一種新型乙型肝炎動物模型的建立方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)染HBV基因的HepG2.2.15細(xì)胞分泌的病毒液誘發(fā)的乙型肝炎動物模型的制備方法，特別是一種易于獲得和調(diào)控的誘導(dǎo)劑及簡單的操作程序，產(chǎn)生與人類疾病更具有相似性的乙型肝炎疾病模型及其在乙肝發(fā)病機(jī)制研究和抗肝炎藥物評價(jià)中的應(yīng)用。
【專利說明】一種新型乙型肝炎動物模型的建立方法與用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種動物疾病模型的制備方法，特別是一種簡單的誘導(dǎo)劑及簡單的操作程序，產(chǎn)生與人類疾病更具有相似性的乙型肝炎疾病模型及其在乙肝發(fā)病機(jī)制研究和抗肝炎藥物評價(jià)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(HBV)感染是嚴(yán)重的公共健康問題。我國是HBV感染高發(fā)流行區(qū)，約有7億人曾經(jīng)感染HBV，其中慢性感染人數(shù)高達(dá)1.2億，占全球HBV感染總數(shù)的1/3左右。15%~35%的慢性乙肝患者因肝硬化、肝癌等終末期肝病而死亡。全球53%的肝癌與HBV感染密切相關(guān)。盡管HBV感染是肝癌發(fā)生的最主要病因，但HBV慢性感染機(jī)制至今仍未完全闡明。缺乏合適的HBV感染疾病模型是阻礙HBV基礎(chǔ)研究進(jìn)展的主要瓶頸，其根本原因在于HBV感染宿主的種屬范圍極窄，除人類之外，只有黑猩猩感染HBV模型得到公認(rèn)，但因其為瀕危珍稀動物而不適用于實(shí)驗(yàn)研究而受到限制。因此，建立方便有效的、與人類有較近親緣關(guān)系的動物感染人HBV模型，是闡明HBV生物學(xué)特性、感染致病機(jī)理及建立有效防治措施所亟需。[0003]HBV是一種較為嚴(yán)格的嗜肝DNA病毒，其感染有高度的種屬和組織特異性，由于病毒黏附以及DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制對宿主有嚴(yán)格的要求，HBV只感染人類和類人猿。嗜肝DNA病毒科分為哺乳類和禽類兩個(gè)屬，前者包括人、毛猴、土撥鼠和地松鼠的嗜肝DNA病毒HBV、WMHBV.WHV和GSHV ;后者包括鴨和蒼鷺的嗜肝DNA病毒DHBV和HHBV。HBV是嗜肝DNA病毒的原型，在基因組結(jié)構(gòu)的相似性和基因序列的同源性等方面與本家族其他成員有程度不同的差別。多年來，鴨感染DHBV模型和土撥鼠感染W(wǎng)HV模型在探索HBV感染人體的機(jī)制和研發(fā)臨床用藥等方面做出了重要貢獻(xiàn)，但將這兩個(gè)動物模型的相關(guān)研究結(jié)果用于闡釋人類感染HBV的相關(guān)事件，均尚存很明顯的屏障。
[0004]樹斷I (Tupaia belangeri)作為小型低等靈長類動物,與人類在生理機(jī)能、生化代謝和基因組等方面的相似性遠(yuǎn)高于小鼠、大鼠、土撥鼠等常用實(shí)驗(yàn)動物。世界衛(wèi)生組織多年前就呼吁用樹駒代替大型靈長類動物進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)，我國近年來也已開始樹駒資源的開發(fā)利用和標(biāo)準(zhǔn)化研究。國內(nèi)外研究表明含HBV的乙肝患者血清確實(shí)可以感染樹駒，但由于乙肝患者血清采集不方便且危險(xiǎn)性高、難以標(biāo)化，不利于模型的推廣應(yīng)用。而轉(zhuǎn)染HBV的H印G2.2.15細(xì)胞是目前抗乙肝藥物藥效評價(jià)最常用的細(xì)胞模型，它不僅能支持HBV DNA復(fù)制，而且還能支持Dane樣顆粒的包裝和分泌，將該細(xì)胞培養(yǎng)上清靜脈注射黑猩猩可致典型肝炎。因此，采用IfepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清(含病毒顆粒)感染樹駒，建立乙肝模型，具有感染源易于獲得、建模方便、易于標(biāo)化，且適于普通實(shí)驗(yàn)研究等優(yōu)點(diǎn)，對乙肝感染機(jī)制的深入研究和抗乙肝藥物的評價(jià)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新型的乙型肝炎動物模型，該模型建模方便，感染源易于獲得，成模率高，易于標(biāo)化和調(diào)控，為乙肝感染機(jī)制的研究和抗乙肝藥物評價(jià)提供一種與人類疾病更具相似性的、穩(wěn)定可靠的疾病模型。為此，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:
[0006]由于HBV感染宿主的種屬范圍極窄，除人類之外，只有黑猩猩感染HBV模型得到公認(rèn)，但因其為瀕危珍稀動物而不適用于實(shí)驗(yàn)研究而受到限制。目前研究常用的鴨感染DHBV模型和土撥鼠感染W(wǎng)HV模型的相關(guān)研究結(jié)果用于闡釋人類感染HBV的相關(guān)事件，均尚存很明顯的屏障。而本發(fā)明采用轉(zhuǎn)染HBV的H印G2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清(含病毒顆粒)感染樹鼠句建立的乙型肝炎模型，由于感染源易于獲得和調(diào)控，能更方便地模擬人類乙型肝炎。
[0007]一種用轉(zhuǎn)染HBV的H印G2.2.15細(xì)胞分泌病毒液誘發(fā)，無需特殊裝置，簡單易行，成模率高的乙型肝炎動物模型的建立方法。具體制備方法如下:
[0008]以定量病毒載量的H印G2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液為感染源，經(jīng)靜脈注射感染3月齡樹駒，每周注射I次，每只0.5毫升，共接種3次，即可誘發(fā)乙型肝炎。[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):(I)采用轉(zhuǎn)染HBV的H印G2.2.15細(xì)胞分泌病毒液作為感染源，由于ifepG2.2.15細(xì)胞分泌病毒載量易于調(diào)控，能更方便地模擬乙型肝炎；(2)無需特殊裝置，簡單易行，成模率高，易于標(biāo)化和調(diào)控；(3)與人類乙型肝炎具有良好的相關(guān)性；(4)適于肝炎發(fā)病機(jī)制研究和抗肝炎藥物評價(jià)研究。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1:新型乙型肝炎模型的制備及評價(jià)
[0011]I準(zhǔn)備以下材料:
[0012]1.1實(shí)驗(yàn)動物:樹駒由中國科學(xué)院昆明動物研究所提供。
[0013]1.2HepG2.2.15細(xì)胞:由HBV基因轉(zhuǎn)染H印G2肝癌細(xì)胞而來。
[0014]2制備方法按如下步驟:
[0015]2.1轉(zhuǎn)染HBV的H印G2.2.15細(xì)胞，采用含10%胎牛血清、青霉素100IU/m及鏈霉素100 μ g/mL的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5% C02條件下常規(guī)培養(yǎng)，并用G418進(jìn)行克隆篩選。吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心分離和純化HBV顆粒，采用熒光定量PCR方法測定HBV載量，制備接種病毒液。
[0016]2.2取3月齡樹駒，以定量病毒載量的病毒液為感染源，經(jīng)靜脈注射途徑感染，每周注射I次，每只0.5毫升，共接種3次，即可形成乙肝模型。
[0017]3評價(jià)方法按如下步驟:
[0018]3.1接種后定期采血作HBV感染標(biāo)志物檢測，用生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平；采用ELISA法檢測血清HBV表面抗體和HBV核心抗體表達(dá)水平；采用熒光定量PCR方法檢測血清HBV DNA載量。
[0019]3.2取肝組織，采用免疫組化方法檢測HBV表面抗原(HBsAg)和HBV核心抗原(HBcAg)水平；采用原位分子雜交法檢測HBV DNA水平。
[0020]3.3電鏡下觀察樹駒血清中是否存在Dane氏顆粒及HBsAg顆粒。
【權(quán)利要求】
1.一種新型乙型肝炎動物模型的建立方法，包括模型的制作程序及模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，其特征在于采用一種簡單的誘導(dǎo)劑及簡單的操作程序，復(fù)制出穩(wěn)定、可靠的乙型肝炎模型及其在乙肝感染機(jī)制研究和抗肝炎藥物評價(jià)中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型乙型肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的實(shí)驗(yàn)動物為樹鼠句。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型乙型肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)劑為乙肝病毒基因轉(zhuǎn)染的ifepG2.2.15細(xì)胞分泌的病毒顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的感染途徑為靜脈注射。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的新型乙型肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)劑乙肝病毒基因轉(zhuǎn)染的H印G2.2.15細(xì)胞不僅能支持乙肝病毒DNA復(fù)制且支持乙肝病毒顆粒的包裝和分泌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為小鼠轉(zhuǎn)氨酶水平升高，乙肝病毒表面抗體和乙肝病毒DNA檢測呈陽性，以及電鏡檢查出現(xiàn)Dane氏顆粒。
7.一種新型乙型肝炎模型的建立方法如權(quán)利要求1所述一種簡單的誘導(dǎo)劑及簡單的操作程序，復(fù)制出穩(wěn)定可靠的乙型肝炎模型，其特征在于所述的模型制備方法為每周注射誘導(dǎo)劑I次，0.5毫升/只，共注射3次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎模型的建立在乙肝感染機(jī)制研究和抗肝炎藥物評價(jià)中的應(yīng)用，其特征在于所誘 發(fā)的肝炎與人類乙型肝炎在病程特點(diǎn)和肝臟病理改變等方面具有良好的相關(guān)性。
【文檔編號】A61K49/00GK103920166SQ201310014446
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月10日
【發(fā)明者】伍義行, 張虹莉, 賈袁媛, 戴靈豪, 沈鈺明 申請人:中國計(jì)量學(xué)院