專利名稱：用于檢測染色體非整倍性的方法
用于檢測染色體非整倍性的方法引用的相關(guān)申請本申請要求2009年8月11日提交的美國臨時專利申請第61/233，042號和2010年2月26日提交的美國臨時專利申請第61/308，578號的優(yōu)先權(quán)，出于各種目的，每個專利申請的內(nèi)容通過引用全文并入本文。
背景技術(shù)：
根據(jù)醫(yī)院和醫(yī)學(xué)專業(yè)人員目前使用的各種方法，在妊娠期間可以檢測各種遺傳疾病，例如染色體非整倍性。然而，這些方法中的大多數(shù)是侵入性的，并且具有意外的胎兒丟失或流產(chǎn)的風(fēng)險。使用母體血漿中的胎兒DNA進(jìn)行染色體非整倍性的非侵入性產(chǎn)前診斷，是一個得到積極研究的領(lǐng)域，并且明確需要新的和更為可靠的早期檢測方法。本發(fā)明提供了通過胎兒特異性的表觀遺傳標(biāo)志物和遺傳標(biāo)志物的組合來檢測染色體非整倍性(例如21三體)的新方法。具體而言，使用包括聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制性分析和甲基化DNA的免疫沉淀的方法，然后使用覆瓦式陣列(tiling array)雜交(MeDIP-芯片)，以及用亞硫酸鹽測序確認(rèn)任何靶基因座，本發(fā)明人搜索了染色體21、18、和13上在胎盤和母體血細(xì)胞中差別甲基化的胎兒DNA標(biāo)志物。使用甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶消化，之后使用實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或微流體數(shù)字PCR分析，對得到的標(biāo)志物進(jìn)行了分析。通過比較這些表觀遺傳標(biāo)志物與遺傳標(biāo)志物的劑量，進(jìn)行了染色體劑量分析，所述遺傳標(biāo)志物為源自胎兒且能夠通過其獨(dú)特的多核苷酸序列與母體DNA序列相區(qū)分的DNA序列。此類遺傳標(biāo)志物的一個實(shí)例是存在于Y染色體上的鋅指蛋白Y連鎖(ZFY)基因。例如，發(fā)現(xiàn)全羧化酶合成酶(HLCS)基因的推定啟動子在胎盤中高甲基化，而在母體血細(xì)胞中低甲基化。使用高甲基化HLCS和ZFY基因座進(jìn)行的染色體劑量比較可以區(qū)分21三體和整倍體胎盤DNA樣品。本發(fā)明人證實(shí)，表觀遺傳-遺傳染色體劑量方法是用于非侵入性母體檢測染色體非整倍性的新方法，所述染色體非整倍性例如21三體(T21)、18三體(T18)、或13三體(T13)。利用涉及于染色體非整倍性的任何染色體上的表觀遺傳標(biāo)志物，該方法提供了一種用于非侵入性產(chǎn)前診斷的普遍可用技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于檢測孕婦懷有的胎兒中的染色體非整倍性的方法。所述方法包括下述步驟(a)測定取自所述孕婦的生物樣品中胎兒來源的甲基化標(biāo)志物的量，其中所述甲基化標(biāo)志物位于與染色體非整倍性相關(guān)的染色體上或位于與染色體非整倍性相關(guān)的染色體的區(qū)段內(nèi)，并且其中所述胎兒來源的甲基化標(biāo)志物由于DNA差別甲基化而與其母體來源的對應(yīng)物相區(qū)分；(b)測定所述樣品中胎兒來源的遺傳標(biāo)志物的量，其中所述遺傳標(biāo)志物位于參照染色體上，并且其中所述胎兒來源的遺傳標(biāo)志物由于多核苷酸序列的差別而與所述樣品中其母體來源的對應(yīng)物相區(qū)分，或所述遺傳標(biāo)志物不存在于所述母體基因組中；(C)測定來自(a)和(b)的所述量的比率；以及(d)將所述比率與標(biāo)準(zhǔn)對照進(jìn)行比較，其中所述比率高于或低于標(biāo)準(zhǔn)對照指示了胎兒中存在染色體非整倍性。通常，標(biāo)準(zhǔn)對照值近似人基因組中預(yù)期的基因或染色體的劑量或比率，但是取決于檢測方法中使用的具體方法學(xué)，可能存在微小變化。例如，在整倍體男性基因組中，存在2個拷貝的染色體21和I個拷貝的Y染色體。因此,染色體21上的表觀遺傳標(biāo)志物與Y染色體上的遺傳標(biāo)志物之間的劑量比率可能是大約2。在一些情況下，所述胎兒來源的甲基化標(biāo)志物來自胎盤。在其它情況下，所述母體來源的對應(yīng)物來自孕婦的血細(xì)胞。所述胎兒來源的甲基化標(biāo)志物可以比其母體來源的對應(yīng)物甲基化程度高，或它可以比其母體來源的對應(yīng)物甲基化程度低。在一些情況下，所述樣品是母體全血、血清、血漿、尿液、羊水、生殖道灌洗液、胎盤組織樣品、絨毛膜樣品、或含有分離自母體血液的胎兒細(xì)胞的樣品。在其它情況下，所述樣品是含有胎兒核酸的任何樣品。在一些情況下，所述甲基化標(biāo)志物是全羧化酶合成酶(HLCS)基因的一部分或鄰近全羧化酶合成酶(HLCS)基因。例如，如表2所示的所述HLCS基因的若干區(qū)域(包括推定啟動子區(qū)域)可用作甲基化標(biāo)志物。其它甲基化標(biāo)志物包括標(biāo)志物18A和標(biāo)志物13A。如下限定其它甲基化標(biāo)志物約15至450個核苷酸的區(qū)域且包含一個胞嘧啶，所述區(qū)域?yàn)?I)選自 MAT. 18. 0094,MAT. 13. 0023,MAT. 13. 0020,MAT. 13. 0038,MAT. 18. 007UMAT. 18. 0097、MAT. 21. 0178、和TAS. 21. 1175的基因組基因座；或(2)不超過所述基因座上游和/或下游10kb。如下限定染色體21上的一些特定標(biāo)志物染色體21上約15至450個核苷酸的區(qū)域且包含一個胞嘧啶，所述區(qū)域?yàn)?I)選自CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶I、調(diào)控(抑制性)亞基2假基因2(PPP1R2P2)、和類FemlA(秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans))的基因組基因座，或(2)不超過所述基因座上游和/或下游10kb。結(jié)合本文所述的任一種或多種遺傳標(biāo)志物，預(yù)期這些甲基化標(biāo)志物用于根據(jù)本發(fā)明的檢測方法中。在一些情況下，步驟(a)包括用差別修飾甲基化和非甲基化DNA的試劑處理所述樣品。這樣的試劑可包括亞硫酸氫鹽或基于甲基化狀態(tài)結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)或化學(xué)品；或者，所述試劑可包括優(yōu)先切割甲基化DNA或優(yōu)先切割非甲基化DNA的酶。在一些情況下，所述遺傳標(biāo)志物不存在于母體基因組中。在其它情況下，所述遺傳標(biāo)志物位于Y染色體上。通常，所述胎兒來源的遺傳標(biāo)志物基于遺傳多態(tài)性而與母體來源的遺傳標(biāo)志物相區(qū)分，所述遺傳多態(tài)性包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、簡單串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性、和插入-缺失多態(tài)性。在一個實(shí)施例中，所述遺傳標(biāo)志物是鋅指蛋白Y連鎖(ZFY)基因。在另一個實(shí)施例中，所述遺傳標(biāo)志物是在TMED8基因中包含SNP rs6636的基因組序列，例如SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2。在一些情況下，可以使用多于一種甲基化標(biāo)志物或多于一種遺傳標(biāo)志物。通常，步驟(a)或步驟(b)可包括擴(kuò)增所述甲基化標(biāo)志物和/或遺傳標(biāo)志物、尤其是胎兒來源的甲基化標(biāo)志物和遺傳標(biāo)志物的過程。例如，所述擴(kuò)增為通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，例如甲基化特異性PCR ;或者所述擴(kuò)增可以是核酸序列特異性擴(kuò)增。 在一些情況下，通過分子計數(shù)進(jìn)行步驟(a)或(b)。在其它情況下，步驟(a)或(b)包括數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、陣列捕獲、基于核酸序列的檢測、大規(guī)模平行基因組測序、單分子測序、或用彩色編碼探針對進(jìn)行的多核苷酸多重檢測。在一些其它情況中，步驟(a)或(b)包括質(zhì)譜或與微陣列雜交、熒光探針、或分子信標(biāo)。在一些情況下，與染色體非整倍性相關(guān)的染色體是染色體13、18、21、或X。為了進(jìn)行數(shù)據(jù)解讀，在一些情況下，當(dāng)所述比率高于或低于標(biāo)準(zhǔn)對照至少I個標(biāo)準(zhǔn)偏差時，其指示了胎兒中存在染色體非整倍性，而在其它情況下，當(dāng)所述比率高于或低于標(biāo)準(zhǔn)對照至少2個或甚至3個標(biāo)準(zhǔn)偏差時，指示了胎兒中存在染色體非整倍性。
上述方法在廣泛應(yīng)用時，可以用于評估特定目標(biāo)染色體相比其它染色體的量的任何潛在變化的非診斷情況中，所述其它染色體為不疑似其相對量具有任何變化的參照染色體。本發(fā)明還可以以裝置或包括一個或多個此類裝置的系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)施，所述裝置或系統(tǒng)能夠?qū)嵤┍疚乃龇椒ú襟E的全部或部分。例如，在一些情況下，在接納取自孕婦的生物樣品后，所述裝置或系統(tǒng)執(zhí)行下述步驟(a)測定樣品中與染色體非整倍性相關(guān)的源自胎兒的甲基化標(biāo)志物的量；(b)測定樣品中參照染色體上的源自胎兒的遺傳標(biāo)志物的量；(C)測定來自(a)和(b)的所述量的比率；和(d)將所述比率與標(biāo)準(zhǔn)對照進(jìn)行比較，以及提供指示胎兒中是否存在染色體非整倍性的輸出。在其它情況下，在步驟(a)和(b)已經(jīng)執(zhí)行并且來自(a)和(b)的所述量已經(jīng)輸入到裝置中之后，本發(fā)明的裝置或系統(tǒng)執(zhí)行步驟(C)和(d)的工作。優(yōu)選地，所述裝置或系統(tǒng)為部分或全部自動化的。附圖簡要說明圖I. HLCS區(qū)域B2的克隆和亞硫酸鹽測序結(jié)果。在第一排對個體CpG位點(diǎn)進(jìn)行編號，其中相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(位置O)定義核苷酸位置。第一 CpG位點(diǎn)(-232)對應(yīng)于UCSC基因組瀏覽器(UCSC Genome Browser)的人類2006年3月(hgl8)匯編的chr21 37275031 (反向鏈)。每個后面的排描繪了通過克隆研究的單個DNA分子中CpG位點(diǎn)上的甲基化狀態(tài)。實(shí)心環(huán)和空心環(huán)分別代表甲基化和非甲基化的CpG位點(diǎn)。