專利名稱：：通過修飾異?；蚍闯１磉_基因的表達來治療性干預個體的遺傳病的制作方法通過修飾異?；蚍闯１磉_基因的表達來治療性干預個體的遺傳病本發(fā)明涉及遺傳病領域。具體地說，本發(fā)明涉及通過在個體中矯正遺傳病的繼發(fā)效應來改善遺傳病的治療。遺傳病是由個體的遺傳物質的異常所引起的疾病。疾病在個體中的表達不僅取決于遺傳因素，環(huán)境因素也起作用。遺傳病(遺傳障礙，geneticdisorder)的一種可能的分類是分為兩種不同的類型單基因病或多基因病。單基因遺傳病是由發(fā)生在一種基因的DNA序列中的突變所引起。存在6,000種以上的已知單基因病(人基因組計劃4言息(HumanGenomeProjectInformation))。實例是嚢性纖纟1M匕、鐮狀細胞貧血、馬凡綜合征、亨廷頓病、以及遺傳性血色素沉著病。單基因病以可識別模式進行遺傳常染色體顯性、常染色體隱性、以及X連鎖。多基因遺傳病是由多基因中的突變所引起。在遺傳病組內可以區(qū)分的兩種類型是染色體病和線粒體病。染色體遺傳病是由染色體結構異常所引起。染色體結構異常如缺少或額外拷貝或嚴重斷裂(grossbreak)以及再連4妄(易位)，可以導致疾病?？梢酝ㄟ^顯微檢查來檢測某些類型的較大染色體異常。唐氏綜合征或第21號染色體三體性(trisomy21)是當人具有第21號染色體的三個拷貝時發(fā)生的常見病癥。線粒體遺傳病是相對罕見類型的遺傳病。這種類型的病癥是由線粒體的非染色體DNA中的突變所引起。每個線粒體可以包含6DNA的5至10個環(huán)狀片(circularpiece)。染色體以及線粒體遺傳病可以是單基因疾病或多基因疾病。其中已發(fā)生突變的基因的鑒定提供了一種可能性來開發(fā)特異性療法。在過去的十年中，已積極研究了基因的鑒定，其涉及各種遺傳病。人基因組計劃，其實際上已鑒定人DNA中的所有基因，在這種類型研究的進展中具有重要作用。許多遺傳病是由關鍵基因中的缺損所引起。經常，缺損導致受影響基因的產物沒有功能或降低量的功能。利用上述遺傳缺損的潛在原因的分子知識進行的療法通常目的在于向受影響細胞提供(部分地)功能基因產物。在本發(fā)明中，已發(fā)現(xiàn)，不同于受影響基因的其它基因在所述個體的細胞中可以^皮脫調節(jié)(下調，deregulate)，以及所述脫調節(jié)可以增加疾病的嚴重性和/或癥狀。意想不到地，甚至當受作為遺傳缺損的基礎的異常表達并不直接涉及受遺傳缺損影響的蛋白質的功能時，發(fā)現(xiàn)了這種脫調節(jié)(異常表達)。因此本發(fā)明的一個目的是，通過調節(jié)所述異常表達基因的表達來矯正所述遺傳缺損在所述患者中的至少一種繼發(fā)性、潛在疾病惡化效應。因此，似乎是，除可以被確定為遺傳病的原因因素的突變基因之外，還存在其它異常表達的基因，雖然那些基因似乎并不直4妄受到所述突變基因或其正常配對物的影響。本發(fā)明鑒定了若干所述異常表達基因。脫調節(jié)基因(異常表達基因)的表達不同于健康個體中的正常情況。上述脫調節(jié)表達、異常表達不是所希望的。在由分化細胞中的缺損引起的遺傳病中進行了本發(fā)明的觀測。已發(fā)現(xiàn)，甚至當受突變(遺傳缺損的原因)影響的基因在所述前體細胞中并不正常表達時，在所述分化細胞的前體中基因已經可以-故脫調節(jié)。換言之，在不同于分化細胞(其通常被認為表達所述遺傳病的表型)的其它細胞中發(fā)現(xiàn)了所述異常表達基因。本發(fā)明為遺傳病的治療，尤其為由所述個體的分化細胞中(部分)缺乏基因產物的功能或沒有基因產物所引起的遺傳病的治療，提供了新的理解。在本發(fā)明中，在所述分化細胞的前體細胞的培養(yǎng)中或直4妄在患者中，對所述異常表達基因的表達進4i^修飾(modify)。當用于所述前體細胞的培養(yǎng)時，在所述前體細胞移植到患者以后，它可以增強所述前體細力包形成新分化細胞的能力，乂人而改善所述細胞移才直治療的成功。當直接應用于患者時，本發(fā)明才是供了一種方法，用于在個體中減輕遺傳病的惡化癥狀，其中所述癥狀優(yōu)選為所述前體細胞分化成所述分化細胞的能力下降，其中所述疾病是所述個體的分化細胞中功能失常(功能不良)基因的結果，所述方法包括在所述前體細胞中修飾至少一種異常表達基因的表達，其中所述異常表達基因不是所述功能失?；颉９δ苁С；蚝陀善淙睋p引起的直4妄歲丈應通常牙爾"f乍原、發(fā)歲文應(#刀士臺歲文應，primaryeffect),而隨后由于細胞功能失常(包括所述遺傳缺損)而發(fā)生的間接效應經常稱作繼發(fā)效應。這些繼發(fā)效應通常并不是基因功能失常的直4妄結果。本發(fā)明進一步提供了一種化合物在用于修飾至少一種基因的表達、用于制備減輕個體中遺傳病的癥狀的藥劑中的應用，其中所述疾病是所述個體的分化細胞中遺傳缺損的結果，其中所述基因在涉及作為所述遺傳缺損(功能失?；?的基礎的突變。遺傳缺損通常影響基因或其產物的至少部分功能。這可以由各種各樣的突變引起。例如，突變可以是在基因的編碼區(qū)中，從而導致缺損蛋白質/RNA的生產。另一方面，突變還可以是在一個或多個控制基因產物的表達的調節(jié)序列中。當在細胞中基因產物的水平、或在細月包中的表達時間發(fā)生變4匕時，這才羊的突變還可以導致所述基因的基因產物的(部分)功能的喪失。突變的類型也可以變化。突變可以是例如缺失、插入、倒位或點突變。還存在這樣的突變，其是所謂的沉默突變，即，其并不顯著影響個體的健康。上述突變的實例是密碼子中的點突變，由于編碼潛力的豐余，其并不改變^皮加入蛋白質中的氨基酸。很顯然，沉默突變并不在本發(fā)明的范圍內。突變基因(作為遺傳病的原因，如在本發(fā)明中所使用的)是具有非沉默突變的基因。體內細l包通常具有有限的生命期(壽命)。許多這些細胞是由所謂的前體細月包加以補充。例如，前體(干)細胞連續(xù)補充死皮月夫細胞。所謂的干細胞類似地補充腸內層的細胞。通常通過與前體細胞(稱作成肌細胞)的融合來(再)產生肌細胞；用前體細胞(其最終來自個體的骨髓中)來補充血細胞。僅當前體細胞在稱作分化的過程中中止其原始狀態(tài)時，才可以發(fā)生再生。前體細胞本身還可以具有有限的生命期和/或活性，并且如果是如此，則用具有更長生命期和/或再生潛力的其它前體細力包來更換它們。具有有限生命期和有限自我更新潛力的端細胞稱作分化細胞，而經常具有更大自我更新潛力的前體稱作非分化細胞。后者經常起因于以下事實分化細胞呈現(xiàn)前體并不呈現(xiàn)的功能。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述前體細胞是成肌細胞和/或其前體。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述分化細月包是力幾細月包。'患有遺傳病的個體可以呈現(xiàn)許多癥狀。當才是及減輕疾病的癥狀時，是指至少降4氐癥狀的嚴重性。在力幾萎縮的情況下，例如，該疾病的癥狀尤其包括肌力隨年齡而降低、肌質量隨年齡而降低、有限的生命期以及生活質量隨年齡而降低(例如，不能4于走、依賴于護理和藥療法)。在月幾萎縮的實例中，當和未治療個體(其具有和經治療個體沒有進;f亍治療所相同的預后)相比時，減輕癥狀通常可以改善"幾力、生命期和/或改善生活質量。在患有所述遺傳病的個體中異常表達的基因，和在健康個體中生理上表達相同的基因相比，可以表達太〗氐或太高。在才艮據(jù)本發(fā)明的方法或應用中，修飾表達包括當?shù)陀谡顟B(tài)下的所述基因表達時，提高所述異常表達基因的表達；或當高于所述正常狀態(tài)下的9所述基因表達時，降低所述異常表達基因的表達。當表達太低時提高表達或當表達太高時降低表達可矯正原發(fā)性遺傳缺損的繼發(fā)性變化并減輕遺傳病的癥狀。在這種情況下，所述異常表達基因的表達凈皮帶回到生理上更可^妄受的、更可行的和/或更通常的水平。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，所述異常表達基因的表達基本上被正?；Ｉ砩峡?妻受的、更可行的和/或更通常的水平將經常是為大約正常水平的水平。正常水平是在相同年齡和體質的健康個體中可以發(fā)J見的水平。生理上可4姿受的、更可4于的和/或更通常的水平可以落在正常范圍之外，但仍然為個體提供足夠的功能。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中修飾所述表達包括々妄近正常狀態(tài)的水平?？梢砸栽S多方式來實現(xiàn)^,飾表達。可以例如通過施加反義療法或通過給予阻抑蛋白(其結合于所述異常表達基因的啟動子)來實現(xiàn)降低異常表達基因的表達。例如通過加入轉基因(其表達所述異常表達基因)、通過加入和/或活化轉錄因子(其刺激所述異常表達基因的表達)和/或通過活化所述異常表達基因的啟動子和/或增強子序列來實現(xiàn)提高異常表達基因的表達。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實飾表達。目前有許多不同的反義方式來下調節(jié)(down-regulate)基因產物的生產。借助于Watson-Crick雜交，反義4支術采用寡核苷酸類似物來結合于把RNA。在結合以后，反義制劑使靶RNA不能降解或誘導耙RNA的降解。反義制劑還可以改變剪接。在過去的十年中，已獲悉許多關于反義的基本機制，醫(yī)藥化學，以及反義分子的藥理性能、藥物動力學性能、以及毒理性能。已證明反義技術在基因功能4t(functionalisation)和輩巴i正實(革巴確i人，targetvalidation)方面是有價值的。借助于一種銷售藥物，福米韋生，以及大約20種處于臨床開發(fā)中的反義藥物，反義藥物在治療各種各樣疾病方面是重要藥物(關于綜述，參見[l])。某些更新的反義方式的非限制性實例是干擾RNA(RNAi)、樣么小RNA以及剪接干擾技術如外顯子跳躍。優(yōu)選作為單鏈分子或作為一部分發(fā)夾型分子給予反義序列?？梢灾苯咏o予反義序列或借助于(病毒轉導的)表達盒在細胞中產生反義序列。優(yōu)選作為基因遞送載體的一部分向細胞提供反義寡核苷酸。這樣的載體優(yōu)選為脂質體或病毒基因遞送載體。脂質體在本領域中是眾所周知的并且許多變體可用于基因轉移目的。各種病毒基因遞送目前用來將基因轉移到靶細胞中。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用那些病毒載體，其并不表達它們自己的基因而僅表達轉移的基因。因而反義分子可以存在于基因遞送載體中。在病毒載體中，優(yōu)選作為表達盒提供反義分子，其中表達盒編碼包含所述反義寡核苷酸的轉錄物。