǔn)品洛液；
[0090] 自Α行至Η行將檢品溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行3倍系列稀釋，共8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋 度做2個(gè)復(fù)孔，每孔分別留100μ1溶液，棄去孔中多余溶液；
[0091] 向檢品列和標(biāo)準(zhǔn)品列每孔加入100μ1細(xì)胞懸液，向空白列每孔加入200μ1無(wú)菌水； [0092]將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入濕盒中，于37°C、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)66-72h〇
[0093] 檢品列和標(biāo)準(zhǔn)品列每孔加入MTS溶液20μ1后將96孔板放回濕盒中，于37°C、5 %二 氧化碳的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3h。
[0094] 將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀，以550nm為參比波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度， 記錄測(cè)定結(jié)果。
[0095] 結(jié)果判定：
[0096] 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SoftMax?Pro 5Software數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行處理，并編入按下式計(jì) 算結(jié)果：
[0097] 檢品生物學(xué)活性(U/ml) = Pr X (Ds X Es) /(Dr X Er)
[0098] 式中，Pr為標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性，U/ml;
[0099] Ds為檢品預(yù)稀釋倍數(shù)；
[0100] Dr為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；
[0101] Es為檢品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)；
[0102] Er為標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)。
[0103] 檢品比活性(U/mg)=檢品生物學(xué)活性/蛋白含量。
[0104] β-hNGF-Fc融合蛋白刺激TF-1細(xì)胞增殖劑量的效應(yīng)曲線如圖6，四參數(shù)如表2所示， 擬合方程為y = (A-D) / (1+(x/C Γ B) +D。從圖中可以看出，β-hNGF-Fc融合蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品的劑 量效應(yīng)曲線一致，說(shuō)明該條件下，β-hNGF-Fc刺激TF-1細(xì)胞的效應(yīng)與hNGF相近。該曲線均符 合四參數(shù)擬合方程。計(jì)算表明β-hNGF-Fc融合蛋白的比活為3.57X 105U/mg。按摩爾質(zhì)量換 算，相對(duì)于β-hNGF比活> 1 X 106U/mg，與標(biāo)準(zhǔn)品的比活相當(dāng)?；钚詫?shí)驗(yàn)表明，β-hNGF-Fc具有 與hNGF相當(dāng)?shù)捏w外生物學(xué)活性。
[0105] 表2劑量效應(yīng)參數(shù)
[0106]
[0107] 實(shí)施例5:體外穩(wěn)定性分析
[0108] 分別取β-hNGF-Fc及hNGF(重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自英國(guó)國(guó)家生物學(xué) 標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控物研究所(NIBSC)，貨號(hào)93/556)，濃度為0.05ymol/ml，溶于pH 7.0、50mM磷酸鹽 緩沖液中，放置于37°C保溫。每周取樣測(cè)定活性殘留量，以初始比活為100%相對(duì)活性，實(shí)驗(yàn) 設(shè)置三個(gè)重復(fù)。變化曲線如圖7所示，其中NGF活性標(biāo)準(zhǔn)品即為hNGF。從圖中看出，經(jīng)過(guò)4周， β-hNGF-Fc的活性損失較hNGF緩慢，hNGF活性殘留2.24 %，而β-hNGF-Fc活性殘留27.38 %。 結(jié)果顯示β-hNGF-Fc的體外穩(wěn)定性顯著強(qiáng)于hNGF。該結(jié)果提示β-hNGF-Fc具有長(zhǎng)效化應(yīng)用前 景。
[0109] 盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例 性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨 的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白依次由人β NGF、短肽接頭和人IgG Fc所示氨基酸序列組成。2. 如權(quán)利要求1所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述短肽接頭序列為不多 于20個(gè)氨基酸的序列;優(yōu)選的，所述短肽接頭含有甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸中至少 兩個(gè)氨基酸的序列；更優(yōu)選的，所述短肽接頭序列為賴氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨 酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-纈氨酸-谷氨酸所示序列。3. 如權(quán)利要求1所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc片段含人 IgG鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。4. 如權(quán)利要求1所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白所示序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示;優(yōu)選的，所述融合蛋白所對(duì)應(yīng)的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。5. 如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白在摩爾基礎(chǔ)上，具有與人NGF相當(dāng)或更高的體外生物活性。6. -種重組子，其特征在于，含有權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白序 列。7. -種細(xì)胞株，其特征在于，含有權(quán)利要求6所述重組子;優(yōu)選的，所述細(xì)胞株為哺乳動(dòng) 物細(xì)胞株;更優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞株為CHO細(xì)胞衍生的細(xì)胞株。8. -種重組β-hNGF-Fc融合蛋白制備方法，其特征在于，所述方法包括： 構(gòu)建含β-hNGF-Fc融合蛋白的重組表達(dá)載體； 將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并篩選高效穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株； 發(fā)酵培養(yǎng)所得高效穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，收集培養(yǎng)液并純化細(xì)胞分泌出的β-hNGF-Fc融 合蛋白。9. 如權(quán)利要求8所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白制備方法，其特征在于，所述β-hNGF-Fc的 蛋白序列如SEQ ID ΝΟ:1所示;優(yōu)選的，所對(duì)應(yīng)的β-hNGF-Fc核酸序列如SEQ ID NO:2所示； 任選的，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO細(xì)胞、人NIH293細(xì)胞、COS細(xì)胞或MDCK細(xì)胞及它們的衍 生細(xì)胞系。10. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述重組β-hNGF-Fc融合蛋白，權(quán)利要求6所述重組子或權(quán)利要 求7所述細(xì)胞株用于周圍神經(jīng)病變、神經(jīng)損傷的恢復(fù)及神經(jīng)生長(zhǎng)因子長(zhǎng)效化應(yīng)用的用途。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK106008722SQ201610617323
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月29日
【發(fā)明人】張文宇, 黃奮飛, 章永壘, 白羊, 陳星 , 阮卡, 陳勝亮, 葛平輝, 鄒有土, 馬燕玲, 王明灶
【申請(qǐng)人】未名生物醫(yī)藥有限公司