來自21三體、正常的首三月和正常的末三月胎盤組織樣品的克隆分別用前綴“T21PLN，” “正常的PLNlst”和“正常的PLN 3ri”標(biāo)記，而來自母體血細(xì)胞的那些克隆用前綴“MBC”標(biāo)記。通過前綴后的樣品編號來表示來自不同妊娠個體的胎盤和母體血細(xì)胞。圖2.基因劑量實(shí)驗(yàn)的數(shù)字讀出。HLCS和RASSF1A測定以單重形式運(yùn)行，而ZFX/Y測定以雙重形式運(yùn)行。每個芯片分成12個面板，每個面板間隔成765個反應(yīng)孔。具有靶分子的反應(yīng)孔以紅色或藍(lán)色點(diǎn)顯示，而無擴(kuò)增的反應(yīng)孔以灰色點(diǎn)顯示。HLCS、RASSF1A和ZFY顯示為紅色。ZFX顯示為藍(lán)色。(A)用于酶消化的整倍體胎盤DNA樣品的數(shù)字PCR結(jié)果的圖示。每個樣品占據(jù)4個面板，因此每個芯片可以容納3個樣品。(B)用于經(jīng)酶消化的母體血漿DNA樣品的數(shù)字PCR結(jié)果的圖示。來自樣品的DNA均勻分布在全部12個面板中。應(yīng)注意，對于母體血漿分析，ZFY (胎兒DNA)的拷貝數(shù)遠(yuǎn)低于ZFX (胎兒加母體的DNA)的拷貝數(shù)。圖3.整倍體和21三體胎盤組織DNA樣品中的基因劑量比較。(A)HLCS與RASSF1A的比率。(B)HLCS與ZFY的比率。虛線描繪正常參照范圍。圖4.整倍體和21三體母體血漿DNA樣品中的基因劑量比較。針對每個樣品繪出了 HLCS與ZFY的比率。虛線描繪正常參照范圍。圖5. 4個數(shù)字PCR測定(HLCS、RASSF1A、ZFY和ZFX)的基因組序列。示出了 UCSC基因組瀏覽器的人類2006年3月參照序列(NCBI Build 36. I)上的染色體位置。帶下劃線的核苷酸代表酶識別位點(diǎn)。大寫字母的粗體核苷酸代表正向和反向引物。小寫字母的粗體核苷酸代表小溝結(jié)合(MGB)探針序列。圖6. (A)HLCS區(qū)域B2和(B) C2Iorf81的COBRA結(jié)果的凝膠電泳。分析了 2個21三體胎盤(T21PLN)、2個正常的首三月胎盤(正常的PLN Ist)、2個正常的末三月胎盤(正常的PLN 3’、和2個首三月母體血細(xì)胞(MBC)。用(+)或不用(-)Bstn酶孵育PCR產(chǎn)物。通過出現(xiàn)較小的消化產(chǎn)物來檢測DNA甲基化。在凝膠電泳中使用了 Ikb梯狀條帶(InvitrogenCarlsbad, CA) (M)。圖7.來自4個胎盤組織和8個母體血細(xì)胞的HLCS DNA的定量。通過將酶消化后HLCS的拷貝數(shù)除以由模擬消化獲得的拷貝數(shù)，計算樣品的甲基化指數(shù)?！罢５腜LN”代表胎盤DNA，“MBC”代表母體血細(xì)胞DNA。圖8.血漿中的產(chǎn)后清除。㈧用⑴或⑶不用㈠限制性酶消化的母體血漿樣品中HLCS的檢測?！扒啊贝矸置淝暗难獫{樣品，“后”代表分娩后的血漿樣品。通過以線連接的相同標(biāo)示描繪來自相同個體的成對樣品。圖9.整倍體和21三體胎盤組織DNA樣品中的染色體劑量比較，所述比較通過測定(A)HLCS與經(jīng)模擬消化的TMED8-C的比率和(B)HLCS與經(jīng)BstH消化的TMED8-C的比率進(jìn)行。虛線描繪正常參照范圍。

圖10.整倍體和21三體胎盤組織DNA樣品中的染色體劑量比較，所述比較通過測定(A)HLCS與經(jīng)模擬消化的TMED8-G的比率和(B)HLCS與經(jīng)BstH消化的TMED8-G的比率進(jìn)行。虛線描繪正常參照范圍。圖11. BstUI消化的、整倍體和21三體母體血漿DNA樣品中的染色體劑量比較，所述比較通過測定(A)高甲基化HLCS與TMED8-C等位基因的比率和(B)高甲基化HLCS與TMED8-G等位基因的比率進(jìn)行。虛線描繪正常參照范圍。圖12.通過克隆的亞硫酸鹽測序測定的6對首三月整倍體胎盤和母體血細(xì)胞中標(biāo)志物18A的DNA甲基化水平。對每個樣品的總計8個克隆進(jìn)行了標(biāo)度。以實(shí)心環(huán)代表甲基化位點(diǎn)，而以空心環(huán)代表非甲基化位點(diǎn)。通過將甲基化克隆的數(shù)量除以每個CpG位點(diǎn)處克隆的總數(shù)而得到每個CpG位點(diǎn)處的甲基化指數(shù)(MI)。通過將克隆的甲基化CpG位點(diǎn)的數(shù)量除以每個樣品的克隆的CpG位點(diǎn)總數(shù)而得到甲基化位點(diǎn)頻率。標(biāo)示出緊鄰CpG位點(diǎn)的每個基因組位置的甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)位置。根據(jù)UCSC基因組瀏覽器(genome.ucsc.edu)的人類基因組2006年3月匯編(hgl8)定義基因組位置。圖13.通過Epityper測定分析整倍體(η = 6)和Τ18(η = 6)胎盤中標(biāo)志物18Α的DNA甲基化水平。全部Τ18和整倍體胎盤都獲自首三月。使用曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)(MannWhitney Rank Sum Test)比較整倍體病例與T18病例在每個CpG單元處的甲基化指數(shù)(MI)。圖14.母體血漿中抗消化的標(biāo)志物18A序列的表征。(A)分娩胎兒之前和之后母體血漿中抗消化的標(biāo)志物18A DNA的濃度。⑶在懷有男性胎兒的孕婦中，抗消化的標(biāo)志物18A DNA的濃度與建立的胎兒遺傳標(biāo)志物ZFY的濃度之間的相關(guān)性。圖15.在整倍體(η = 5)和18三體(Τ18) (η = 5)胎盤DNA樣品中染色體18 (標(biāo)志物18Α)與Y染色體(ZFY)的相對劑量。通過虛線描繪正常參照范圍(平均值±1. 96SD)。圖16.在整倍體(η = 27)和18三體(Τ18) (η = 9)母體血漿樣品中胎兒染色體18(標(biāo)志物18Α)與Y染色體(ZFY)的相對劑量。通過虛線描繪正常參照范圍(平均值±1. 96SD)。圖17. 3對首三月整倍體胎盤和母體血細(xì)胞中肌動蛋白基因區(qū)域的DNA甲基化水平，通過克隆的亞硫酸鹽測序測定。亞硫酸鹽測序數(shù)據(jù)的結(jié)果參見圖12。此區(qū)域用于開發(fā)對照測定，以用于檢查酶消化的效率。 圖18.通過克隆的亞硫酸鹽測序分析的整倍體胎盤(η = 6)和母體血細(xì)胞(η =6)中標(biāo)志物13Α的DNA甲基化水平。全部樣品都獲自首三月。對每個樣品的總計8個克隆進(jìn)行了標(biāo)度。以實(shí)心環(huán)代表甲基化位點(diǎn)，而以空心環(huán)代表非甲基化位點(diǎn)。通過將甲基化克隆的數(shù)量除以每個CpG位點(diǎn)處克隆的總數(shù)而得到每個CpG位點(diǎn)處的甲基化指數(shù)(ΜΙ)。通過將克隆的甲基化CpG位點(diǎn)的數(shù)量除以每個樣品的克隆的CpG位點(diǎn)的總數(shù)而得到甲基化位點(diǎn)頻率。標(biāo)示出緊鄰CpG位點(diǎn)的每個基因組位置的甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)位置。根據(jù)UCSC基因組瀏覽器(genome, ucsc. edu)的人類基因組2006年3月匯編(hgl8)繪出基因組位置。圖19.通過Epityper測定分析整倍體(η = 5)和Τ13(η = 5)胎盤中標(biāo)志物13Α的DNA甲基化水平。13三體(Τ13)胎盤中的4個獲自首三月，I個獲自中三月。全部整倍體胎盤都獲自首三月。使用曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)比較整倍體病例與Τ13病例的每個CpG單元處的MI。圖20.通過測定抗消化的標(biāo)志物13Α與ZFY的比率進(jìn)行整倍體(η = 10)和13三體(Τ13) (η = 5)胎盤DNA樣品中的染色體劑量比較。虛線描繪正常參照范圍。定義本申請使用的術(shù)語“妊娠相關(guān)疾病”是指可能影響孕婦、該孕婦所懷的胎兒或者孕婦和胎兒二者的任何病癥或者疾病。這種病癥或者疾病可能在有限的時間段顯示其癥狀，例如在妊娠或者分娩期間，或者可能在胎兒出生后持續(xù)其一生?！叭焉锵嚓P(guān)疾病”必定伴隨妊娠，且不僅僅是孕婦偶發(fā)病癥。換而言之，所述疾病不是非妊娠婦女可發(fā)生的疾病。妊娠相關(guān)疾病的一些實(shí)例包括異位妊娠、先兆子癇、早產(chǎn)、和胎兒染色體異常例如13、18、或21三體。本文使用的術(shù)語“染色體非整倍性”包括表現(xiàn)具有染色體異常數(shù)量的任何遺傳缺陷，包括具有比任一個染色體正常數(shù)量多或少的染色體，以及除正常對之外具有任一個染色體的多余部分，或者缺少正常對中任一個染色體的一部分。在一些情況下，所述異?？梢陨婕岸嘤谝粋€染色體，或一個或多個染色體的多于一個部分。最常見的染色體非整倍性為三體，例如21三體，其中受累患者的基因組具有3個染色體21，而非正常的2個(即I對)染色體21。在較少情況中，除正常對之外，患者可能具有染色體21的額外片段(少于全長)。在其它情況下，染色體21的一部分可能移位到其它染色體例如染色體14上。在這一實(shí)例中，染色體21稱為“與染色體非整倍性相關(guān)的染色體”，而第二、非相關(guān)的染色體(即，患者基因組中正常對中存在的染色體)例如染色體I為“參照染色體”。還存在其中相關(guān)染色體的數(shù)量小于正常數(shù)量2的情況。特納綜合征是這樣的染色體非整倍性的一個實(shí)例，其中女性個體的X染色體的數(shù)量從2個減少為I個。在與“甲基化標(biāo)志物”進(jìn)行比較以測定它們的相對量或濃度(即比率)的上下文中使用的“遺傳標(biāo)志物”是指，存在于參照染色體的基因組序列中的多核苷酸序列，基于多核苷酸序列(例如多態(tài)性)的差異或者所述序列的存在或根本不存在(例如序列存在于男性胎兒的Y染色體上，而不存在于孕婦的基因組中)，所述多核苷酸序列允許不同等位基因(例如來自兩個不同個體的等位基因，例如來自胎兒的等位基因相對于來自孕婦的等位基因)彼此相區(qū)分。在此上下文中，位于與染色體非整倍性相關(guān)的染色體上的“甲基化標(biāo)志物”是指具有異常數(shù)量的染色體上基因組多核苷酸序列；或者在其中存在染色體額外片段或缺少染色體的一部分的情況下，所述"甲基化標(biāo)志物"位于相關(guān)染色體的所述片段或部分內(nèi)。甲基化標(biāo)志物的甲基化模式的差異允許相應(yīng)的甲基化標(biāo)志物與兩個不同個體(例如胎兒和孕婦)相區(qū)別。