優(yōu)選的病毒遞送載體是腺病毒載體并且更優(yōu)選腺相關病毒載體。因此本發(fā)明還提供上述表達盒、載體以及基因遞送載體。本領域」技術人員能夠i殳計適宜的轉錄物。對于本發(fā)明來i兌，優(yōu)選的是PolIII驅動的轉錄物。優(yōu)選以與Ul或U7轉錄物的融合轉錄物的形式。如參考文獻[2-4]所述，可以產生這樣的融合。在本發(fā)明中，寡核苷酸是DNA或RNA核苷酸的多聚體(通常在5和300個核苦酸之間)?？梢泽w外或體內合成寡核苦酸。在后面的范圍中，它們有時還稱作反義分子/序列、siRNA、miRNA等。在一種優(yōu)選的實施方式中，寡核普酸包含5-300個之間的核苦酸，更優(yōu)選15-100個之間的核苷酸，更優(yōu)選15-40個之間的核苷酸以及更優(yōu)選15與25個之間的核普酸。對于所述寡核香酸或其功能等效物的互補性區(qū)來說，所述長度是優(yōu)選的。15與40個之間的核苷酸的寡核苦酸或其功能等效物可以與所述寡核苷酸或功能等效物與其互補的區(qū)具有一個或兩個4晉配。在所述一個或兩個4晉配的情況下，互補性區(qū)優(yōu)選包含至少15個核苦酸的連續(xù)的一,炎序列(stretch)。即，互補于15個核苷酸的任何一段序列的寡核苷酸或其功能等效物可以具有一個或兩個錯配。優(yōu)選所述寡核苷酸或其功能等效物具有一個或更優(yōu)選沒有與它與其互補的區(qū)的錯配。如果寡核香酸具有15個以上的核苦酸，則它可以具有高達15%的4晉配。如果基于百分比規(guī)則計算的錯配數(shù)目是兩個整數(shù)之間的數(shù)目，則錯配的最大容許數(shù)目是更高的整數(shù)數(shù)目。例如，具有16個核苷酸互補性的連續(xù)的一革殳序列的寡核苦酸可以具有16*0.15=2.4個核苦酸錯配。因此，在此寡核苷酸中容許的錯配的最大數(shù)目是3。在一種優(yōu)選的實施方式中，產生的寡核苷酸互補于15與50個之間的核苷酸的連續(xù)部分，并且更伊乙選所述寡核苦酸包含RNA以及甚至更伊乙選所述寡核苷酸是2'-0-甲基RNA并具有全長石危代磷酸主鏈(full-lengthphosphorothioatebackbone)。2'0-甲基RNA是核酉吏類似、物，其特征在于良好的雜交性能(它賦予互補(complimentary)的DNA或RNA)以及與天然核酸相比，抵抗酶促降解的增加的穩(wěn)定性。目前臨床開發(fā)中的大多數(shù)反義寡核苷酸摻入好u代磷酸主鏈4奮飾，以促進對核酸酶的抗性同時保存通過核糖核酸酶(RNase)H刺激切割mRNA把的能力。互補寡核苷酸優(yōu)選互補于所述外顯子RNA的13與50個之間的核苦酸的連續(xù)部分。在另一種實施方式中，互4卜寡4t苷酸互^卜于所述外顯子RNA的16與50個之間的4亥苷酸的連續(xù)部分。優(yōu)選地，寡核苷酸互補于所述外顯子RNA的13-25個之間的核苷酸的連續(xù)部分，優(yōu)選所述外顯子RNA的14與25個之間的核香酸。不同類型的核酸可以用來產生寡核苷酸。優(yōu)選地，寡核普酸包含RNA，因為RNA/RNA雜交體是非常穩(wěn)定的。因為外顯子跳躍技術的目的之一是指導在主體(受治療者)中的剪接，所以優(yōu)選的是，寡核苦酸RNA包括一種》務飾，其向RNA^是供另外的性能，例如，對內切核酸酶和RNaseH(核糖核酸酶H)的抗性、另外的雜交強度、增加的穩(wěn)定性(例如在體液中)、增加或降低的柔性、降低的毒性、增加的胞內運輸、組織特異性等等。優(yōu)選地，所述修飾包括2'-0-曱基-硫代磷酸寡核糖核香酸修飾。優(yōu)選地，所述修飾包括2'-0-甲基-硫代磷酸寡脫氧核糖核苷酸修飾，鎖核酸、PNA、或嗎啉代修飾，或它們的組合。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種雜交寡核苷酸，該雜交寡核苷酸包含寡核苷酸，其包含2'-0-曱基陽硫代磷酸寡(脫氧)核糖核香酸修飾和鎖核酸。這種特定組合包括更好的序列特異性(和由鎖核酸構成的等效物相比)，以及當和由2'-0曱基-硫代磷酸寡(脫氧)核糖核苷酸修飾構成的寡核苷酸相比時包括改善的效力。隨著核酸才莫擬4支術的出現(xiàn)，已可以產生這樣的分子，其具有和核酸本身類似的、優(yōu)選相同的雜交特性(在種類上，不一定在量上)。這樣的等效物當然也是本發(fā)明的一部分。上述才莫擬等效物的實例是肽核酸、鎖核酸和/或嗎啉代磷酰二胺(morpholinophosphorodiamidate)。本發(fā)明的寡沖亥香f臾等歲文斗勿的適宜的^f旦非限定性實例可以參見(Wahlestedt,C.etal.(2000)，Elayadi,A.N.&Corey,D.R.(2001)，Larsen，H丄，Bentin，T.&Nielsen,P.E.(1999)，Braasch,D.A.&Corey,D.R.(2002),Summerton，J.&Weller,D.(1997)。一種或多種等效物4皮此之間和/或連同核酸的雜交體當然也是本發(fā)明的一部分。在一種優(yōu)選的實施方式中，一種等效物包含鎖核酸，因為鎖核酸呈現(xiàn)更高的靶親和性和降低的毒性，因而顯示出更高的外顯子跳;夭的效率。本發(fā)明的反義寡核苷酸可以包含一種或多種核苷酸類似物。目前開發(fā)了新的核苷酸類似物，作為用于治療4氐抗病毒感染的方法。這些核苷酸類似物通常(雖然并不一定)具有與它們代替的核苷酸類似的結合特性。本發(fā)明的反義寡核苷酸可以摻入這樣的核香酸類似物。本發(fā)明的反義寡核苷酸優(yōu)選并不包含20%以上的上述核苦酸類似物。優(yōu)選地，本發(fā)明的反義寡核苷酸優(yōu)選并不包含10%以上的上述核苦酸類似物。本發(fā)明的反義寡核苷酸優(yōu)選并不包含3%以上的上述核苷酸類似物。本發(fā)明的反義寡核苷酸優(yōu)選并不包含1%以上的上述核普酸類似物。寡核苷酸或其功能等效物可以進一步包含另外的本體以向獲得的分子提供另外的功能?？梢詫晒鈽擞浕蛎庖哒{節(jié)化合物如CpG島加入所述寡核苷酸或其功能等效物中?？梢泽w內或體外遞送反義序列，即，進入前體細月包中(我將對此不加描述，因為代替地也可以將反義體內遞送到內源性前體細胞)。在一種優(yōu)選的實施方式中，包含反義序列的前體細胞用于細胞移植治療。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述化合物包括反義分子或其功能等效物。本發(fā)明的反義分子的功能等效物具有和所述反義分子相同的表達抑制效應(在種類上，不一定在量上)。反義分子或其功能等效物可以以各種方式加以設計。關于反義分子設計的細節(jié)參考[l]以及其中的參考文獻。因此此參考文獻以及其中的參考文獻以引用方式結合于本文。降低或下調節(jié)異常表達基因的表達通常導致降低水平的基因產物，其由所述細胞中的所述基因編碼。所述基因產物優(yōu)選為由所述基因生產的RNA,例如微小RNA。在另一種優(yōu)選的實施方式中，所述化合物包括能夠抑制和/或拮抗所述異常表達基因的功能的蛋白質。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述化合物包括頭蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物。頭蛋白能夠抑制和/或拮抗BMP-4的功能[5]。BMP-4拮抗劑抑制BMP-4的功能。本發(fā)明的其它BMP-4抑制劑/拮抗劑是神經誘導蛋白質(chordin)、ventroptin、4丑專爭原腸胚形成(twistedgastrulation)、高血并唐"i秀導基因(gremlin)或BMP44吉4元劑的DAN家力矣的其它成員、PRDC、骨硬化素(scl畫tin)、CTGF以及卵泡抑素(卵泡素抑制素，follistatin)。因此，在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明4是供了減輕個體中遺傳性肌營養(yǎng)不良(肌肉營養(yǎng)不良)的癥狀的藥劑中的應用。優(yōu)選地，所述拮抗劑包括頭蛋白、神經誘導蛋白質、ventroptin、扭轉原腸胚形成、高血糖誘導基因或BMP4拮抗劑的DAN家族的其它成員、PRDC、骨硬化素、CTGF和/或卵泡4卬素或所述蛋白質的功能部分、衍生物和/或類似物。所述拮抗劑可以作為蛋白質或作為核酸(其包含用于在細胞中表達所述拮抗劑的表達盒)來提供。在此后面的實施方式中，本發(fā)明的化合物優(yōu)選包含用于在細胞中表14達所述拮抗劑的所述表達盒。進一步提供了一種用于刺激成肌細胞(myoblastcell)分化的方法，包括向所述成肌細胞提供BMP-4拮抗劑和/或使所述成肌細胞與BMP-4拮抗劑接觸。進一步提供了一種用于刺激成月幾細/炮分化的方法，包括向所述成月幾細胞提供核酸，其包含用于在所述細胞中表達所述拮抗劑的表達盒。向鄰近細胞提供上述表達盒被認為是向鄰近成肌細胞提供所述BMP-4拮抗劑(即，蛋白質)和/或使鄰近成肌細胞與所述BMP-4拮抗劑(即，蛋白質)接觸。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述鄰近細胞是肌細胞。有許多方式來增加(異常表達)基因在細胞中的表達。非限制寸生實例是引入表達構成體(表達重纟且體，expressionconstruct),其包含用于所述基因的編碼序列，表達轉錄因子，該轉錄因子激活或衍生物和/或部分的表達。還可以在所述細胞中直接轉染由所述基因編碼的蛋白質或RNA。在本文中這些方法共同稱作基因療法。在一種實施方式中，本發(fā)明因此提供了一種應用或方法，其中修飾所述表達包括基因療法?？梢砸泽w外方法或以體內方法進行所述基因療法。在細胞中增加基因產物的表達優(yōu)選導致在所述細胞中增加水平的基因產物。起始水平可以是不可才企測的。肌障礙是一種疾病，其通常對個體的生活具有顯著影響。因此可以采耳又的以減輕肌障礙后果的任何措施可以是指緩解患有所述月幾障石尋的個體。因為可以通過成月幾前體細月包(myoblastprecursorcell)來補充和/或再生分化的肌細胞，所以本發(fā)明特別適用于治療肌障礙。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中，除在所述個體中分化肌細胞的功能失常(當和健康個體相比時)之外，至少一部分由所述患有所述遺傳病的個體所呈現(xiàn)的癥狀是起因于月幾前體細胞的異常分化。肌障礙可以具有遺傳性原因或非遺傳性原因。具有遺傳性原因的疾病的一個優(yōu)選實例是遺傳性月幾營養(yǎng)不良。