本文使用的術(shù)語“表觀遺傳狀態(tài)”是指除了一級核苷酸序列以外的核酸(例如DNA或RNA)分子水平的任何結(jié)構(gòu)特征。例如，基因組DNA的表觀遺傳狀態(tài)可以包括其二級或三級結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)由例如其甲基化模式或者其與細(xì)胞蛋白的結(jié)合決定或受到它們的影響，所述細(xì)胞蛋白例如組蛋白和此類蛋白的修飾形式(例如乙?；⑷ヒ阴；⒑图谆?。當(dāng)本申請使用術(shù)語“甲基化模式”或“甲基化狀態(tài)”來描述基因組序列的甲基化狀態(tài)時，是指位于與甲基化相關(guān)的特定基因組基因座的DNA片段的特征。這種特征包括、但不限于，此DNA序列內(nèi)的任何胞嘧啶(C)殘基是否是甲基化的、甲基化C殘基的位置、殘基的任何特定序列中甲基化C的百分比、以及甲基化的等位基因差異，所述差異歸因于例如等位基因來源的差異。術(shù)語“甲基化模式”或者“甲基化狀態(tài)”還指生物樣品中殘基的任何特定序列中甲基化C或非甲基化C的相對或者絕對濃度。本文使用的術(shù)語“單核苷酸多態(tài)性”或“SNP”是指在相同基因的不同等位基因內(nèi)存在于單核苷酸殘基處的多核苷酸序列變化，所述相同基因可以是位于來自相同個體的相同染色體2個拷貝上的相同基因(例如來自胎兒的2個等位基因)，或者可以是來自不同個體(例如胎兒和孕婦)的相同基因。該變化可能發(fā)生在基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)(例如啟動子區(qū)或其附近，或者內(nèi)含子)內(nèi)或者基因間區(qū)域中。檢測一個或多個SNP可以區(qū)分單個基因的不同等位基因。本文使用的術(shù)語“簡單串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性”是指在相同基因的不同等位基因中以核苷酸序列的不同數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)(例如I個或多個核苷酸的串聯(lián)重復(fù))而顯示的多核苷酸序列變化，所述相同基因可以是位于來自相同個體(例如胎兒)的相同染色體2個拷貝上的相同基因，或者可以是來自2個不同個體(例如胎兒和孕婦)的相同基因。該變化往往發(fā)生在基因的非編碼區(qū)(例如啟動子區(qū)或其附近，或者內(nèi)含子)內(nèi)或者基因間區(qū)域中。檢測一個或多個串聯(lián)重復(fù)數(shù)量可以區(qū)分單個基因的不同等位基因。本文使用的術(shù)語“插入-缺失多態(tài)性”是指，在相同基因的不同等位基因中，以存在或不存在短核苷酸序列(例如1-3個核苷酸)而顯示的多核苷酸序列變化，所述相同基因可以是位于來自相同個體(例如胎兒)的相同染色體2個拷貝上的相同基因，或者可以是來自不同個體(例如胎兒和孕婦)的相同基因。該變化可以發(fā)生在基因的非編碼區(qū)(例如啟動子區(qū)或其附近，或者內(nèi)含子)內(nèi)或者基因間區(qū)域中。檢測是否存在短核苷酸序列可以區(qū)分單個基因的不同等位基因。本文使用的術(shù)語“血液”是指來自孕婦或者檢測妊娠可能性的婦女的血液樣品或制品。該術(shù)語包括全血或者血液的任何組分，例如常規(guī)定義的血清和血漿。本文使用的術(shù)語“亞硫酸氫鹽”包括所有類型的亞硫酸氫鹽，例如亞硫酸氫鈉，其能夠?qū)奏?C)化學(xué)轉(zhuǎn)化成尿嘧啶(U)，而不化學(xué)修飾甲基化胞嘧啶，因此可以基于DNA的甲基化狀態(tài)差別修飾DNA序列。本文使用的“差別修飾”甲基化或者非甲基化DNA的試劑包括，在一定過程中與甲基化和非甲基化差別反應(yīng)的任何試劑，通過所述過程從甲基化和非甲基化的DNA產(chǎn)生可區(qū)分產(chǎn)物或者可定量區(qū)分的結(jié)果(例如結(jié)合或沉淀的程度)，由此允許鑒定DNA甲基化狀態(tài)。此類過程可以包括、但不限于，化學(xué)反應(yīng)(例如通過亞硫酸氫鹽進(jìn)行的非甲基化C —U轉(zhuǎn)變)、酶處理(例如通過甲基化依賴的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行的切割)、結(jié)合、和沉淀。因此，優(yōu)先切割甲基化DNA的酶是當(dāng)DNA是甲基化的時候以高得多的效率切割DNA分子的酶，而當(dāng)DNA不是甲基化的時候，優(yōu)先切割非甲基化DNA的酶顯示具有顯著更高的效率。在本發(fā)明的上下文中，“差別修飾”甲基化和非甲基化DNA的試劑還指，取決于DNA序列的甲基化狀態(tài)，在其結(jié)合DNA序列或沉淀DNA序列方面表現(xiàn)具有差別能力的任何試劑。此類試劑中的一類為甲基化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。 術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”是指脫氧核糖核酸(DNA)或者核酸核酸(RNA)以及其單鏈或者雙鏈形式的聚合物。除非具體限定，該術(shù)語包括了含有天然核苷酸已知類似物的核酸，所述類似物具有與參照核酸類似的結(jié)合性質(zhì)，并且以類似于天然存在的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外指出，特定核酸序列還提示性地包括其保守修飾的變體(例如簡并密碼子取代)、等位基因、同源基因、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、和互補(bǔ)序列以及明確指出的序列。具體而言，可以通過產(chǎn)生序列實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代，所述序列中一個或多個所選(或者全部)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer等人，Nucleic AcidRes. 19 5081 (1991) ；0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 =2605-2608 (1985);和 Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes 8 :91_98 (1994))。術(shù)語核酸可以與基因、cDNA、和基因編碼的mRNA互換使用。術(shù)語“基因”表示參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA片段；它包括編碼區(qū)前后參與基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄/翻譯/和轉(zhuǎn)錄/翻譯的調(diào)節(jié)的區(qū)域(前導(dǎo)區(qū)和尾區(qū))以及各個編碼片段(外顯子)之間的間隔序列(內(nèi)含子)。術(shù)語“基因座”表示，在參照基因組匯編(例如UCSC基因組瀏覽器的人類基因組2006年3月匯編(hgl8))的染色體(即基因組位置或染色體位置)上由起始核苷酸位置至結(jié)尾核苷酸位置而限定的DNA區(qū)段?；蜃赡芨采w或可能不覆蓋基因、CpG島、或轉(zhuǎn)錄/翻譯的任何產(chǎn)物的基因組位置。在本申請中，基因座通常是指由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(例如MeDIP-芯片數(shù)據(jù)集)和后續(xù)數(shù)據(jù)分析(例如MAT、TAS)鑒定含有不同DNA甲基化水平的DNA連續(xù)區(qū)段?；蜃梢院幸粋€或多個CpG位點(diǎn)?？梢詫⒒蜃俜殖捎欣诜治?例如Epityper測定、亞硫酸鹽測序、多核苷酸擴(kuò)增和測定)的更短的區(qū)段(例如含CpG的基因組序列、片段或區(qū)域)。可以將基因座開發(fā)為一種或多種胎兒表觀遺傳標(biāo)志物。在本申請的上下文中，基因座還指由某些生物信息學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒定的DNA連續(xù)區(qū)段。在本申請中，術(shù)語“多肽”、“肽”、和“蛋白質(zhì)”可以互換使用，用來指氨基酸殘基的聚合物。所述術(shù)語應(yīng)用于氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物，所述術(shù)語還應(yīng)用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文使用的所述術(shù)語包括任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白質(zhì)(即抗原)，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸類似物和氨基酸模擬物，其以類似于天然存在的氨基酸的方式起作用。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及之后被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、和O-磷酸絲氨酸。本文的氨基酸可以用公知的3字母符號或者I字母符號表示，其由IUPAC-IUB生化命名委員會推薦。同樣地，核苷酸可以用它們通常接受的單字母代碼表示。當(dāng)在 本申請中使用時，“增加”或“減少”是指數(shù)量相對于建立的標(biāo)準(zhǔn)對照的可檢測的陽性或陰性變化。增加是標(biāo)準(zhǔn)對照值的至少10%或20%或者至少50%、80%、或100%的陽性變化；在一些情況下，增加可以是對照值的至少約I. 5倍、至少約2倍、至少約3倍。類似地，減少是對照值的至少1/10、1/6、1/5或者至少1/3或甚至1/2的陰性變化。在本申請中按照如上所述的相同方式使用表述相對于比較基準(zhǔn)的數(shù)量變化或差異的其它術(shù)語，例如“更多”、“更少”、“更高”、和“更低”。本文使用的“多核苷酸雜交方法”是指基于多核苷酸形成Watson-Crick堿基配對的能力在合適的雜交條件下利用已知序列的多核苷酸探針來檢測多核苷酸存在和/或數(shù)量的方法。這種雜交方法的實(shí)例包括Southern印跡和Northern印跡。本文使用的“引物”是指可用于擴(kuò)增方法(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR))中的基于對應(yīng)于目標(biāo)基因的多核苷酸序列來擴(kuò)增核苷酸序列的寡核苷酸，所述目標(biāo)基因例如處于各種甲基化狀態(tài)的HLCS基因。用于擴(kuò)增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一個對于所述序列為序列特異性的。本文使用的“數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”是指常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法的改進(jìn)形式，其可以用于直接定量核酸(包括DNA、cDNA或RNA)和以克隆方式擴(kuò)增所述核酸，使得可以直接定量地測量靶核酸的量。數(shù)字PCR通過在一些分開的反應(yīng)室內(nèi)捕獲或分離存在于樣品中的每個單獨(dú)的核酸分子而實(shí)現(xiàn)此直接定量測量，所述反應(yīng)室能夠定位和濃縮擴(kuò)增產(chǎn)物至可檢測水平。在PCR擴(kuò)增后，含有PCR終產(chǎn)物的室的數(shù)量即絕對核酸數(shù)量的直接測量值?？梢栽诿?xì)管、微乳液、小型化室的陣列中、或在核酸結(jié)合表面上，通常以稀釋的方法，進(jìn)行單獨(dú)的核酸分子的捕獲或分離。