遺傳性肌營養(yǎng)不良構成一組遺傳病，其特征在于進行性肌萎縮和虛弱。許多這些病癥是由用于肌蛋白的基因中的缺損所引起。不同形式的遺傳性肌營養(yǎng)不良經常在涉及的蛋白質上不同。在這些病癥中的大多數(shù)受影響基因編碼蛋白質，該蛋白質似乎在支持肌纖維結構方面起作用，可替換地某些蛋白質可以與發(fā)生在肌纖維中的生化過程有關。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中所述遺傳病包括遺傳性肌營養(yǎng)不良。肌營養(yǎng)不良通常被遺傳，雖然存在一些病例，其中不存在家族病史。不同形式的遺傳性肌營養(yǎng)不良的臨床表現(xiàn)尤其在下述方面不同首先和最經常受影響的月幾肉、癥狀發(fā)展的速率以及發(fā)作年齡?？衫枚喾Ni貪斷方法來i貪斷遺傳性月幾營養(yǎng)不良和它們之間的差異。幾種方法的組合最經常用來進^f于i貪斷。i貪斷通常以評估患者的病史和體檢開始。可獲得的診斷試驗的實例是血酶試驗(例如用于月幾酸激酶，CK)、月幾組織學評估、DNA試-驗、》茲共4展(MR)、月幾電圖(EMG)以及神經傳導速度研究(NCV)。本發(fā)明披露了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中所述遺傳性月幾營養(yǎng)不良是以下疾病之一貝克型肌營養(yǎng)不良(BMD)、先天性肌營養(yǎng)不良(CMD)、遠端肌營養(yǎng)不良(DD)、杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、艾-德肌營養(yǎng)不良(EDMD)、面肩肱型力幾營養(yǎng)不良(FSH)、月支帶型力幾營養(yǎng)不良(LGMD)、強直性力幾營養(yǎng)不良(MMD)、目艮咽型月幾營養(yǎng)不良(OPMD)。下面簡短描述上述遺傳性肌營養(yǎng)不良的原因。貝克型肌營養(yǎng)不良(BMD)，功能抗肌萎縮蛋白(一種幫助肌細胞保持完整(原樣)的蛋白質)的生產不足夠。先天性肌營養(yǎng)不良(CMD)，影響對肌肉以及有時對眼和/或腦所必需的某些蛋白質的基因突變。遠端肌營養(yǎng)不良(DD)，在影響對月幾肉功能所必需的蛋白質的至少7種基因中的4壬4可一種中的突變。杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)，沒有抗肌萎縮蛋白，一種幫助肌細胞保持完整的蛋白質。艾-德肌營養(yǎng)不良(EDMD)，在產生伊默菌素(emerin)、核纖層蛋白A或核纖層蛋白C、包圍每個肌細胞的細胞核的膜中的蛋白質的基因中的突變。面肩肱型肌營養(yǎng)不良(FSH)，在第4號染色體上失去一片DNA。肢帶型肌營養(yǎng)不良(LGMD)，在影響對肌功能所必需的蛋白質的至少15種不同基因中的任何一種的突變。強直性肌營養(yǎng)不良(MMD),在第19號染色體或第3號染色體上DNA的重復切片。目艮咽型肌營養(yǎng)不良(OPMD)，用于多聚腺苷酸結合蛋白l(PABPNl)的錯誤基因，其被懷疑將RNA和蛋白質聚集在肌細胞的細月包沖亥中。在杜興氏肌營養(yǎng)不良和貝克型肌營養(yǎng)不良中，肌蛋白抗肌萎縮蛋白均受到影響。在杜興氏肌營養(yǎng)不良中，缺少抗肌萎縮蛋白，而在貝克型肌營養(yǎng)不良中，存在某些抗肌萎縮蛋白但其生產最經常不足和/或存在的抗肌萎縮蛋白被反常形成。兩種疾病均與隱性X連鎖遺傳有關。DMD起源于DMD基因中的移碼突變[6;7]。在DMD基因中的移碼導致截短的非功能抗月幾萎縮蛋白的生產[8]。由于在DMD基因中的多突變的結果而發(fā)生BMD。如在貝克型肌營養(yǎng)不良中，存在一些抗月幾萎縮蛋白，這與其中不存在抗肌萎縮蛋白的杜興氏肌營養(yǎng)不良相反，貝克型肌營養(yǎng)不良具有比杜興氏肌營養(yǎng)不良較少嚴重的癥狀。DMD的發(fā)作早于BMD。DMD自身通常出現(xiàn)在幼年(兒童早期)，而BMD通常出現(xiàn)在青少年時期或成年早期。和杜興氏肌營養(yǎng)不良相比，貝克型肌營養(yǎng)不良的發(fā)展更慢以及更少可預測。患有BMD的患者可以存活到成年中期至成年后期。患有杜興氏肌營養(yǎng)不良的患者很少活到超過他們30歲?？辜∥s蛋白在肌纖維中起重要的結構作用，連接細胞外基質和細胞骨架。N端區(qū)結合肌動蛋白，而C末端是抗肌萎縮蛋白糖蛋白復合物(DGC)的一部分，其5爭越月幾膜[9]。在沒有抗肌萎縮蛋白的情況下，機械應力導致肌膜破裂，這引起鈣不受控流入肌纖維內部，從而觸發(fā)4丐激活蛋白酶和纖維壞死[l0]。分化細胞的前體具有特定特性，其使它分化成具有特定功能的細胞。這些特定特性包括涉及細胞分化控制的基因類型的存在和活化狀態(tài)。在本發(fā)明中，已發(fā)現(xiàn)，當異常表達在前體細胞中時，特定控制基因會增加遺傳缺損的癥狀。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述異常表達基因包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(骨形成蛋白4，BMP4)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是調節(jié)因子，其是蛋白質的轉化生長因子-P超家族的成員。它們被合成為大前體分子，其被蛋白酶切割?；钚孕问娇梢杂蓛蓚€相同蛋白質的二聚體或兩種相關骨形態(tài)發(fā)生蛋白的異二聚體構成。骨形態(tài)發(fā)生蛋白和各種各樣的細胞過程有關[12]。BMP涉及某些細胞類型(包括"幾源性細胞)的分化。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中所述轉化生長因子-(3是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)或其功能部分、衍生物和/或類似物，^尤選BMP4或其功能部分、書f生物和/或類合乂物。在另一個方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中所述異常表達基因是所述前體細胞分化成所述分化細胞的控制因子(控制因素)?？刂埔蜃邮沁@樣的因子，其單獨地、或連同其它控制因子來控制前體細胞分化成分化細胞中的至少一個步驟。分化中所述至少一個步驟的控制可以是刺激性的或抑制性的。所述控制因子通過為4言號專爭導級聯(lián)(signal-transductioncascade)的一部分來實現(xiàn)這種控制。所述控制因子優(yōu)選設置于所述信號轉導級聯(lián)的開始，接收來自例如細胞(所述級聯(lián)設置于其中)外的信號。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實施方式中，所述控制因子設置于所述信號轉導級聯(lián)的末端，產生由所述級聯(lián)轉導的信號。控制因子是例如生長因子或轉錄因子。生長因子是小蛋白，其附著于細胞表面上的特定受體并促進這些細胞的增殖、生長、分化和/或成熟。生長因子的實例是粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、月幾肉生長抑制素(GDF-8)和/或成纖維細月包生長因子2(FGF-2)。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明4是供了4艮據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中所述控制因子包括生長因子或其功能部分、衍生物和/或類似物，優(yōu)選成纖維細胞生長因子(FGF2)或胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP3)、BMP4、或其功能部分、衍生物和/或類似物。成纖維細胞生長因子2(FGF2)是單鏈多肽生長因子，其在傷口愈合過程中起到重要作用并且是血管發(fā)生的有效誘導物。由于在fgf-2基因內4吏用了可一齊才灸的起始^f立點(alternativestartsite)，因》匕存在若干不同形式的人蛋白，其大小范圍為18-24kDa。它與成纖維細月包生長因子1具有55%的氨基酸殘基同一性并具有有效的肝素結合活性。在來自中胚層和神經外胚層譜系的各種細胞類型中，生長因子是DNA合成的極有效的誘導物。胰島素樣生長因子II是刺激細胞增殖因子(multiplication-stimulatingfactor)。它是4艮好表4正的中性肽，其#皮i人為由肝分泌并在血液中循環(huán)。它具有生長調節(jié)、月夷島素才羊和有絲19分裂活性(細月包增殖活性，mitogenicactivity)。月夷島素沖羊生長因子結合蛋白3(IGFBP3)是6種同源可溶蛋白質之一，其中同源可溶蛋白質結合胰島素樣生長因子(生長調節(jié)素)并在細胞水平調節(jié)它們的有絲分裂作用和代謝作用。轉化生長因子(TGF)是在自然界存在的許多已表征的生長因子之一。轉化生長因子是激素活性多肽，當加入正常的、非轉化細胞時，其可以誘導轉化的表型。它們的轉化活性起因于兩種另外不相關因子(轉化生長因子oc和轉化生長因子P)的同時作用。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了才艮據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中所述生長因子屬于轉化生長因子-B(TGF13)超家族或是其功能部分、衍生物和/或類似物。TGF13是在各種各樣組織中合成的因子。它在i秀導表型轉化時與TGF-ot協(xié)同作用并且還可以作為負自分泌生長因子。TGF-P在胚胎發(fā)育(embryonaldevelopment)、細月包分化、激素分泌、以及免疫功能中具有作用。TGF-p大多數(shù)作為分開的基因產物TGF-pi、TGF-P2或TGF-卩3的同二聚體(同源二聚體)形式被發(fā)現(xiàn)。已分離了由TGF-pi和2(TGF-pi.2)或由TGF-(32和3(TGF-卩2.3)組成的異二聚體(同源二聚體)。TGF-P蛋白質被合成為前體蛋白。轉化生長因子ot是一種因子，其已在各種各樣的組織(包括上皮組織)、以及母體蛻膜中被分離。它緊密相關于表皮生長因子并結合于EGF受體。TGF-a在誘導表型轉化時與TGF-(3協(xié)同作用，但其生理作用并不清楚。肌肉生長抑制素(還稱作生長和分化因子8)是一種生長因子，其限制肌組織生長，即，體內更高濃度的肌肉生長抑制素引起個體具有更少發(fā)育的月幾肉。月幾肉生長抑制蛋白(myostatinprotein)在月幾細胞中產生，在血液中循環(huán)并作用于肌組織，顯然通過放慢肌干細胞的發(fā)育[ll]。肌肉生長抑制素是蛋白質的TGF-P超家族的成員。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的應用和方法，其中所述控制因子包括肌肉生長抑制素。調節(jié)細胞分化的機制還涉及轉錄因子。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中所述控制因子包括轉錄因子。轉錄因子是開始基因轉錄所需要的蛋白質。轉錄因子可以是組織特異的，其意味著那些因子僅在一種或幾種特異基因的轉錄中具有功能?？商鎿Q地，轉錄因子可以是通用的，涉及許多不同基因轉錄的起始。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法或應用與遺傳缺損的另一種療法結合。作為第一個實例，在其是分化細胞中缺少的或功能異常的基因產物的結果的遺傳缺損中，本發(fā)明的方法或應用優(yōu)選與用于增強缺少的或功能異常的基因產物在分化細胞中的表達的一種方法結合。因此本發(fā)明進一步提供了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，進一步包括向所述個體提供藥劑，該藥劑用于向所述分化細胞提供至少部分的所述突變基因的正常功能。作為第二個實例，在其是分化細胞中缺少的或功能異常的基因產物的結果的遺傳缺損中，本發(fā)明的方法或應用優(yōu)選與一種方法結合，該方法采用將用于所述分化細胞的前體細胞移植到患者以便產生新的和功能分化細胞。前體細胞可以來自健康供體，但在這種情況下，排斥的危險較高[13]。因此，來自患者的前體細胞是優(yōu)選的。在體外基因上改變所述前體細胞以表達受突變影響的基因的功能拷貝。本發(fā)明提供了強所述前體細胞的體內分化能力。在一種另外的實施方式中，本發(fā)明l是供了才艮據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中，通過將患有遺傳缺損的個體的所述前體細胞的表達圖i普與健康個體的相應前體細胞進行比較來確定所述異常表達基因。21當與所述#:康個體中的所述相應前體細胞相比基因至少2倍差異(不同，differentially)表達時，該基因被認為是異常表達的。在本發(fā)明的一個實施例中，利用原(初級，primary)人成月幾細胞培養(yǎng)進行了大規(guī)?；虮磉_時間歷程研究，其中監(jiān)測了在DMD細月包中的月幾細胞生成以及分化細胞對缺少抗月幾萎縮蛋白的首次反應。結果顯示在月幾細月包生成中不同階革史的清楚定相(clearphasing)。在成肌細胞階段已經出現(xiàn)差異并且雖然在健康和DMD培養(yǎng)中似乎同時開始分化，但這表明DMD細胞較少有效地進行分化。先前已進行了研究，其使用基因表達圖i普(profiling)來發(fā)現(xiàn)涉及疾病才幾制的途徑[14-16]。然而，這些研究并沒有在前體細力包(成肌細胞)水平上分析分子差異，而是全集中于分化細胞(肌細胞)本身。作為本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例，已^L測到^:康和DMD細胞培養(yǎng)之間在基因表達方面的顯著差異。將不會預期這種觀測，因為全長抗月幾萎縮蛋白還未在成月幾細月包中表達以及Dp71成月幾細胞表達不應受到突變的阻礙，因為它們位于翻譯起始位點(轉錄起始位點，translationinitiationsite)的上游[17]。差異表達基因之一，成纖維細胞生長因子2(FGF2)在DMD成肌細胞中顯著更低地表達。體外和體內研究表明了FGF2在募集衛(wèi)星細胞進入增殖方面的重要作用。加入重組FGF2可增加增殖成月幾細胞的lt目兩倍并且并不抑制分化的開始[18畫20]。it匕外，Doukas等證明，F(xiàn)GF2和FGF6基因的革巴向轉基因遞送導致骨骼肌修復的增強，這表明FGF基因在再生中的重要性[21]。這些觀測結果表明，在本發(fā)明的實施例中觀測到的更低DMD成肌細胞FGF2表達可以說明在先前報道的DMD培養(yǎng)中降低的成力幾細力包增殖[22-24〗。雖然在DMD細胞培養(yǎng)中增殖能力很可能會降低并且分化受到抑制，但本發(fā)明的實施例的結果表明，不同過程的定時(timing)是類似的。在健康和DMD細胞培養(yǎng)(MCM6、CCNB2、CDC28、CKS2以及RPA3，圖5,'細胞生長和維持，組)中融合誘導以后，同時下調節(jié)涉及增殖的基因。然而，在成肌細胞實際融合成肌管的過程中，在健康和DMD細胞培養(yǎng)之間出現(xiàn)基因表達差異，這再次指示DMD細胞的受到損傷的融合潛力。在本發(fā)明的一個實施例中，已發(fā)現(xiàn)基因被異常表達，其與健康成肌細胞的融合有關，但其很可能并不參與DMD成肌細胞融合。其中，膜金屬內肽酶(MME)和Adlican(DKFZp56411922)被J人為與細胞粘著和細月包間發(fā)信號(cell-cellsignalling)有關，它們對于細胞融合是重要的[25]。在基因表達研究中，層粘連蛋白a2(LAMA2)在DMD細胞培養(yǎng)中連續(xù)更低表達，這使它們?yōu)楦僬持钚缘?。這說明缺少層粘連蛋白a2相關粘著力，其先前已由Angoli等加以報道[26]。意想不到地，線粒體腫瘤抑制劑l(MTUSl)和內皮素受體A型(EDNRA),兩者均被，￡設與發(fā)信號(signalling)有關，在分化開始以后在DMD細胞中僅被上調節(jié)。由于缺少抗肌萎縮蛋白這些基因可能是可替換信號通路的一部分。在時間歷程研究中，原代人成肌細胞分化和融合成肌管需要大約4天。其后，幾乎看不到表達變化并且基因被穩(wěn)定表達[27]。一種驚人的現(xiàn)象是在健康和DMD細胞培養(yǎng)中分化開始以后肌節(jié)基因表達的上調節(jié)以及隨后的顯著降j氐，在笫6天開始，4又在DMD月幾管中可檢測到?？辜∥s蛋白的缺少會引起肌節(jié)不穩(wěn)定，導致繼發(fā)反應，其開始結構基因的下調節(jié)。在成肌細胞分化過程中同時4皮上調節(jié)或下調節(jié)的其它功能類型的蛋白質在以后的時間點并沒有顯示出差異，這表明在DMD培養(yǎng)中這種負反饋是肌節(jié)蛋白的獨特特性。兩種目前有希望的基因療法是基于在DGC復合物中抗肌萎縮蛋白的再構建，其中通過AAV介導引入微DMD基因或通過跳躍外顯子以恢復基因的讀碼區(qū)(讀碼框，readingframe)[28-36]。本發(fā)明的一個實施例的結果表明，這些療法的效力可能不能滿足目前的期望。到現(xiàn)在為止，研究集中于抗肌萎縮蛋白以及它的局部化，但沒有特別地考察治療后肌肉的再生能力。抗月幾萎縮蛋白的存在僅矯正肌節(jié)不穩(wěn)定性并且可能僅減輕(暫時地)而不是治愈患者，因為沒有恢復再生信號通路。從這個觀點考慮，關鍵的是，在這些變化已經發(fā)生以前，在生命早期(年輕時)開始治療?？商鎿Q地，應當尋求另外的(藥物)干涉以再獲得正常M^再生能力。根據(jù)本發(fā)明的應用或方法可以與有希望的基因療法結合加以應用。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中所述遺傳性肌營養(yǎng)不良是貝克型肌營養(yǎng)不良(BMD)或杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，包括跳躍抗肌萎縮蛋白基因的外顯子。本發(fā)明的一個實施例顯示在肌細胞生成過程中健康和DMD成肌細胞之間的分子差異。在DMD成肌細胞中降低的FGF2水平和BMP4的提高的表達會降低增殖能力并使它們?yōu)檩^少分化活性的。此夕卜，觀測到在DMD肌管中肌節(jié)蛋白的更低表達。DMD肌管的降低的增殖、受到損傷的融合以及受到損傷的維持的這種組合可導致不足的肌再生并促^f吏DMD患者的嚴重表型。將體外擴展的(expanded)成肌細胞移植到DMD患者是一種可替換的和有希望的療法[37]。有至少兩種選4奪用來自健康主體的成肌細胞或用自體細胞移植來進行治療。在第一種情況下，宿主對細胞的排斥(起因于免疫應答的誘導)是主要關心的問題[13]。免疫相容供體，優(yōu)選家族成員[37;38],或免疫抑制劑[39;40]用來控制這種免疫應答。自體細月包移才直具有以下優(yōu)點減小免疫系統(tǒng)排斥的可能性。在自體移植以前，必須通過引入功能轉基因[41]或表達盒(其產生外顯子跳躍反義序列[4])來矯正基因缺損。在本發(fā)明的一種實施例中，利用重組AAV來引入《鼓DMD基因。在一種實施方24式中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的應用或方法，其中相對于BMP4的反義寡核苷S臾或siRNA用來降低BMP4在自體成肌細胞中的表達，以及增強所述自體成肌細胞在患者中的再生潛力。本發(fā)明進一步提供了一種化合物在用于修飾基因的表達、用于制備減輕個體中遺傳病的癥狀的藥劑中的應用，其中所述疾病是所述個體的分化細胞中遺傳缺損的結果，其中所述基因在所述分化細述遺傳缺損的基礎的突變。在一種優(yōu)選的實施方式中，作為所述遺傳缺損的基礎的所述突變與一種基因有關并且是從所述基因(突變基因)沒有蛋白質合成或缺損蛋白質合成的結果。在一種進一步優(yōu)選的實施方式中，》務飾所述表達包括當所述異常表達基因在所迷前體細胞中表達不足時提高表達。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述異選地，所述控制因子包括生長因子或其功能部分、衍生物和/或類似物。優(yōu)選地，所述生長因子屬于轉化生長因子-13(TGFi3)超家族或是其功能部分、4汙生物和/或類似物。優(yōu)選地，屬于轉化生長因子-P超家族的所述生長因子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)或其功能部分、衍生物和/或類似物。優(yōu)選地，所述控制因子包括(轉錄)因子，其影響所述異常表達基因的表達。本發(fā)明進一步提供了一種用于刺激成肌細胞分化的方法，包括向所述成肌細胞提供一種化合物，用于在所述成肌細胞中抑制生長因子的表達。4尤選;也，所述抑制包括抑制BMP-4mRNA在所述成肌細胞中的表達。優(yōu)選地，所述方法進一步包括使所述成肌細胞與成熟肌細胞接觸。優(yōu)選地，所述成熟肌細胞獲自患有遺傳性肌營養(yǎng)不良的主體。