數(shù)字PCR的基礎(chǔ)方法學(xué)描述于例如Sykes等人，Biotechniques 13(3) :444_449，1992 ;以及 Vogelstein 和 Kinzler, Proc Natl Acad SciUSA 1999 ；96 :9236_41 中。本文使用的術(shù)語“分子計數(shù)”是指，允許分子或分子復(fù)合物的數(shù)量的定量測量的任何方法，所述數(shù)量往往是在具有獨(dú)特特征的其它共存分子或復(fù)合物情況中的相對數(shù)量。分子計數(shù)的多種方法描述于例如Leaner等人，Analytical Chemistry 69:2115-2121,1997 ；Hirano 和 Fukami, Nucleic Acids Symposium Series No. 44 :157-158, 2000 ;Chiu 等人，Trends in Genetics 25 :324_331，2009 ;以及美國專利第 7，537，897 號中。本文使用的“標(biāo)準(zhǔn)對照”是指下述反映比率的值，所述比率為位于與特定染色體非整倍性(例如13、18、或21三體)相關(guān)的染色體上的胎兒基因組序列的量或濃度除以位于參照染色體上的胎兒遺傳標(biāo)志物的量或濃度的比率，參照染色體上胎兒遺傳標(biāo)志物的量或濃度為見于來自懷有染色體正常胎兒的普通健康孕婦的生物樣品(例如血液、血漿、或血清)中的量或濃度?！皹?biāo)準(zhǔn)對照”可以以不同方式測定，并且取決于其使用情況而表示不同的值。例如，當(dāng)用于表觀遺傳-遺傳劑量方法(其中針對遺傳標(biāo)志物測量表觀遺傳標(biāo)志物)中時，所述“標(biāo)準(zhǔn)對照”為反映下述比率的值，所述比率為位于與特定染色體非整倍性(例如13、18、或21三體)相關(guān)的染色體上的胎兒基因組序列的量或濃度除以位于參照染色體上的胎兒遺傳標(biāo)志物的量或濃度的比率，參照染色體上胎兒遺傳標(biāo)志物的量或濃度為見于來自懷有染色體正常胎兒的普通健康孕婦的生物樣品(例如血液、血漿、或血清)中的量或濃度。在一些情況下，基于處于某妊娠期的普通健康孕婦測定標(biāo)準(zhǔn)對照，而在其它情況下，不就妊娠期加以區(qū)別。在 描述孕婦的上下文中使用的術(shù)語“平均”是指代表健康婦女的隨機(jī)選擇組的某些相關(guān)特征，例如見于婦女血液中的母體和胎兒來源的特定基因或基因組序列的甲基化模式，所述健康婦女懷有染色體正常胎兒且在樣品收集時未患有任何妊娠相關(guān)疾病或病癥。此所選組應(yīng)該包括足夠數(shù)量的婦女，使得這些婦女中的目標(biāo)基因的平均數(shù)量或甲基化模式以合理的準(zhǔn)確性反映具有健康胎兒的健康孕婦的一般群體中的相應(yīng)模式。此外，所選婦女組通常和進(jìn)行血液檢測以指示潛在的妊娠相關(guān)疾病的婦女具有類似的妊娠期。用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選妊娠期可以取決于要進(jìn)行篩選的疾病而變化。例如，優(yōu)選盡可能早地篩選和診斷胎兒染色體非整倍性。并且，用于檢測的優(yōu)選妊娠期還可以取決于進(jìn)行檢測的目標(biāo)基因。用于本申請中的術(shù)語“量”是指，存在于樣品中的目標(biāo)多核苷酸序列的數(shù)量，所述目標(biāo)多核苷酸序列例如遺傳標(biāo)志物或胎兒來源的表觀遺傳/甲基化標(biāo)志物。可以以絕對值表示這樣的數(shù)量，所述絕對值即樣品中多核苷酸序列的總量(例如分子的質(zhì)量或數(shù)量)；或者以相對值(例如比率，或相對于其它標(biāo)志物)表示；或者表示為樣品中多核苷酸序列的濃度(例如質(zhì)量/單位體積，或者分子數(shù)量/單位體積)。發(fā)明的詳細(xì)描述I.引言在許多國家中，篩查三體例如21三體(T21)構(gòu)成了現(xiàn)代產(chǎn)科護(hù)理的重要組成部分?？沙Ｒ?guī)用于產(chǎn)前門診的常用篩查方法針對與染色體非整倍性相關(guān)的附帶現(xiàn)象(epiphenomenon),而非直接針對胎兒中的實(shí)際染色體劑量(Wapner等人，N Engl J Med2003 ；349 1405-13 ；Malone 等人，N Engl J Med 2005 ；353 2001-11)。對于限定檢測，在常規(guī)篩查程序中需要侵入性過程，例如絨毛膜取樣和羊膜腔穿刺術(shù)。然而，這些方法可能造成過程相關(guān)的妊娠丟失(Tabor等人，Lancet 1986 ；1 :1287-93)。1997年母體血漿中的無細(xì)胞胎兒DNA的發(fā)現(xiàn)為非侵入性產(chǎn)前診斷提供了新的可能(Lo 等人，Lancet 1997 ；350 485-7 ;Lo 和 Chiu，Nat Rev Genet 2007 ；8 :71_7)。對母體血漿樣品中源自胎兒的父系遺傳的遺傳物質(zhì)的檢測，允許產(chǎn)前檢測胎兒Rhesus D血型(Lo等人，N Engl J Medl998 ；339 1734-8 ;Finning 等人，Bmj 2008 ；336 :816_8)以及性別連鎖疾病的胎兒性別測定(Costa等人，N Engl J Med 2002 ;346 :1502)。然而，對胎兒染色體非整倍性的非侵入性產(chǎn)前診斷檢測的開發(fā)還具有更大的挑戰(zhàn)。對于來自母體血漿核酸分析的T21的直接檢測，已經(jīng)開發(fā)了 2組主要方法。第一組涉及存在于胎兒特異性核酸標(biāo)志物中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的等位基因比率分析(Lo和Chiu7Nat Rev Genet 2007;8:71-7)。后者的實(shí)例包括循環(huán)胎盤mRNA (所謂的RNA-SNP方法)(Lo等人，Nat Med 2007 ；13 :218_23)和DNA甲基化標(biāo)志物(所謂的表觀遺傳等位基因比率方法)(Tong等人，Clin Chem 2006 ;52 :2194_202)。此方法的主要不利之處在于，這些方法僅適用于對所分析的SNP為雜合的胎兒。并且，在特定基因座內(nèi)存在的具有足夠高雜合率的SNP數(shù)量有限，所以對于此方法來說，群體覆蓋是主要挑戰(zhàn)。第二組方法涉及使用單分子計數(shù)方法，例如數(shù)字 PCR (Lo 等人，Proc Natl Acad Sci USA2007 ；104 13116-21)和大規(guī)模平行基因組測序(Chiu等人，Proc Natl Acad Sci USA2008 ；105 20458-63 ;Fan等人，Proc Natl Acad Sci USA2008 ; 105 :16266-71)。在這些方法中，對單獨(dú)的血漿DNA分子進(jìn)行計數(shù)。此類方法的精確性使得存在于懷有T21胎兒的孕婦的血漿中的源自染色體21的DNA分子的微小增加得以檢測。這些方法的一個不利之處在于，如果在不具有胎兒特異性的標(biāo)志物(例如來自染色體21的隨機(jī)序列)上使用，則需要對極大量的分子進(jìn)行計數(shù)，例如在使用大規(guī)模平行基因組測序的近期實(shí)驗(yàn)中所示例的，其中每個病例需要分析數(shù)百萬個分子(Chiu 等人，Proc Natl Acad Sci USA2008 ； 105 :20458_63 ;Fan 等人，Proc Natl AcadSci USA2008 ; 105 :16266-71)。此后一要求與使用昂貴設(shè)備和試劑以及相對復(fù)雜的生物信息學(xué)相關(guān)。
本申請描述了用于從母體血漿中非侵入性產(chǎn)前檢測染色體非整倍性(例如21三體)的新方法，所述方法基于潛在涉及于非整倍性(例如染色體21)的染色體上的胎兒特異性DNA甲基化標(biāo)志物和參照染色體上的胎兒特異性DNA標(biāo)志物的濃度比率。此方法稱為表觀遺傳-遺傳(EGG)染色體劑量方法。與上文描述的表觀遺傳等位基因比率相比，該EGG方法不要求胎兒特異性DNA甲基化標(biāo)志物和SNP存在于DNA的短區(qū)段內(nèi)，因此更為容易地實(shí)現(xiàn)群體覆蓋。該EGG方法比基于表觀遺傳標(biāo)志物的方法更精確，其中后者通常以染色體21上的一個表觀遺傳標(biāo)志物和參照染色體上的一個表觀遺傳標(biāo)志物進(jìn)行。為了使該EGG方法可用于三體檢測，關(guān)鍵是在相關(guān)染色體例如染色體21、18、或13上具有良好的胎兒特異性DNA甲基化標(biāo)志物。一種優(yōu)選類型的標(biāo)志物是這樣的標(biāo)志物，其在胎兒中為高甲基化的，而在母體血細(xì)胞中為低甲基化，以使得可以使用甲基化敏感的限制性酶消化掉母體序列。事實(shí)上，之前的工作已證實(shí)，RASSF1A基因的啟動子即是一種這樣的標(biāo)志物，不同的是它在染色體3上(Chan等人，Clin Chem 2006 ；52 :2211_8 ；Chiu等人，Am J Pathol 2007;170:941-50)。已經(jīng)報道了染色體21上的很多胎兒DNA甲基化標(biāo)志物(Chim 等人，Clin Chem 2008 ；54 500-11 ;01d 等人，IteprodBiomed Online 2007 ；15 227-35 ;Papageorgiou 等人,Am J Pathol 2009 ；174 :1609_18)。本發(fā)明人使用祀向染色體21上35個基因啟動子區(qū)域的聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制性分析(COBRA) (Xiong和Laird，NucleicAcids Res 1997 ；25 :2532_4)進(jìn)行了其它標(biāo)志物的搜索。從而發(fā)現(xiàn)了全羧化酶合成酶(生物素_(丙?；?輔酶A-羧酶(ATP-水解化))連接酶)(HLCS)基因的差別甲基化推定啟動子區(qū)域?yàn)樾碌母呒谆篋NA標(biāo)志物。然后使用HLCS實(shí)施了該EGG原理。染色體18和13上的胎兒特異性甲基化標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步允許使用類似的策略來檢測18和13三體。II. 一般方法學(xué)實(shí)施本發(fā)明利用分子生物學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。公開了用于本發(fā)明的一般方法的基礎(chǔ)教科書包括 Sambrook 和 Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rded. 2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual(1990);和Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人，eds. , 1994)。對于核酸，以千堿基(kb)或堿基對(bp)為單位提供大小。這些是源自瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳、源自經(jīng)測序核酸、或源自公布的DNA序列的估值。對于蛋白質(zhì)，以千道爾頓(kDa)或氨基酸殘基數(shù)為單位提供大小。從凝膠電泳、從經(jīng)測序蛋白質(zhì)、從得到的氨基酸序列、或從公布的蛋白質(zhì)序列估計蛋白質(zhì)大小。非商業(yè)可獲得的寡核苷酸可以以化學(xué)方式合成，例如根據(jù)由Beaucage和Caruthers, Tetrahedron Lett. 22 :1859-1862 (1981)首次描述的固相亞憐酸胺三酯法進(jìn)行，其中使用描述于 Van Devanter 等人,Nucleic Acids Res. 12 :6159_6168 (1984)中的自動合成儀。使用任何本領(lǐng)域認(rèn)可的策略進(jìn)行寡核苷酸的純化，所述策略例如非變性丙烯酰胺凝膠電泳或描述于Pearson和Reanier, J. Chrom. 255 :137-149 (1983)的陰離子交換高效液相色譜(HPLC)。