優(yōu)選地，通過將所述成肌細胞移植到所述個體中來進行所述接觸。優(yōu)選地，所述移植成肌細胞來自配對供體。優(yōu)選地，成月幾細力包是自體成力幾細力包。優(yōu)選地，抑制BMP-4mRNA在所述成肌細胞中的表達包括向所述成肌細胞或其前體提供互補于所述BMP-4基因的BMP-4寡核普酸(反義)。優(yōu)選地，向所述成肌細胞或其前體體外提供所述BMP-4反義寡核苷酸。本發(fā)明進一步4是供了成肌細胞或其前體的集合，其包括BMP-4反義寡核苷酸。進一步4是供了本發(fā)明的應用或方法，其中所述前體是成肌細胞或其前體。優(yōu)選地，^f昔助于病毒轉導DNA序列來抑制所述表達。優(yōu)選地，所述遺傳病包纟舌遺傳性力幾營養(yǎng)不良。優(yōu)選地，所述遺傳性肌營養(yǎng)不良包括以下疾病之一杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、貝克型肌營養(yǎng)不良(BMD)、先天性肌營養(yǎng)不良(CMD)、遠端肌營養(yǎng)不良(DD)、艾-德肌營養(yǎng)不良(EDMD)、面肩肱型肌營養(yǎng)不良(FSH)、肢帶型肌營養(yǎng)不良(LGMD)、強直性肌營養(yǎng)不良(MMD)、眼咽型"幾營養(yǎng)不良(OPMD)。優(yōu)選地，所述化合物包括蛋白抑制劑。優(yōu)選地，其中所述蛋白抑制劑包括生長因子抑制劑或拮抗劑，優(yōu)選BMP-4抑制劑或拮抗劑，優(yōu)選地，其中所述抑制劑或拮抗劑包括頭蛋白、神經誘導蛋白質、ventroptin、扭轉原腸胚形成、高血糖誘導基因或BMP4拮抗劑的DAN家族的其它成員、PRDC、骨硬化素、CTGF和/或卵泡抑素或其功能部分、衍生物和/或類似物。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法或應用進一步包括第二種化合物在用于制備治療所述個體的藥劑中的應用，其中所述第二種化合物向所述分化細胞提供所述突變基因的至少部分正常功能。優(yōu)選地，所述遺傳性肌營養(yǎng)不良是杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)或貝克型肌營養(yǎng)不良(BMD)。優(yōu)選地，所述第二種化合物包括寡核苷酸、或其功能等效物，用于跳躍抗肌萎縮蛋白基因的外顯子。優(yōu)選地，所述第二種化合物包括寡核苷酸或其功能等效物，其互補于抗肌萎縮蛋白基因的外顯子。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了一種化合物在用于降低、抑制和/或拮抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)在細胞中的表達，用于制備減輕個體中遺傳性肌營養(yǎng)不良的癥狀的藥劑中的應用。優(yōu)選地，所述細胞是成肌細胞或其前體。優(yōu)選地，所述化合物包括反義RNA或其功能等效物。本發(fā)明進一步提供了一種用于刺激成肌細胞分化的方法，包括向所述成月幾細月包4是供一種化合物用于降^f氐、抑制和/或拮抗BMP4在所述成肌細胞中的表達。優(yōu)選地，所述化合物(能夠降低和/或抑制)降低和/或抑制BMP4mRNA在所述成肌細胞中的表達。在另一種優(yōu)選的實施方式中，所述化合物(能夠拮抗)拮抗BMP-4的功能。根據(jù)本發(fā)明的應用和/或方法進一步包括使所述成肌細胞與成熟肌細胞接觸。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述成熟肌細胞獲自患有所述遺傳性肌營養(yǎng)不良的主體。本發(fā)明的用于降低和/或抑制BMP4mRNA在所述成月幾細胞中的表達的方法包4舌向所述成月幾細胞或其前體提供互補于所述BMP4基因的BMP4寡核苦酸(反義)。優(yōu)選地，向所述成肌細胞或其前體體外提供所述BMP-4反義寡核苷酸o本發(fā)明進一步提供了成肌細胞或其前體的集合，其包括BMP-4反義寡核苦酸。優(yōu)選借助于病毒轉導DNA序列來獲得降低和/或抑制BMP4的表達。優(yōu)選地，借助于病毒載體向所述細胞提供所述化合物。優(yōu)選地，所述遺傳性力幾營養(yǎng)不良包括以下疾病之一杜興氏月幾營養(yǎng)不良(DMD)、貝克型肌營養(yǎng)不良(BMD)、先天性肌營養(yǎng)不良(CMD)、遠端肌營養(yǎng)不良(DD)、艾-德肌營養(yǎng)不良(EDMD)、面肩肱型肌營養(yǎng)不良(FSH)、肢帶型肌營養(yǎng)不良(LGMD)、強直性肌營養(yǎng)不良(MMD)、眼咽型肌營養(yǎng)不良(OPMD)。優(yōu)選地，所述化合物包括蛋白抑制齊'J。優(yōu)選地，所述化合物包4舌BMP4抑制劑或拮抗劑。優(yōu)選地，所述抑制劑或拮抗劑包括頭蛋白、神經誘導蛋白質、ventroptin、扭轉原腸胚形成、高血糖誘導基因或BMP4拮抗劑的DAN家族的其它成員、PRDC、骨硬化素、CTGF和/或卵泡抑素或其功能部分、衍生物和/或類似物。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法或應用進一步包括第二種化合物在用于制備治療所述個體的藥劑中的應用，其中所述第二種化合物向所述個體的肌細胞提供與所述遺傳性肌營養(yǎng)不良有關的基因(突變基因)的至少部分正常功能。優(yōu)選地，所述遺傳性肌營養(yǎng)不良是杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)或貝克型肌營養(yǎng)不良(BMD)。優(yōu)選地，所述第二種化合物包括寡核苷酸、或其功能等效物，用于跳躍抗肌萎縮蛋白基因的外顯子。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種方法，用于確定BMP4反義寡核苦酸或其功能等效物是否能夠在包含外顯子的BMP4前mRNA中誘導所述外顯子的跳躍，所述方法包括向表達所述BMP4前mRNA的細月包4是供所述寡核苦酸并確定由所述前mRNA產生的成熟mRNA是否缺少所述外顯子。優(yōu)選地，在BMP4mRNA中外顯子的跳躍可降低功能BMP4蛋白質水平的生產水平。在BMP4和DMD中的外顯子跳躍具有不同的目的讀碼區(qū)破壞(或氨基酸的必需的一段序列的排除；BMP4)與讀碼區(qū)矯正(DMD)。如果在所述方法中起因于剪接所述前mRNA的5%以上并且優(yōu)選10%以上的mRNA并不包含所述外顯子，則寡核苷酸或其功能等效物^皮說成是可有效誘導所述外顯子的跳躍，如體外借助于核酸擴增反應(優(yōu)選聚合酶鏈反應，PCR)所測得的，其中在外顯子中的引物在所述外顯子(其#1所述反義寡核苷酸或其功能等效物所靶向)旁側(flank)。優(yōu)選地，所述反義寡核苷酸或其功能等效物互補于所述外顯子。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，所述反義寡核苷酸或其功能等效物互補于所述外顯子的外顯子內部(exon-intemal)部分。在本文中所述外顯子的外顯子內部部分^皮定義為一部分，其互補于所述外顯子并且其并不包括緊密在所述外顯子旁側的內含子序列。優(yōu)選地，所述外顯子內部的寡核苦酸或其功能等效物并不包括在所述外顯子旁側的兩個外顯子剪接接納體(受體)和/或外顯子剪接供體核苷酸中的一個或兩個。優(yōu)選;也，所述反義寡核苦酸或其功能等效物互補于BMP4的外顯子4。某些BMP4專#錄物開始于外顯子-2?？蒦+4類的剪4妄變體也可以存在。在這些情況下，外顯子的編號是從由AONhBMP4弁2鑒定的外顯子進4于計lt,并且如果在外顯子4之前包括在mRNA中的外顯子實際數(shù)目小于或大于3，則也給予此外顯子數(shù)目4。本發(fā)明進一步提供了具有AONhBMP4#2序列的寡核苷酸。本發(fā)明進一步提供了互補于BMP-4的外顯子的反義寡核苷酸或其功能等效物的應用，用于在BMP4前mRNA中跳躍所述外顯子。反義寡核苷酸或其功能等承文物互4卜于BMP-4的外顯子，用于治療遺傳性力幾營養(yǎng)不良。進一步4是供了互補于BMP-4的外顯子的反義寡核苷酸或其功能等效物在用于制備治療遺傳性肌營養(yǎng)不良的藥劑中的應用?？梢酝ㄟ^若干不同方法將所述反義寡核苷酸或其功能等效物提供給所述細胞。一種優(yōu)選的方法是在沒有任何手段的情況下(withoutanymeans)來增強所述寡核苦酸或其功能等效物到所述細胞的轉移。在體內給予所述寡核香酸或其功能等效物的情況下，這是特別優(yōu)選的。在另一種優(yōu)選的實施方式中，借助于病毒載體向所述細力包纟是供所述反義寡核香酸。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述病毒載體包括用于表達所述反義寡核苦酸的表達盒。實施例實施例1才才沐+和方法細應培券原代人成肌細胞分離自三位健康個體(KM109、KM108以及HPP4)和三位DMD患者(DL589.2[外顯子51-55缺失]、DL470.2[外顯子46-50缺失]以及50685.l[外顯子48-50缺失])[42;43]的骨骼肌活檢(活組織檢查)[42]?；顧z時的年齡從2-14歲變化。培養(yǎng)物由存在于初始活才企中的成月幾細月包和其它細胞類型構成。通過結蛋白染色和細胞計數(shù)(如[44]所描述的)對每個活4企確定成肌細胞比例。健康和DMD培養(yǎng)物在成肌細胞的平均百分比(57±20%)方面并沒有差別。在月交原涂布培養(yǎng)瓶的增殖培養(yǎng)基中生長細胞。當細胞80%匯合時，通過用低血清培養(yǎng)基更換高血清培養(yǎng)基來開始分化[27]。所有用于實驗的細胞培養(yǎng)具有4與IO之間的傳代數(shù)。cZ)A^雜Jt<吏用了包含來自人序列證實的40KI.M.AGE.cDNA文庫(ResearchGenetics)的4417個肌相關基因和EST(點才羊一式三^f分)的cDNA微陣列，并且如[27;45]所描述的，對這些微陣列進行PCR擴增、印刷以及預雜交。在第0、1、2、4、6、10以及14天，對來自6種不同細胞培養(yǎng)的總RNA進行分離，擴增、標記并用共同參比進行共雜交(如[27;45]所描述的)。借助于Bioanalyzer芯片實馬全室RNA毫樣吏測定(BioanalyzerLab畫on畫a-ChipRNAnanoassay)(AgilentTechnologies)才全查了總RNA和cRNA的質量和^t量。用Agilent掃描儀(型號2565BA)掃描所有載玻片并用GenePixPro3.0程序(AxonInstruments)量化斑點強度。將原始強度文件輸入RosettaResolverv4.0(RosettaBiosoftware)并用Axon/Genepix4晉誤才莫型加以規(guī)一化。對于每種條件(健康或DMD),考慮對每種基因進行9次測量(3次生物平行測定，3次技術平行測定)并進行嚴格的數(shù)據(jù)分析程序。對規(guī)一化強度高于陰性陣列對照的平均值30+2標準偏差(SD)的基因進行分析。在一種條件(健康或DMD)和在至少一個時間點，這必須是一致的。進行錯誤加權雙向ANOVA，其中時間、疾病4犬態(tài)以及時間和疾病一犬態(tài)之間的相互作用作為變量。當疾病狀態(tài)的P值〈lxl0-5(Bonferron"喬正的)時，則i人為基因^皮差異表達。利用基因本體樹狀4義(GeneOntologyTreeMachine)[46],隨著時間差異表達的基因(P<lxl0-5)在功能上#1分為幾組。定量ir-尸cw通過反轉錄利用隨機六聚體和0.5mg總RNA作為模板，從所有6個細胞培養(yǎng)物的總RNA制備cDNA。利用引物3設計了PCR引沖勿只于(http:〃www-genome.wi.mitedu/cgi畫bin/primer/primer3.cgi/)。在此研究中用于每種基因的寡核苷酸引物對對應于以下核苷酸甘油醛-3-石粦酸脫氬酶、510-529和625-644(NM—002046);BMP4394-413和484-503(NM—001202)以及AQP11129-1148和1227-1246(NM_198098.1)。如所描述的，進行定量PCR(Lightcycler,Roche),其中退火溫度為58°C(對于GAPDH和BMP4)或62°C(對于AQP1)[27]。利用每種基因的稀釋系列，確定最佳cDNA稀度和相對濃度。將每種基因規(guī)一化到甘油醛-3-磷酸脫氫酶mRNA的豐度(隨時間在陣列上顯現(xiàn)恒定表達)。按照[47]中所描述的準則設計MLPA探針。如在[48]中所描述的，用50ng總RNA進行反應，不同之處在于化學合成所有用作半探針的寡核苦酸(IlluminaInc,SanDiego)，并且在PCR反應過程中4吏用兩種熒光團[49]。2ml標記PCR產物與10ml甲酰胺和0.05mlROX500尺寸才示準物(sizestandard)進4亍'混合，然后用ABI3700毛細管測序4義(AppliedBiosystems)進4亍分離。因為存在相當大范圍的峰高度，所以在必要的情況下加載1:10稀度以獲得足夠的非飽和信號。將數(shù)據(jù)輸出到Excel，供進一步分析。對于每種探針，使用相對峰高度作為強度的度量。通過用兩種對照探針(用相同的熒光團加以擴增)的峰高度的總和除以每種探針的相對峰高度來進行歸一化。在陣列分析中，對照探針被靶向在表達水平上沒有顯示顯著變化的基因(鈣聯(lián)蛋白(Calnexin)和蛋白質磷酸酶3調節(jié)亞基B)?；?次測量結果(一式兩份測得的3個培養(yǎng)物)來計算標準誤差。為、化都;t^k^瘦邀織化在分化開始以后，以不同濃度(在0.3到30ng/ml之間)，將重組人BMP4(R&DSystemsInc.)力口入細月包。在培養(yǎng)基變4匕過禾呈中，力口入新的BMP4(每4天)。在血清除去后的第7或11天，用100%甲醇(-20。C)固定細胞。如先前所述[44;49],進行免疫組織化學染色。通過用結蛋白正細胞(=能夠分化的肌源性細胞)的數(shù)目除以肌球蛋白正細胞的^t目x100%來計算分化指數(shù)。為了該分析，擬合廣義線性回歸模型來解釋作為天數(shù)(7或11)、濃度(O、0.3、1、3、10和30ng/ml)以及細胞系(健康和DMD)的函數(shù)的分化差異。利用R2.0.1[50]進行計算。該模型包括表示細胞系與濃度之間的相互作用的一項，該項用來確定細月包系呈J見統(tǒng)計顯著的分4匕比例的單獨的濃度水平。概率分布與(模型)誤差有關，并且計算了正規(guī)和二項式(binominal)誤差分布。結果為了探索人DMD成肌細胞的分化潛力，已進行了大規(guī)才莫基因表達分析。借助于肌相關cDNA陣列分析了6位不同個體(3位健康的，3位DMD)的人原代骨骼肌細胞培養(yǎng)物。在成月幾細胞階,殳(第0天)和在分4匕的不同日期(第1、2、4、6、10以及14天)分離了RNA。為了發(fā)現(xiàn)差異表達的基因，進行了錯誤加權雙向ANOVA，其中時間、疾病4犬態(tài)以及時間與疾病4犬態(tài)之間的相互作用作為變量。在存在于陣列上的4010種獨特基因中，2423種在至少一個時間點在所有健康樣品或所有DMD樣品中給出顯著信號。94種基因在<建康和DMDi咅養(yǎng)物之間差異表達(在DMD中，52種下調，42種上調，p(疾病狀悉;kl'10-5)。意想不到地，已經在未分化細胞(t:0)中，7種基因在RNA表達水平上顯示出2倍以上的差異(表1和附表la/b)。其中兩種(AQP1和BMP4)在整個時間歷程中在DMD中連續(xù)更高表達。借助于定量RT-PCR證實了這種差異(圖1)。Dahlqvist等先前在無限增殖(immortalize)小鼠成月幾細月包(C2C12)中證明，BMP4對肌分化具有抑制效應[51]。為了確定在原代人成肌細胞培養(yǎng)物中是否也適用以及為了查明健康和DMD細胞是否差異應答，將重組BMP4加入細胞。在t=0將重組BMP4加入融合培養(yǎng)基導致在健康和DMD細月包培養(yǎng)物中細月包融合的濃度相關減少(更少的多核的、肌球蛋白正細胞)(圖2、3以及附圖1)。DMD細胞對于BMP4顯著更敏感(p0.05)，因為3倍更低濃度引起類似程度的分化抑制(表2和3)。提供的結果對應于利用正態(tài)分布作為誤差分布(正A見和二項式誤差分布均產生類似的結論)。連同在整個時間歷程中在健康和DMD之間差異表達的基因，存在一'卜組基因，其表達才莫式在誘導分化以后開始偏離(p(疾病狀態(tài))<1.10-5)。圖4表明，這些基因可以分為兩組。首先，在健康細胞培養(yǎng)物中在融合期間被上調節(jié)的基因，其在DMD培養(yǎng)物(BF、Adlican以及MME)中仍然4交^f氐。其次，在健康細月包培養(yǎng)物中具有恒定<氐表達水平4旦在DMD細胞(MTUS1和EDNRA)融合期間4皮上調節(jié)的兩種基因。借助于RT-MLPA證實了這些結果(附圖2)。RT-MLPA是一種才支術，其可以在單反應中快速和同時量化多達4033種專爭錄物。選擇這種才支術，因為它可以以比定量RT-PCR更快速和更便宜的測定來試驗多個樣品和轉錄物。雙向ANOVA還揭示了這樣的基因，其在健康和DMD培養(yǎng)的時間歷程中表達變化相同(n=68，p(時間)〈l'10-5)。在先前的論文[27]中已討論了這些基因在肌細胞生成中的作用。利用基因本體樹狀儀(GeneOntologyTreeMachine),功能上"i兌明了這些基因[46]。圖5示出了健康和DMD細胞(包含^6個基因的功能基團)的平均表達模式。與健康細胞相比，肌節(jié)蛋白(11=10)在DMD中在以后的時間點顯示出顯著降低的表達(配對T檢驗，p<0.01)。在健康和DMD培養(yǎng)物中，其它功能類型顯示出類似的表達模式變化。實施例2在杜興氏肌營養(yǎng)不良成肌細胞中通過外顯子跳躍AON下調節(jié)BMP4表達在6孔平皿中對分離自杜興氏肌營養(yǎng)不良患者(DL589.2)的骨骼肌活檢的人成肌細胞進行增殖至50%的匯合(詳情參見實施例1)。轉染前24小時，將細胞放置在低血清分化培養(yǎng)基上。用下文提及的AON(2'-0陽曱基石克代石粦酸)以100、200、或500nM的濃度來轉染細力包，或未加處理。AON序列hBMP4-弁1:5'gcauggcuegcgecuecuageag3'hBMP4-弁2:5，ccagugcuguggaucugcucuu3，F(xiàn)AM陽AON:5，-FAM-cuuccacauccgguuguuu3'相只于于人BMP4外顯子4中的外顯子內部序列、壽爭錄物變體l(NM一001202)設計了開始的兩個寡核苷酸。最后的寡核苷酸是對照寡核普酸，其應當不影響B(tài)MP4表達，并且包含5，F(xiàn)AM-標i己以可以熒光檢測寡核苷酸攝取。用Exgen500轉染試劑(MBIFermentas,2(^l/|LigAON)轉染AON。在轉染3小時時，洗掉轉染復合物并將新鮮分化培養(yǎng)基加入纟田月包。在轉染后6小時，F(xiàn)AM-AON轉染成肌細胞的細胞核具有明亮熒光，這表明AON的高的核攝取。在轉染后24小時，將細月包溶解于RNABee溶液(IsotexDiagnostics)并利用制造商提供的程序(protocol)分離RNA。通過在70。C下用在13ili1DEPC-水中的40ng無規(guī)(隨機)六聚體引物溫育200ng總RNA10分鐘以將RNA轉錄到cDNA。在冰上冷卻以后，加入4pi的5x第一鏈纟爰沖液(strandbuffer)、2|ul的10mMdNTP、以及1)ul的RevertaidRnaseH-反專爭錄酶(MBIFermentas)，然后在42。C下溫育反應〉、昆合物2小時。通過在70°C下溫育15分鐘來滅活反轉錄酶。對獲得的cDNA稀釋5次。為了"i平估在BMP4中AON介導的外顯子i^J夭，進4亍了以下PCR:PCR1:擴增BMP4基因的外顯子3，以"i平估總BMP4mRNA水平。4吏用的引物序歹'J:BMP4夕卜顯子3正向5，TGAGCCTTTCCAGCAAGTTTGTT3，；BMP4外顯子3反向5，ATCAGCATTCGGTTACCAGG3，PCR2:通過用外顯子3和外顯子5中的引物進行擴增來評估夕卜顯子4的淑bi夭BMP4夕卜顯子3正向5，TGAGCCTTTCCAGCAAGTTTGTT3，；BMP4外顯子5反向5，GGGATGCTGCTGAGGTTAAA3'PCR3:用GAPDH基因中的引物評估cDNA合成GAPDH正向5'GATCATCAGCAATGCCTCCT3';GAPDH反向5，CCATCCACAGTCTTCTGGGT3'進行PCR40個循環(huán)在94。C下變性30秒、在56°C下復性30秒以及在72。C下延伸30秒。在溴化乙錠(溴乙啶，菲啶溴紅)染色瓊脂糖凝膠上顯示PCR片段。結果結果顯示在圖1中。所有三種PCR均產生所期望大小的片段。AONhBMP4#2在所試驗的最高濃度(500nM)誘導外顯子4的跳躍(圖1;圖片B)，可看到作為142bp的更短片段，其中外顯子3被直接剪接到外顯子5。用更低濃度的AONhBMP4#2(200nM)進行轉染導致完全沒有BMP4轉錄物。