可以使用例如Wallace等人，Gene 16:21-26(1981)的用于對雙鏈模板進(jìn)行測序的鏈終止法來驗(yàn)證用于本發(fā)明的遺傳標(biāo)志物的序列或基因組序列，例如HLCS或ZFY基因的多核苷酸序列和合成的寡核苷酸(例如引物)。III.血液樣品的獲得和DNA的提取本發(fā)明涉及分析見于母體血液中的適合的胎兒染色體DNA的表觀遺傳-遺傳染色體劑量，作為非侵入性手段，以檢測妊娠相關(guān)病癥或疾病的存在和/或監(jiān)測其進(jìn)展。因此，實(shí)施本發(fā)明的第一步為獲得來自孕婦的血液樣品并從所述樣品提取DNA。A.血·液樣品的獲得從處于適于使用本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測的妊娠期的孕婦獲得血液樣品。適合的妊娠期可以取決于所檢測的疾病而變，如下文所討論的。根據(jù)醫(yī)院或診所一般采取的標(biāo)準(zhǔn)操作程序從婦女收集血液。收集外周血的適合的量(例如通常為5-50mL)，并可以在進(jìn)一步制備前根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作儲存。B.血·液樣品的制備可以使用例如全血、血清、或血漿根據(jù)本發(fā)明分析見于母體血液中的胎兒DNA。用于制備來自母體血液的血清或血漿的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，可以將孕婦的血液置于含有EDTA或?qū)ｉT的商品例如Vacutainer SST(Becton Dickinson, FranklinLakes, NJ)的管中，以防止血液凝結(jié)，并且可以通過離心從全血獲得血漿。作為EDTA的替代物，可以將肝素或檸檬酸鹽用作抗凝劑。另一方面，可以在血液凝結(jié)后經(jīng)離心或不經(jīng)離心獲得血清。如果使用離心，則通常(但非絕對)在合適的速度、例如1，500-3，OOOx g進(jìn)行。在轉(zhuǎn)移至用于DNA提取的新試管之前，可以使血漿或血清進(jìn)行另外的離心步驟。替代這些離心步驟或額外地，還可以使用一個或多個離心步驟，以從血漿或血清中去除顆粒狀物質(zhì)。除全血的非細(xì)胞部分以外，還可從富含于血沉棕黃層部分的細(xì)胞部分回收DNA，所述細(xì)胞部分可以在離心來自婦女的全血樣品并去除血漿后獲得。還可以針對循環(huán)于母體血液中的胎兒有核細(xì)胞富集細(xì)胞部分。此類富集程序可以包括涉及一種或多種針對胎兒細(xì)胞的抗體的分選或選擇程序，或者包括靶向可以區(qū)分胎兒與母體細(xì)胞的物理、生化、生物物理或其它特征的程序。所述分選程序可以涉及例如熒光活化細(xì)胞分選器、磁性活化細(xì)胞分選或微流體的技術(shù)。所述選擇程序可以涉及顯微操作或激光捕獲顯微切割、用光學(xué)鑷子操作或任何其它單細(xì)胞操作程序。可以靶向的胎兒細(xì)胞類型包括有核紅血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、滋養(yǎng)層、或細(xì)胞殘余物，例如凋亡的胎兒細(xì)胞。C. DNA 的提取已知多種用于從包括血液的生物樣品提取DNA的方法。可以采用DNA制備的一般方法(例如 Sambrook 和 Russell, Molecular Cloning A Laboratory Manual 3d ed.,2001所述)；還可以使用各種可商業(yè)購買的試劑或試劑盒以從來自孕婦的血液樣品獲得DNA,所述試劑或試劑盒例如 QIAamp DNA Mini Kit 或QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen,Hilden, Germany) > GenomicPrep Blood DNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI)、和GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (Amersham, Piscataway, NJ) 還可以使用這些方法中多于一種的組合。IV. DNA的甲基化特異性修飾 為了正確地鑒定存在于樣品中的胎兒和母體DNA之間差別甲基化的表觀遺傳標(biāo)志物或基因組序列(例如HLCS基因)的來源，必需分析從上一步驟分離的DNA的甲基化狀態(tài)，從而區(qū)分胎兒和母體DNA。在從孕婦的血液樣品提取后，用能夠以差別甲基化方式而化學(xué)修飾DNA的試劑處理DNA，所述差別甲基化方式即在處理后，由于甲基化胞嘧啶(C)殘基和非甲基化C殘基將產(chǎn)生不同且可區(qū)分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通常，此類試劑與DNA分子中的非甲基化C殘基反應(yīng)，并將每個非甲基化C殘基轉(zhuǎn)化成尿嘧啶(U)殘基，而甲基化C殘基保持不變。這種C — U轉(zhuǎn)變允許基于核酸一級結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行甲基化狀態(tài)的檢測和比較。適于此目的的示例性試劑為亞硫酸氫鹽，例如亞硫酸氫鈉。用于使用亞硫酸氫鹽進(jìn)行DNA的化學(xué)修飾的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見例如Herman等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 9821-9826,1996)，本文將不再詳細(xì)論述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認(rèn)識到，本文未指出但具有差別修飾甲基化和非甲基化DNA的相同性質(zhì)的任何其它試劑都可用于實(shí)施本發(fā)明。例如，還可通過甲基化敏感的限制性酶實(shí)現(xiàn)DNA的甲基化特異性修飾，所述酶中的一些通常切割非甲基化DNA片段，而不切割甲基化DNA片段，而其它酶(例如甲基化依賴的核酸內(nèi)切酶McrBC)切割含有甲基化胞嘧啶的DNA，而不切割非甲基化DNA。此外，化學(xué)修飾和限制性酶處理的組合，例如聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制性分析(COBRA)也可以用于實(shí)施本發(fā)明。V.多核苷酸序列擴(kuò)增和測定 在以差別甲基化方式修飾DNA之后，將經(jīng)處理的DNA進(jìn)行基于序列的分析，使得用作表觀遺傳標(biāo)志物的源于與非整倍性相關(guān)的染色體的胎兒DNA的基因組序列(例如HLCS基因)可以與來自母體DNA的相同基因相區(qū)分，并且可以定量地測定樣品中所述胎兒基因的量或濃度且與來自胎兒來源的參照染色體的遺傳標(biāo)志物的量或濃度進(jìn)行比較，然后將二者的比率與標(biāo)準(zhǔn)對照進(jìn)行比較。A.核苷酸序列的擴(kuò)增在甲基化特異性修飾后，在表觀遺傳標(biāo)志物的序列分析之前，任選地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，進(jìn)行擴(kuò)增以優(yōu)先地擴(kuò)增具有特定甲基化模式的標(biāo)志物的一部分，使得僅來自一個特定來源(例如來自胎盤或胎兒其它組織)標(biāo)志物得到檢測，且分析其數(shù)量或濃度。如期望，使用選擇性地擴(kuò)增標(biāo)志物序列的胎兒形式的已知擴(kuò)增方法進(jìn)行參照染色體上的遺傳標(biāo)志物的擴(kuò)增，所述參照染色體上的遺傳標(biāo)志物允許基于多核苷酸序列的差別進(jìn)行胎兒或母體來源的測定。通常，通過認(rèn)真的引物設(shè)計實(shí)現(xiàn)優(yōu)先擴(kuò)增。已建立了各種多核苷酸擴(kuò)增方法，并且頻繁用于研究中。例如，用于多核苷酸序列擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一般方法是本領(lǐng)域熟知的，因此本文不進(jìn)行詳細(xì)描述。對于PCR方法、操作程序、和原理的綜述,參見例如Innis等人，PCR Protocols A Guideto Methods and Applications (PCR 技術(shù)手冊方法與應(yīng)用指南)，Academic Press, Inc.N. Y., 1990。還可從供應(yīng)商,例如Roche Molecular Systems,獲得PCR試劑和操作程序。最通常用熱穩(wěn)定酶作為自動化過程實(shí)施PCR。在此過程中，經(jīng)過變性區(qū)、引物退火區(qū)、和延伸反應(yīng)區(qū)自動地循環(huán)反應(yīng)混合物的溫度。特異性地適于此目的的機(jī)器是可商業(yè)購買的。改進(jìn)的且更敏感的PCR方法例如實(shí)時PCR和數(shù)字PCR也可用于本發(fā)明的某些實(shí)施方式中。盡管靶多核苷酸序列(例如表觀遺傳標(biāo)志物的一部分，其中胎兒和母體序列是差別甲基化的)的PCR擴(kuò)增通常用于實(shí)施本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，可以通過任何已知方法實(shí)現(xiàn)見于母體血液樣品中的HLCS基因序列的擴(kuò)增，所述方法例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增、和自身持續(xù)序列復(fù)制或基于核酸的擴(kuò)增(NASBA)，所述方法中的每一種都提供了足夠的擴(kuò)增。還可將分支DNA技術(shù)用于定量地證明特定標(biāo)志物序列(代表特定甲基化模式或特定多核苷酸序列)的存在，或定量地測定母體血液中特定標(biāo)志物序列的量或濃度。對于用于直接定量臨床樣品中的核酸序列的分支DNA信號擴(kuò)增的綜述，參見 Nolte, Adv. Clin. Chem. 33 :201_235，1998。B.多核苷酸序列的測定同樣已建立了用于多核苷酸序列測定的技術(shù)，并且廣泛實(shí)施于相關(guān)研究領(lǐng)域中。例如，用于多核苷酸測序的基礎(chǔ)原理和一般技術(shù)描述于關(guān)于分子生物學(xué)和重組遺傳學(xué)的各種研究報告和論文集中，例如Wallace等人，同上；Sambrook和Russell,同上；和Ausubel等人，同上。常規(guī)實(shí)施于研究實(shí)驗(yàn)室中的人工或自動DNA測序方法可用于實(shí)施本發(fā)明。用于實(shí)施本發(fā)明的方法的適于檢測多核苷酸序列中的改變(例如C —U)的其它手段包括但不限于質(zhì)譜、引物延伸、多核苷酸雜交、實(shí)時PCR、熔解曲線分析、高分辨率熔解分析、異源雙鏈體分析、焦磷酸測序、和電泳。VI.建立標(biāo)準(zhǔn)對照為了建立用于實(shí)施本發(fā)明的方法的標(biāo)準(zhǔn)對照，首先選擇懷有健康胎兒的一組健康孕婦。這些婦女是在使用本發(fā)明的方法篩查妊娠相關(guān)病癥的適合的妊娠時間段內(nèi)，所述妊娠相關(guān)病癥例如胎兒染色體非整倍性及其它。任選地，所述婦女具有類似的妊娠期，例如在妊娠的相同三期內(nèi)，如在首三月或中三月。通過已建立的常規(guī)采用的方法證實(shí)所選孕婦和她們所懷有的胎兒的健康狀態(tài)，所述方法包括但不限于，婦女的一般體檢，婦女的遺傳分析、和使用CVS和羊膜腔穿刺術(shù)的胎兒遺傳分析。此外，懷有健康胎兒的健康孕婦的所選數(shù)量也必須具有合理的規(guī)模，以使得從該組獲得的母體血液中的胎兒遺傳和表觀遺傳標(biāo)志物的平均量/濃度、量/濃度比率、和母體血液中一種或多種表觀遺傳標(biāo)志物的甲基化模式可以被合理地認(rèn)為代表懷有健康胎兒的健康婦女一般群體中的正常或平均水平或者甲基化模式。優(yōu)選地，所選的組至少包括10位婦女。
胎兒表觀遺傳標(biāo)志物甲基化模式可以反映此基因的甲基化狀態(tài)的多個不同且可分開的方面。例如，甲基化模式的一個方面是，C殘基是否是甲基化的；其它方面是標(biāo)志物特定區(qū)域內(nèi)的甲基化C堿基的數(shù)量；該模式的進(jìn)一步方面是多個分析DNA分子中任何給定位置處的甲基化C的百分比。甲基化模式的其它方面可以包括、但不限于，甲基化的等位基因差別，差別甲基化等位基因的比率等等。胎兒表觀遺傳標(biāo)志物甲基化模式還可以根據(jù)組織類型例如胎盤或其它胎兒組織而變化。因此，可以對用于檢測的不同胎兒組織建立單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)對照。
當(dāng)基于見于所選健康對照組的每位婦女的各自的值對存在于母體樣品中的胎兒標(biāo)志物特定組建立了胎兒表觀遺傳-遺傳標(biāo)志物比率的平均值時，該平均或中位或代表值或者模式被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)對照。取自這些健康對照婦女的樣品應(yīng)該理想地在侵入性程序之前獲取。在同一過程中還測定標(biāo)準(zhǔn)偏差。在一些情況下，可以對表觀遺傳標(biāo)志物的甲基化模式的不同方面建立單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)對照，例如基于表觀遺傳標(biāo)志物序列的不同區(qū)域。
實(shí)施例以下僅以說明方式而非以限定方式提供下述實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地認(rèn)識到，可以改變或修改多個非關(guān)鍵參數(shù)，以產(chǎn)生基本上相同或類似的結(jié)果。實(shí)施例1I.材料和方法研究參與者招募了就診于香港威爾士親王醫(yī)院婦產(chǎn)科(Department of Obstetrics andGynaecology, Prince of Wales Hospital, Hong Kong)的具有整倍體和 21 三體妊娠的婦女。從參加該研究的個體獲得了知情同意書，并且從香港中文大學(xué)-新界東聯(lián)網(wǎng)聯(lián)合臨床石開究倫理委員會(Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories EastCluster Clinical Research Ethical Committee)獲得了倫理批準(zhǔn)。通過COBRA進(jìn)行的染色體21上的差別甲基化區(qū)域的篩選將COBRA (Xiong 和 Laird，Nucleics Acid Res 1997 ;25 :2532_4)用于評估來自胎盤和母體血細(xì)胞的DNA樣品中染色體21上的基因組序列的甲基化狀態(tài)。通過COBRA鑒定的差別甲基化基因座的克隆和亞硫酸鹽測序分析將來自COBRA分析的PCR產(chǎn)物用于克隆和亞硫酸鹽測序。為了以單個分子的分辨率分析甲基化狀態(tài)，使用 pGEM-T Easy Vector System (Promega, Madison, WI)將 PCR 產(chǎn)物TA克隆到質(zhì)粒載體中。使用載體引物T7和SP6PCR克隆來自陽性重組克隆的插入片段，然后使用 BigDye Terminator Cycle Sequencing v I. I 試劑盒(Applied Biosystems,Foster City，CA)、根據(jù)制造商的說明書通過循環(huán)測序進(jìn)行分析。在乙醇沉淀后，將樣品重懸于IOyL的Hi-Di甲酰胺中，然后在3100DNA分析儀(Applied Biosystems)上運(yùn)行。使用SeqScape軟件(Applied Biosystems)分析測序數(shù)據(jù)。在標(biāo)度之前確認(rèn)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化完全。通過將甲基化CpG位點(diǎn)的總數(shù)除以全部克隆的CpG位點(diǎn)計算甲基化位點(diǎn)頻率(Chiu等人，Am J Pathol 2007 ；170 :941_50)。HLCS基因座的常規(guī)實(shí)時定量PCR分析基于COBRA篩選和亞硫酸鹽測序結(jié)果，我們開發(fā)了甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶(MSRE)消化陣列，隨后進(jìn)行靶向HLCS基因座區(qū)域B2的實(shí)時定量PCR分析，所述基因座區(qū)域B2在胎盤中為高甲基化的，而在母體血細(xì)胞中為非甲基化的。使用酶消化允許分析HLCS基因座在不同基因組DNA樣品中的甲基化模式。此外，可以消除母體血漿樣品中的背景母體DNA分子。用于實(shí)時PCR測定的引物和探針的序列列于表I。通過微流體數(shù)字PCR平臺進(jìn)行的基因劑量分析通過在微流體數(shù)字PCR平臺上的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析染色體21和參照標(biāo)志物的基因劑量比較(Ottesen 等人,Science 2006 ；314 1464-7 ;Warren 等人,Proc Natl AcadSci USA 2006 ；103 :17807-12)。用于表觀遺傳-表觀遺傳比較的基因座是染色體21上的HLCS 和染色體 3 上的 RASSFlA(Chiu 等人，Am J Pathol 2007 ；170 941-50)。二者都是高甲基化胎兒DNA標(biāo)志物。用于表觀遺傳-遺傳比較的基因座是來自懷有男性胎兒的妊娠的染色體21上的HLCS和Y染色體上的ZFY。用于全部測定的引物和探針的序列和PCR熱循環(huán)條件列于表I。統(tǒng) 計分析使用SigmaStat 3. 5軟件(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計分析。血液和組織樣品的收集在妊娠首三月中的常規(guī)產(chǎn)前診斷階段期間收集絨毛膜樣品(CVS)。從分娩后的整倍體末三月妊娠以及從妊娠終止后的整倍體和21三體妊娠收集胎盤組織樣品。通過完全染色體核型分型確認(rèn)胎兒染色體狀態(tài)。從全部個體收集母體外周血樣品(12-20mL EDTA)。將額外的12mL血液收集到來自分娩后的末三月妊娠的EDTA管中。首、中和末三月的樣品的妊娠期分別為12-14周、17-21周和38-40周。血液和組織樣品的處理通過如前描述的雙離心操作程序處理母體外周血樣品(Chiu等人，Clin Chem2001 ；47 :1607-13)。以2，500g離心血細(xì)胞部分，然后去除任何殘余的血漿。分別用QIAampDNA Blood Mini Kit 和 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)的血液和體液操作程序提取來自外周血細(xì)胞的DNA和來自母體血漿的DNA。用QIAamp DNA MiniKit (Qiagen)、根據(jù)制造商的組織操作程序提取來自CVS和月臺盤的DNA。通過COBRA進(jìn)行的染色體21上的差別甲基化區(qū)域的篩選如下描述了COBRA 程序。使用 EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, Orange,CA)、根據(jù)制造商的說明書在I微克的每個DNA樣品上進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。然后用HotStarTaq DNA Polymerase Kit (Qiagen, Hilden, Germany)中提供的試劑，使 40 納克的亞硫酸氫鹽-轉(zhuǎn)化的DNA (基于初始的DNA輸入量進(jìn)行計算)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用于每個PCR的試劑組成列于表2。通常，以20 μ L反應(yīng)進(jìn)行PCR，所述反應(yīng)具有Ix PCR Buffer、MgCl2、50 μ M的每種dNTP、正向和反向引物、HotStar Taq聚合酶、以及有或沒有2X PCRx增強(qiáng)劑(Invitrogen，Carlsbad, CA)。加熱情況為95°C下進(jìn)行15分鐘，然后是45-55個循環(huán)，以及最后72°C延伸3分鐘，每個循環(huán)為95°C進(jìn)行20秒、適合的退火溫度進(jìn)行30秒、72°C進(jìn)行I. 5分鐘。然后使PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶消化。針對要用于每個相應(yīng)的基因座的限制性酶區(qū)分亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后甲基化和非甲基化序列的能力對所述酶進(jìn)行選擇?；旧?，限制性位點(diǎn)僅存在于甲基化或非甲基化序列之一而非二者中，以使得序列之一將被消化，而另一個序列將保持完整。在制造商的推薦溫度下，用5μ L PCR產(chǎn)物、Ix適合的緩沖液、和IOU限制性酶(或者對于模擬消化則無)，在20 μ L反應(yīng)中進(jìn)行限制性酶消化2h。全部的酶都購自New EnglandBiolabs (Ipswich, MA)。然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析消化產(chǎn)物。HLCS基因座的常規(guī)實(shí)時定量PCR分析MSRE消化。對于每個胎盤和母體血細(xì)胞DNA樣品，使IOOngDNA進(jìn)行MSRE消化。