這通過BMP4基因的外顯子3的外顯子內部PCR加以證實(圖片A)。相反，對照基因GAPDH仍然4皮穩(wěn)定表達(圖片C)，這表明BMP4轉錄物的選4奪性喪失。因為外顯子4的跳躍會破壞BMP4轉錄物中的可讀框，因此我們認為在這種AON濃度下的外顯子跳躍是如此有效以致由于高效無義介導的衰變活性而引起轉錄物喪失。在兩種濃度下，AONhBMP4#2會降低完整BMP4轉錄物的7JC平，因此矯正BMP4mRNA水平向著在來自健康主體的成月幾細胞培養(yǎng)物中的正常水平。AONhBMP4#l和對照FAM-AON并不i秀導外顯子逸W夭。有時，7見測到在外顯子4中隱蔽剪接位點的活化。相對于在mdxx月幾營養(yǎng)不良相關蛋白(utrophin)-/-小鼠中的BMP4和DMD外顯子跳躍反義序列的反義；評估肌力、存活、蛋白質和RNA水平通過雜交雄性mdx+"utrn一.hDMD仏小鼠雌性mdx+:utm、hDMD仏('tHoen等，準備中的手稿)來產生抗肌萎縮蛋白和肌營養(yǎng)不良相關蛋白-缺少小鼠(mdx.utrn一小鼠)。將小鼠放置在標準實'驗室條件下。供給動物普通飼^h(regularchow)并且動物可以隨意獲得^L用水。20-聚體(mer)2'-(9-曱基好u代磷酸核糖核酸是由Eurogentec合成。反義序列祐:輩巴向1.小鼠"wd基因的外顯子23-內含子23界面，序列AON-l:GGCCAAACCUCGGCUUACCU。此AON的序列與由Mann等和Lu等在他們的w血小鼠實-驗中所4吏用的AON相同，并且導致Z)md基因的突變外顯子23的有效跳3夭，乂人而生產功能抗月幾萎縮蛋白[31;52]。2.BMP4。mRNA序列NM—007554的外顯子2中的設計序列AON-2(AGACUGGAGCCGGUAA)和AON-3(UGGCUCGGCUGGCGGG)。注射前，在0.9%(w/v)NaCl中將AON稀釋至50mg/ml的最終濃度。將小鼠隨機分為三組。用5mg的AON-l靜脈注射第一組，在21日齡開始，連續(xù)5天。除AON-l之外，第二組和第三組分別接受5x5mg的AON-2或AON-3。在首次注射以前，以及在首次注射以后的第1、2以及3周，獲取血液樣品，用于確定肌酸激酶活性(對肌損傷的很好建立的生物測定)。在這些相同的時間點，迫4吏動物在Rotarad裝置上奔跑(run)并記錄小鼠倒下之前的時間段(對月幾力的生物測定)。在注射后的第三周，腹膜內給予伊文氏藍(10mg/kg體重)以染色損傷肌。通過頸才,脫位(cercivaldislocation)處死小鼠，并分離朋一腸月幾、四頭肌、脛骨前力幾、心力幾和膈力幾，然后在進一步處-里前快速冷凍在液氮中。如先前所述[53],測量矯正的抗肌萎縮蛋白mRNA轉錄物的水平。如所描述的[53],通過Western印跡來確定抗月幾萎縮蛋白水平。對肌肉的10iam冷凍切片進行標準蘇木素/伊紅染色，以評估肌組織學。確定了平均纖維橫截面積。測定了10個切片/肌肉中的伊文氏藍陽性面積，作為月幾損傷的度量。對切片進行具有NCL-DYS2和CD4抗體的免疫染色，以分析抗肌萎縮蛋白的存在和免疫浸潤液的存在[53]。實施例4在mdx成月幾細月包培養(yǎng)物中遺傳《喬正基因缺損并連同BMP4抑制劑頭蛋白將這些成月幾細胞共注射到mdx小鼠。通過雜交雄性mdx佛.utm^.hDMD仏小鼠雌性mdx+/+.utm-A.hDMD+/-('tHoen等，準備中的手稿)來產生抗肌萎縮蛋白和肌營養(yǎng)不良相關蛋白-缺少小鼠(mdx.utrn一小鼠)。將小鼠放置在標準實,驗室條件下。供給動物普通飼料并且動物可以隨意獲得々欠用水。通過標準力交原酶/分散酶處理和在力交原涂布平皿上標準增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，從雄性mdx，utrn;小鼠的分離的后肢肌獲得小鼠38成月幾細月包[22]。用500nM的AON-l:GGCCAAACCUCGGCUUACCU(2'-(9-曱基硫代磷酸，Eurogentec)轉染增殖的成月幾細胞(lx106個細胞/小鼠)，與聚乙烯亞胺(Exgen500,MBIFermentas,3.5|al/)agAON)復合。在轉染后的第二天，沉淀(pellet)細胞并溶解于7piHank平衡鹽溶液，其包含或不包含頭蛋白，一種眾所周知的BMP4抑制劑(不同量0、10、50或100ng)。4昔助于50|um尖3皮璃吸管(tipglasspipette)，將細胞注入雌性mdx"+.utrn一小鼠的脛骨前肌。在注射以后的第3或10天，處死小鼠，并制備系列冷凍切片。用蘇木素/伊紅以及用抗肌萎縮蛋白和Y-染色體特異抗體對切片進行染色以分析細胞存活、遷移以及抗肌萎縮蛋白表達。附圖簡要i兌明圖1:借助于寡核普酸微陣列(上部圖片)或定量RT-PCR(下部圖片)(Lightcycler，Roche)確定的v4g尸"A)和SM/M(B)的基因表達。x軸以天數(shù)表示時間。y軸表示1og2表達比率(歸一化到健康的，t=0)或-A(Ct)(歸一化到健康的，t=0)。Ct值與mRNA的初始量的4og成比例，因此可相比于4og表達比率。豎線表示不同培養(yǎng)物(n^3)的標準偏差。圖2:用不同濃度的BMP4加以溫育、在分4匕的第7天加以評估的健康和DMD肌管的免疫組織化學染色。用DAPI(藍色)以及對于結蛋白(紅色)和肌球蛋白(綠色)的抗體來染色細胞。圖3:在加入不同濃度的重組BMP4以后，1建康和DMD成月幾細胞的分化指數(shù)。在第7天固定細胞?；貧w才莫型，**p<0.01，*p<0.05。圖4:在"i秀導分化以后在^:康和DMD成月幾細月包之間差異表達基因的Log2基因表達比率；SF、AfME、^d/,'c"w、MH757、五DiV7L4。豎線表示所用不同線(n-3)的標準偏差。圖5:在健康和DMD成肌細胞融合期間在不同功能類型中基因的平均1og2基因表達。肌節(jié)基因表現(xiàn)出在DMD肌細胞生成后期(第6、10以及14天)基因表達的降低。*配對1檢驗，p<0.01。在其它功能類型(細胞生長和維持、蛋白質結合、代謝上調和代謝下調)所涉及的基因在健康和DMD之間在任何時間點(r^6)并沒有顯示顯著差異。圖6:溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠說明在杜興氏肌營養(yǎng)不良患者的成肌細胞中人BMP4的外顯子4的反義寡核苷酸介導的跳躍(如實施例2描述的實-驗)。圖片A示出用PCR1獲得的片4殳(BMP4mRNA的外顯子3);圖片B示出用PCR2獲得的片段(BMP4mRNA的外顯子3-5)。其中外顯子4淵^夭的產物具有142個核苷酸的大小。圖片C示出用PCR3獲得的片段(GAPDHmRNA)。附圖1:在加入不同濃度的重組BMP4以后1"建康和DMD成月幾細月包的分4匕指凄t。在第ll天固定細月包?；貧w才莫型，*p<0.05。附圖2:健康和DMD成肌細胞融合之間隨著時間差異表達基因的基因表達水平(通過RT-MLPA進行試驗)；5F、MME、^J//caw、MTOS7。豎線表示所用不同線(n-3)的標準誤差。40表1:在健康和DMD成肌細胞之間顯示差異基因表達(>2倍)的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表2:分化指數(shù)的廣義線性回歸^^型<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>截距健康細胞培養(yǎng)物的基線比例，其中在第7天BMP4為0.3ng/ml。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05表3:分化指數(shù)的廣義線性回歸模型，ANOVA表<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05附表2:分化指數(shù)的廣義線性回歸模型<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>***P<0.001,**P<0.01，*P<0.05附表3:分化指數(shù)的廣義線性回歸模型，ANOVA表<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>***P<0001,**P<0.01,*P<0.05附表la:在健康和DMD成肌細胞融合之間顯示差異基因表達的基因(在DMD中被上調的基因)Log2表達差異(DMD-健康的)基因庫名稱序列描述p值012461014水通道蛋白l(通道形成整合蛋白，H24316AQP1*28kDa)*1.11E-162.703.272.923.122.442.801.99促分裂原活化蛋A-斜紘AI268273MAP3K5*曰/^^7汰啤雙H^"1.11E-160.971.150.850.670.610.770.65L06622EDNRA*內皮素受體型A*1.11E-16-0.170.621.531.521.641.361.65骨形態(tài)發(fā)生蛋白AA463225BMP4*4*1.55E-151.621.081.531.621.171.360.70轉錄因子AA496896MTSG1*MTSGl*1.59E-140.270.971.362.001.221.391.35運動4申經元1的AA448194S畫l*存活，端粒*9.14E-120.540.470.650.550.490.710.50長醇-磷酸甘露糖基轉移酶多肽2，AA773333DPM2調節(jié)亞基3.86E-110.490.780.670.510.580.710.49AI359037STX3A突觸融合蛋白3A1.13E-090.490.820.810.430.681.090.76AA404269PRICKLE1棘l-樣(果蠅)1.16E-090.530.780.841.140.710.890.46銜接子相關蛋白質復合體1，a2AA437212AP1S2亞基1.81E-090.320.550.800.620.980.750.69MyoD家力臭4中制R44617MDFI劑1.89E-090.110.620.681.440.991.240.61神經纖毛蛋白(NRP)和金屬蛋白酶(tolloid)AA456821NET02(TlX)-樣23.86E-090.840.70.601.000.930.860.96BTB和CNC同源物1，堿性亮氨酸AI336948BACH1拉鏈轉錄因子16.46E-090.590.770.710.650.640.790.63主要組織相容性復合物，II類，DMH42679HLA-DMAa7.65E-090.931.190.921.020