在制造商的推薦溫度下，在50 μ L反應(yīng)中進(jìn)行限制性酶消化至4少16h，所述反應(yīng)具有Ix適合的緩沖液、25U的HpaII和50U的BstUI (或者對于模擬消化則無)(New England Biolabs)。對于每個母體血漿樣品，將I. 6mL血漿用于DNA提取，然后在50 μ L的去離子水中稀釋，使其中21 μ L進(jìn)行限制性酶消化。在制造商的推薦溫度下，在30 μ L反應(yīng)中進(jìn)行酶消化至少16h，所述反應(yīng)具有Ix適合的緩沖液、20U的HpaII和30U的BstH (或者對于模擬消化則無)。然后通過實(shí)時定量PCR分析消化產(chǎn)物。所選限制性酶僅消化非甲基化DNA，而不消化甲基化DNA。由于來自COBRA分析的數(shù)據(jù)已證實(shí)HLCS在胎盤組織中為高甲基化的而在母體血細(xì)胞為非甲基化的，預(yù)期一定比例的來自胎盤組織的DNA將保持是可檢測的，而多數(shù)來自母體血細(xì)胞的DNA將被消化，從而在限制性酶處理后變得無法檢測。實(shí)時定量PCR分析。針對HLCS基因組DNA的經(jīng)和未經(jīng)限制性酶消化的定量分析開發(fā)了實(shí)時PCR測定。將4微升的經(jīng)限制性酶處理的 DNA或模擬消化樣品用于實(shí)時PCR測定。每個反應(yīng)含有 IxTaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)、300nM 的每種正向和反向引物(Integrated DNA Technologies,Coralville, ΙΑ)、和 IOOnM 的 TaqMan 探針(Applied Biosystems)。引物和探針的序列列于表I。加熱情況為50°C下進(jìn)行2分鐘，95°C下進(jìn)行10分鐘，然后是50個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C進(jìn)行15秒和60°C進(jìn)行I分鐘。全部反應(yīng)一式兩份進(jìn)行，然后取平均數(shù)。通過光密度測量初始定量的系列稀釋的人基因組DNA用作測定的定量標(biāo)準(zhǔn)物，并且測定的檢測限值是每反應(yīng)I拷貝。因?yàn)橄拗菩悦赶蟮目蓹z測HLCS分子代表了甲基化部分，因此將實(shí)時定量PCR表示為甲基化指數(shù)。通過將酶消化后的HLCS的拷貝數(shù)除以經(jīng)模擬消化獲得的拷貝數(shù)計算樣品的甲基化指數(shù)。進(jìn)行母體血漿DNA分析，以示出高甲基化HLCS分子的產(chǎn)后清除。通過微流體數(shù)字PCR平臺進(jìn)行的基因劑量分析MSRE 消化。使用 MSRE，BstUI (New England Biolabs)消化低甲基化 DNA。在 60°C下用BstH酶消化提取的DNA 16h。對于CVS、胎盤組織和母體血細(xì)胞，使用40U的BstUI酶消化用于微流體數(shù)字PCR測定的200ng的DNA。包括經(jīng)模擬消化的等分試樣作為消化對照。對于模擬消化，使等量DNA經(jīng)受相同的消化條件，而不加入酶。對于血漿樣品，使用20U的BstH酶消化來自末三月樣品的3. 4-4. 8mL血漿的DNA。對于首三月和中三月血漿樣品，使用40U或60U的BstH酶消化從4. 4-9. ImL血漿提取的DNA。圖5以下劃線示出了具有BstUI限制性位點(diǎn)的靶序列。微流體數(shù)字PCR分析。設(shè)計了用于HLCS、RASSF1A和ZFY基因座(圖5)的微流體數(shù)字PCR測定，分別代表染色體21、染色體3和Y染色體的劑量。之前已描述了 ZFX/Y陣列和數(shù)字PCR分析的基礎(chǔ)(Lun等人，Clin Chem 2008;54:1664-72)。引物和探針的序列列于表 I。在 BioMark 系統(tǒng)(Fluidigm, South San Francisco, CA)上使用 12. 765DigitalArrays(Fluidigm)進(jìn)行數(shù)字實(shí)驗(yàn)。該數(shù)字陣列由12個面板組成，每個面板進(jìn)一步間隔成765個反應(yīng)孔。用每個面板，將反應(yīng)設(shè)置為10 μ L混合物，其終濃度為根據(jù)制造商的操作程序，用測定上樣緩沖液和樣品上樣緩沖液稀釋的IxTaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems)、125nM TaqMan 探針(Applied Biosystems)、和 900nM 正向和反向引物(Integrated DNA Technologies)。輸入的DNA體積為對于每個10 μ L反應(yīng)混合物的3. 5 μ L0加熱情況為50°C下進(jìn)行2分鐘，95°C下進(jìn)行10分鐘，然后是50個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C進(jìn)行15或30秒，然后57°C或60°C進(jìn)行I分鐘。每個測定的加熱循環(huán)條件說明于表I。HLCS和RASSF1A測定以單重測定進(jìn)行。ZFX/Y測定以雙重反應(yīng)進(jìn)行。經(jīng)Bstn消化的基因組DNA樣品的測定特異性。使來自CVS、胎盤、和母體血細(xì)胞的DNA樣品在Bstn消化后進(jìn)行HLCS、RASSF1A、和ZFX/Y數(shù)字PCR分析。在酶消化后，將DNA稀釋為Ung/yL的濃度，以加入用于數(shù)字PCR分析的反應(yīng)混合物中。來自CVS和胎盤的DNA樣品構(gòu)成抗酶消化的HLCS和RASSF1A分子，因此在限制性酶消化后應(yīng)該檢測到信號。另一方面，我們預(yù)期在血細(xì)胞中沒有檢測水平或檢測水平低，因?yàn)樗鼈冊谶@兩個基因座處是低甲基化的。ZFX/Y基因座不含有任何BstUI酶消化位點(diǎn)，因此限制性酶處理應(yīng)該不對DNA分子具有任何作用。ZFY分子構(gòu)成來自男性胎兒的源自胎兒的序列，以用于比率比較。經(jīng)Bstn消化的血漿DNA樣品的測定特異性。在BstUI-消化母體血漿DNA樣品后，用去離子水進(jìn)行4倍稀釋。然后將樣品與反應(yīng)混合物混合，以上樣到微流體芯片上進(jìn)行分析。通過表觀遺傳-表觀遺傳方法和表觀遺傳-遺傳方法進(jìn)行的基因劑量比較。對BstUI限制性酶消化后的整倍體和T21胎盤DNA樣品進(jìn)行HLCS、RASSF1A和ZFX/Y基因座的數(shù)字PCR分析。對于母體血漿分析，我們比較了在來自整倍體和T21妊娠的經(jīng)Bstn消化的DNA樣品中HLCS與ZFY的比率。II.結(jié)果通過COBRA進(jìn)行的染色體21的差別甲基化區(qū)域的篩選選擇了染色體21上的35個啟動子區(qū)域用于使用COBRA方法的差別甲基化篩選，其中30個與CpG島(CGI)無關(guān)，而其它5個與CGI相關(guān)。定義CGI的標(biāo)準(zhǔn)如下長度>400bp、GC含量> 50 %,且觀察到的CpG/預(yù)期的CpG的比率> O. 6 (Yamada等人，GenomeRes2004 ；14 :247_66)。從UCSC基因組生物信息數(shù)據(jù)庫的2006年3月人類參照序列(網(wǎng)站www. genome, ucsc. edu/) (NCBI Build 36. I)獲得了鄰近35個啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(-Ikb至+500bp ;轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為O)的DNA序列，并且設(shè)計了 51個COBRA測定以在胎盤組織和母體血細(xì)胞之間比較甲基化模式(表2)。在該51個測定中，比較了從首三月和末三月以及母體血細(xì)胞收集的胎盤組織之間啟動子區(qū)域的甲基化模式。將來自正常妊娠的至少一個胎盤組織和一個母體血細(xì)胞樣品用于COBRA篩選(表2)。在篩選的區(qū)域中，通過COBRA鑒定了 HLCS和C21orf81 (GenBank登記號AF326257)的推定啟動子區(qū)域在胎盤組織和母體血細(xì)胞之間是差別甲基化的。HLCS區(qū)域B2的代表性COBRA結(jié)果示例于圖6A，其中相比母體血細(xì)胞，胎盤為高甲基化的；C21orf81的代表性COBRA結(jié)果示例于圖6B，其中相比胎盤組織，母體血細(xì)胞為輕微甲基化的。HLCS基因座的克隆和亞硫酸鹽測序分析在HLCS區(qū)域上進(jìn)行克隆和亞硫酸鹽測序?qū)嶒?yàn)以進(jìn)一步以單個分子的分辨率分析甲基化狀態(tài)，結(jié)果示于圖I。HLCS區(qū)域的測序結(jié)果確認(rèn)了，HLCS的超甲基化為胎盤特異性的，其甲基化位點(diǎn)頻率為O. 435至O. 699。盡管在母體血細(xì)胞樣品中的靶序列的3’ -末端(即位置-57至+111，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為O)檢測到低甲基化水平(甲基化位點(diǎn)頻率< O. 100)，但是幾乎對于從-232至-67的CpG位點(diǎn)未觀察到甲基化。經(jīng)MSRE消化的胎盤、母體血細(xì)胞和血漿DNA樣品的實(shí)時定量PCR基于HLCS區(qū)域B2的COBRA和亞硫酸鹽測序數(shù)據(jù)，開發(fā)了 MSRE消化測定，然后進(jìn)行實(shí)時定量PCR分析以分析從胎盤和母體血細(xì)胞提取的基因組DNA的差別甲基化。將來自8個母體血細(xì)胞樣品與從整倍體妊娠收集的2個首三月和2個末三月胎盤組織樣品的HLCS推定啟動子區(qū)域的甲基化模式進(jìn)行了比較。進(jìn)行限制性酶消化，然后進(jìn)行實(shí)時定量PCR分析，結(jié)果示于圖7。來自全部母體血細(xì)胞樣品的DNA幾乎都被限制性酶消化，得到的甲基化指數(shù)近似O (中值0. 0178，四分位距(IQR) 0. 0121-0. 0281)。胎盤組織DNA樣品被部分消化，得到的甲基化指數(shù)范圍為O. 567至O. 966。之前的數(shù)據(jù)提示，胎盤是胎兒DNA的主要來源(Bianchi, Placenta2004 ;25SupplA :S93-S101)，而母體血細(xì)胞是母體血漿中可檢測的背景母體DNA的主要供應(yīng)者(Lui等人，Clin Chem 2002;48:421-7)。因此得到這樣的假說HLCS DNA分子的胎盤特異性部分，SP甲基化或不可消化部分，可以在母體血漿中檢測到。收集了 25對分娩前和分娩后的末三月母體血漿樣品，進(jìn)行限制性酶消化，然后進(jìn)行實(shí)時定量PCR分析。結(jié)果示例于圖8。在全部的經(jīng)酶消化的分娩前的血漿樣品中都獲得了陽性HLCS信號。來 自經(jīng)酶處理的分娩前和分娩后的血漿樣品的清除模式提示了，抗消化的HLCS分子是妊娠特異性的(P =< O. 001，Wilcoxon符號秩檢驗(yàn))。分娩后的血漿樣品中的中值HLCS濃度僅為分娩前的樣品的8. 1%(分別為20. I和247. 8個拷貝/mL)(圖8A)。對于經(jīng)受模擬消化的樣品，分娩后的血漿樣品的中值HLCS濃度為分娩前的樣品的83. 