.490.600.56AA402874PUTP磷脂轉移蛋白9.83E-090.170.420.551.470.981.290.59細胞骨架蛋白(肌動蛋白解聚因AA424824DSTN*子)*1.62E-080.750.950.680.770.690.520.59AA918646KIAA0830KIAA0830蛋白4.74E-080.730.870.950.270.280.460.20脂肪酸去飽和酶NM_004265FADS221.20E-070.300.621.221.220.110.710.17N35907KIAA0830KIAA0830蛋白2.07E-070.650.850.950.380.020.280.13與YRPW基序2有關的斷裂的多AJ249545HEY2毛/增強子A各船石悉Jt63.62E-070.580.820.751.200.910.550.99賞曰盼私敬力拜吸酶，受體型，f多肽(PTPRF),相互作用蛋白(LIP相N51002PPFIA2關蛋白)，a23.77E-070.690.750.420.680.590.740.46LIM結構域結合H74106LDB224.64E-070.290.390.820.820.800.590.61P21(CDKN1A)-AA505056R26417AA449289AI129115AA458981AF091555AA699926AA677824H65596AI291262N63172AA282983AA485871R97066AA464736N70786AF176422H07920AA704226L07872PAK2STAT5BSMTNFLJ10151FKBP4CTBP1SNTA1*TEAD3SAP18ESTLOCI53222C6orfl29MYOICTGM2FLJ14525ASH1LAA122049FAM35AHEY1MAP2K6TNSRBPSUH轉錄的信號轉導蛋白和激活子5B平滑肌細胞特異基因(smoothelin)CDNAFLJ10151倒轉因子(fis)，克隆HEMBA1003402FK506結合蛋白4,59kDaC端結合蛋白1互生蛋白，al(抗肌萎縮蛋白相關蛋白Al,59kDa,酸性成分)*TEA結構域家族成員3sin3-相關多肽，18kDa智人，類似于透明同系物3(果蠅)，克隆IMAGE:5277415,mRNA4見網膜蛋白第6號染色體可讀框129肌球蛋白IC轉谷氨酰胺酶2(C多肽，蛋白質-谷氨酰胺-Y-谷氨酰轉移酶)假定蛋白FLJ14525灰分(Ashl)(缺少、較小或同源異型)-樣(果蠅)具有序列相似性35的家族，成員A與YRPW基序1有關的斷裂的多4V增強子促分裂原活化蛋張力蛋白無發(fā)(hairless)(果蠅)的重組結合蛋白抑制因子5.53E-076.05E-079.74E-071.03E-061.41E-061.53E-061.99E-062.22E-062.94E-063.21E-063.28E-064.11E-064.45E-065.40E-067.96E-068.70E-060.860.430.400.800.330.630.790.470.710.440.530.710.910.230.160.860.440.290.360.750.361.02E-060.480.610.420.540.640.460.380.660.510.170.650.520.430.780.320.800.330.430.780.370.580.550.730.620.470.280.280.340.180.250.270.330.810.480.780.420.490.330.410.410.330.230.790.510.760.590.931.060.590.620.430.650.480.260.590.390.320.680.500.400.230.580.280.510.950.390.660.021.140.661.200.241.150.770.700.630.630.210.220.310.020.230.710.45.98E-060.340.640.450.530.540.400.146.60E-060.150.460.530.330.410.480.42'.92E-060.700.631.360.630.530.861.000.130.420.210.740.280.740.220.540.380.480.340.590.480.269.79E-060.700.510.310.820.750.530.94*通過測序力口以^正實44<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>權利要求1.一種化合物在用于降低、抑制和/或拮抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)在細胞中的表達，用于制備減輕個體中遺傳性肌營養(yǎng)不良的癥狀的藥劑中的應用。2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，所述細胞是成肌細胞或其前體o3.根據(jù)權利要求1或權利要求2所述的應用，其中，所述化合物包括反義RNA或其功能等效物。4.一種用于刺激成肌細胞分化的方法，包括向所述成肌細胞提供一種化合物用于降〗氏、抑制和/或拮抗BMP4在所述成力幾細胞中的表達。5.才艮據(jù)^又利要求4所述的方法，其中，所述化合物降^f氐和/或抑制BMP4mRNA在所述成月幾細胞中的表達。6.才艮據(jù)4又利要求4或4又利要求5所述的方法，進一步包括4吏所述成月幾細力包與成熟力幾細力包4妄觸。7.根據(jù)權利要求4-6中任一項所述的方法，其中，所述成熟肌細胞獲自患有所述遺傳性肌營養(yǎng)不良的主體。8.根據(jù)權利要求4-7中任一項所述的方法，其中，降低和/或抑制BMP4mRNA在所述成月幾細胞中的表達包括向所述成月幾細胞或其前體提供互補于所述BMP4基因的BMP4寡核苷酸(反義)。9.根據(jù)權利要求4-8中任一項所述的方法，其中，向所述成肌細月包或其前體體外提供所述BMP-4反義寡核苷酸。10.—種包括BMP-4反義寡核苷酸的成肌細胞或其前體的集合。11.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的應用、或根據(jù)權利要求4-9中任一項所述的方法，其中，借助于病毒轉導DNA序列來降低、抑制和/或拮抗表達。12.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的應用、或根據(jù)權利要求4-9中任一項所述的方法，其中，借助于病毒載體向所述細胞才是供所述化合物。13.根據(jù)權利要求1-12中任一項所述的應用或方法，其中，所述遺傳性肌營養(yǎng)不良包括以下疾病之一杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、貝克型月幾營養(yǎng)不良(BMD)、先天性月幾營養(yǎng)不良(CMD)、遠端肌營養(yǎng)不良(DD)、艾-德肌營養(yǎng)不良(EDMD)、面肩肱型肌營養(yǎng)不良(FSH)、肢帶型肌營養(yǎng)不良(LGMD)、強直性肌營養(yǎng)不良(MMD)、目艮咽型肌營養(yǎng)不良(OPMD)。14.根據(jù)權利要求1-13中任一項所述的應用或方法，其中，所述化合物包括蛋白抑制劑。15.根據(jù)權利要求1-14中任一項所述的應用或方法，其中，所述化合物包括BMP4抑制劑或拮抗劑。16.根據(jù)權利要求14或權利要求15所述的應用或方法，其中，所述抑制劑或拮抗劑包括頭蛋白，神經誘導蛋白質，ventroptin，扭轉原腸胚形成，高血糖誘導基因或BMP4拮抗劑的DAN家力臭的其它成員，PRDC，骨石更化素，CTGF和/或卵泡抑素或其功能部分、書t生物和/或類似物。17.根據(jù)權利要求1-16中任一項所述的應用或方法，進一步包括第二種化合物在用于制備治療所述個體的藥劑中的應用，其中所述第二種化合物向所述個體的力幾細胞l是供與所述遺傳性月幾營養(yǎng)不良有關的基因(突變基因)的至少部分正常功能。18.根據(jù)權利要求1-17中任一項所述的應用或方法，其中，所迷遺傳性肌營養(yǎng)不良是杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)或貝克型肌營養(yǎng)不良(BMD)。19.根據(jù)權利要求18所述的應用，其中，所述第二種化合物包括寡核苦酸、或其功能等效物，用于跳躍抗肌萎縮蛋白基因的外顯子。20.—種用于確定BMP4反義寡核苦酸或其功能等效物是否能夠在包含外顯子的BMP4前mRNA中誘導所述外顯子的跳躍的方法，所述方法包括向表達所述BMP4前mRNA的細胞纟是供所述寡核苷酸并確定由所述前mRNA產生的成熟mRNA是否缺少所述外顯子。21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述反義寡核苷酸或其功能等效物互補于所述外顯子。22.根據(jù)權利要求20或權利要求21所述的方法，其中，所述反義寡核苷酸或其功能等效物互補于所述外顯子的外顯子內部部分。23.根據(jù)權利要求20-22中任一項所述的方法，其中，所述反義寡核苦酸或其功能等效物互補于BMP4的外顯子4。24.互補于BMP-4的外顯子的反義寡核苷酸或其功能等效物的應用，用于在BMP4前mRNA中跳5夭所述外顯子。25.互補于BMP-4的外顯子的反義寡核香酸或其功能等效物，用于治療遺傳性力幾營養(yǎng)不良。26.互補于BMP-4的外顯子的反義寡核苦酸或其功能等效物在用于制備治療遺傳性肌營養(yǎng)不良的藥劑中的應用。27.根據(jù)權利要求20-26中任一項所述的應用或方法，其中，借助于病毒載體向所述細胞提供所述反義寡核苷酸。28.根據(jù)權利要求27所述的應用，其中，所述病毒載體包括用于表達所述反義寡核苷酸的表達盒。全文摘要本發(fā)明提供了用于減輕遺傳病的方式和方法。在分化細胞中具有表型的遺傳缺損可以導致在其前體細胞中的缺損。這些所謂的繼發(fā)性缺損成為個體綜合疾病的原因。在本發(fā)明中，目的在于減輕遺傳病癥狀的基因干擾涉及分化細胞中的原發(fā)性遺傳缺損和前體細胞中的繼發(fā)性缺損。文檔編號A61K38/18GK101472603SQ200780023059公開日2009年7月1日申請日期2007年4月20日優(yōu)先權日2006年4月20日發(fā)明者加里-讓·布德韋恩·范奧姆門,彼得·亞伯拉罕·克利斯蒂安·T霍恩,彼得羅妮拉·約翰娜·伊麗莎白·施特爾恩貝爾赫,約翰內斯·特奧多魯斯·登鄧恩內恩申請人:萊頓教學醫(yī)院