8% (分別為1208. 5和1442. 4個拷貝/mL)(圖SB)。經(jīng)模擬消化，在分娩前的血漿樣品中檢測到胎兒和母體DNA 二者，而在分娩后的樣品中僅得到母體DNA。注意到的是，分娩前和分娩后的樣品與模擬消化之間的HLCS濃度差異是統(tǒng)計上顯著的(P = O. 003,Wilcoxon符號秩檢驗(yàn))。來自BstUI消化等分試樣的數(shù)據(jù)顯示，有5個母體血漿樣品具有相對較高水平的胎兒DNA，并且這5個樣品與在甚至未經(jīng)酶消化的分娩后的樣品中顯示HLCS濃度顯著下降的樣品相同。這可以促成明顯的甚至未經(jīng)酶消化的“清除”模式。在分娩后的血漿樣品中觀察到的HLCS濃度的降低可能是由于一些樣品具有異常高水平的胎兒DNA(P = 0.003，胃11(3( 011符號秩檢驗(yàn))。注意到的是，該5個具有顯著高濃度的HLCS的分娩前樣品與酶消化比較中的前5個樣品匹配。微流體數(shù)字PCR平臺上的基因劑量分析在微流體數(shù)字PCR平臺上進(jìn)行了染色體21和參照染色體標(biāo)志物的基因劑量比較。染色體21標(biāo)志物為高甲基化的HLCS，染色體3和Y染色體上的參照標(biāo)志物分別為高甲基化的RASSFIA和男性特異性的ZFY。將2對胎盤組織和母體血細(xì)胞樣品用于檢測HLCS和RASSF1A檢驗(yàn)經(jīng)和不經(jīng)酶消化的性能。還進(jìn)行ZFX/Y測定(GenBank登記號ZFX NM_003410和ZFY NM_003411)。由于這些基因座上沒有酶消化位點(diǎn)，預(yù)期拷貝數(shù)將不受酶消化的影響。使用2個分娩后的母體血漿樣品測試抗消化的HLCS和RASSF1A分子的產(chǎn)后清除。在每個基因組DNA樣品上進(jìn)行每個測定的一個面板。對于分娩后的母體血漿，將經(jīng)酶消化的DNA分布到用于給具有陽性結(jié)果的任何孔標(biāo)度的2個面板中?；蚪MDNA和血漿DNA樣品的結(jié)果分別概述于表3A和3B。計算每個目標(biāo)基因座的陽性孔的數(shù)量。分布到面板中的分子的實(shí)際數(shù)量按照泊松分布，并通過下述公式進(jìn)行校正革巴標(biāo)=-In[E/N] x N,其中靶標(biāo)是靶分子的經(jīng)泊松校正的計數(shù)，In是自然對數(shù)，E是陰性(空白)孔的數(shù)量，N是反應(yīng)中數(shù)字PCR孔的總數(shù)。來自經(jīng)Bstn消化的胎盤DNA樣品的結(jié)果顯示，當(dāng)與經(jīng)模擬消化的樣品進(jìn)行比較時，約60% -70%的HLCS和RASSF1A分子保持為可檢測的。在母體血液DNA中，低甲基化RASSF1A分子被BstH酶處理完全消化，而一些HLCS分子在樣品中保持為可檢測的。對于ZFY和ZFX測定，從經(jīng)模擬或Bstn消化的DNA樣品計得的拷貝數(shù)無變化(表3A)。分娩后的母體血漿分析顯示，在Bstn酶消化后，都檢測到HLCS和RASSF1A分子的極低水平(表3B)。通過MSRE消化、然后通過數(shù)字PCR分析在胎盤DNA樣品中進(jìn)行的基因劑量比較
將HLCS和RASSF1A測定應(yīng)用于10個整倍體和12個21三體胎盤DNA樣品(表4A)。對每個測定進(jìn)行4個面板的計數(shù)(圖2A)。在整倍體和T21樣品中的陽性HLCS和RASSF1A擴(kuò)增數(shù)量的比率為統(tǒng)計上顯著差異的(P = 0.005，曼-懷氏等級和檢驗(yàn))。然而，在2組之間具有大的覆蓋(圖3A)。由整倍體樣品計算的正常參照范圍(限定為HLCS與RASSF1A平均比率±1.9650)為0.86-1.63。超過一半的T21病例落在參照范圍內(nèi)。不同樣品中的2個基因座的甲基化密度異質(zhì)性可以促成HLCS與RASSF1A比率的大的個體間變化。為了解決這一精確性問題，對于整倍體和T21DNA樣品之間的劑量比較可需要更穩(wěn)定的基線。然后研究了獨(dú)立于其甲基化狀態(tài)的胎兒特異性基因座(即ZFY基因座)，以用作在懷有男性胎兒的妊娠中的基因劑量比較的基線。這是該表觀遺傳-遺傳學(xué)(EGG)方法的重要特征。使用于HLCS和RASSF1A比較的經(jīng)相同限制性酶消化的胎盤DNA樣品進(jìn)行ZFY數(shù)字PCR分析(圖2A)。將來自4個面板的總拷貝數(shù)用作上文獲得的HLCS分子的總拷貝數(shù)的參照基線。整倍體樣品的正常參照范圍(限定為HLCS與ZFY的平均比率±1. 96SD)計算為I. 08-1. 62。全部的T21樣品都顯示了比正常參照范圍高的比率(圖3B)。通過MSRE消化、然后通過數(shù)字PCR分析在母體血漿DNA樣品中進(jìn)行的基因劑量比較然后將EGG技術(shù)應(yīng)用于來自整倍體和T21妊娠的母體血漿DNA樣品，以確定該EGG方法是否能被應(yīng)用于胎兒21三體的非侵入性產(chǎn)前檢測。合理地認(rèn)為，盡管母體血漿中的母體HLCS分子被Bstn酶限制性消化，從而留下完整的源自胎兒的高甲基化HLCS分子用于分析，但是源自胎兒的ZFY基因座將不受影響，因?yàn)樵赑CR擴(kuò)增子內(nèi)不存在Bstn酶識別位點(diǎn)，因此提供了用于基因劑量比較的穩(wěn)定的基線。從懷有整倍體胎兒的末三月、中三月、和首三月中的每一個獲得8個母體血漿樣品。在Bstn消化后，在HLCS和ZFY測定的微流體芯片上的至少6個面板中分析每個DNA樣品(圖2B)。使用陽性孔的總數(shù)計算每個樣品中的HLCS與ZFY的比率(表4B)。由24個具有整倍體妊娠的母體血漿樣品計算I. 49-2. 88的正常參照范圍。一個整倍體DNA樣品的比率落在正常參照范圍外。該樣品在Speedvac濃縮期間干燥，然后在樣品制備期間用水重構(gòu)，這可能是不準(zhǔn)確的原因。來自T21妊娠的全部5個母體血漿樣品都具有比參照范圍高的HLCS與ZFY的比率(圖4)。數(shù)據(jù)顯示，用EGG方法，可以在母體血漿樣品非侵入性地檢測胎兒21三體。III.討論在此研究的第一部分中，本發(fā)明人成功地驗(yàn)證了染色體21上的高甲基化胎兒DNA標(biāo)志物，即HLCS基因的啟動子區(qū)域(US專利申請公開第2007/0275402號)。此標(biāo)志物的高甲基化性質(zhì)允許其在母體血漿中通過使用甲基化敏感的限制性酶消化和PCR擴(kuò)增而相對簡單地得到檢測。然后使用HLCS證明該新EGG方法是胎兒染色體劑量分析的可行方法。該EGG方法超過之前的表觀遺傳等位基因比率分析(Tong等人，Clin Chem 2006 ；52 =2194-202)的主要優(yōu)勢在于，使用此方法可以避免后一方法對下述的需求表觀遺傳靶標(biāo)和遺傳靶標(biāo)(即SNP)要存在于相同基因座中，且彼此在短距離內(nèi)。在此研究中，將Y染色體上的ZFY基因用作胎兒特異性遺傳靶標(biāo)的模型。然而在實(shí)踐中，可以使用任何胎兒特異性遺傳靶標(biāo)，例如胎兒從父親遺傳的而且不存在于懷孕母親中的SNP等位基因?？梢韵鄬θ菀椎亻_發(fā)多個此類標(biāo)志物，以確保該方法的廣泛的群體覆蓋。還證明的是，以使用高甲基化HLCS與高甲基化RASSF1A的比率為例，該EGG方法比單單基于表觀遺傳標(biāo)志物的方法具有更高的T21分辨率。該后一方法的亞最優(yōu)性能的一個可能解釋是由于下述事實(shí)在單獨(dú)的源于胎兒的HLCS和RASSF1A分子的DNA甲基化水平上存在差異，如圖I中和在之前公開的亞硫酸鹽測序結(jié)果可見(Chiu等人，Am J Pathol2007 ；170 941-50)。因此，可以預(yù)期從這2個潛在變化的參數(shù)測定的比率將比一個參數(shù)為 相對穩(wěn)定的遺傳標(biāo)志物(如在該EGG方法的情況下)的情況具有更寬的參照間隔。在此研究中，將微流體數(shù)字PCR用作檢測和測量平臺，原因是之前的結(jié)果已顯示其為高度精確的分析方法(Lun等人，Clin Chem2008 ；54 1664-72 ;Lun等人，Proc NatlAcad Sci USA2008 ; 105 :19920-5)。該EGG方法還可以在此分子計數(shù)方案的其它變型中實(shí)施，例如通過使用‘下一代’測序儀的靶向測序。在其它染色體(例如染色體18和13)上開發(fā)對于產(chǎn)前篩查重要的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物，將進(jìn)一步拓寬該EGG方法的可用性。胎兒表觀遺傳標(biāo)志物的一個實(shí)例為SERPINB5基因，其編碼染色體 18 上的 maspin(Chim 等人，Proc Natl Acad Sci USA 2005 ; 102 :14753-8) ο Papageorgiou 等人(Papageorgiou 等人，Am J Pathol 2009 ；174 1609-18)描述了染色體18和13上胎兒表觀遺傳標(biāo)志物的其它實(shí)例。實(shí)施例2近期開發(fā)了用于胎兒21三體檢測的新的表觀遺傳-遺傳學(xué)染色體劑量方法，其中使用胎兒表觀遺傳標(biāo)志物即染色體21上的全羧化酶合成酶(HLCS)的推定啟動子，和胎兒遺傳標(biāo)志物即存在于Y染色體上的鋅指蛋白Y連鎖(ZFY)基因(Tong等人，Clin Chem2010 ；56 :90-8)。為了證明此方法可用于檢測男性和女性胎兒兩者，本發(fā)明人已經(jīng)研究了參照染色體上的父系遺傳的胎兒單核苷酸多態(tài)性(SNP)等位基因用作取代Y染色體標(biāo)志物的表觀遺傳-遺傳染色體21劑量測定的基線的用途。I.材料和方法研究參與者招募了在2009年10月至2010年3月就診于威爾士親王醫(yī)院婦產(chǎn)科的具有整倍體和21三體(T21)妊娠的婦女。從參加此研究的個體獲得了知情同意書，并且從香港中文大學(xué)-新界東聯(lián)網(wǎng)聯(lián)合臨床研究倫理委員會獲得了倫理批準(zhǔn)。在首三月中的常規(guī)產(chǎn)前診斷階段期間收集絨毛膜樣品(CVS)。從分娩后的整倍體末三月妊娠以及從妊娠終止后(TOP)的T21妊娠收集胎盤組織樣品。通過完全染色體核型分型確認(rèn)每個T21病例的染色體狀態(tài)。從全部的個體收集母體外周血樣品(在EDTA管中的 12mL)。血液和組織樣品的處理通過如前描述的雙離心操作程序處理母體外周血樣品(Chiu等人，Clin Chem2001 ；47 :1607-13)。以2，500g離心血細(xì)胞部分，然后去除任何殘余的血漿。分別用QIAampDNA Blood Mini Kit 和 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit (Qiagen)的血液和體液操作程序提取來自外周血細(xì)胞的DNA和來自母體血漿的DNA。 用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)、根據(jù)制造商的組織操作程序提取來自CVS和胎盤的DNA。染色體劑量分析分別通過實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)和數(shù)字PCR(Vogelstein和KinzlerProc Natl Acad Sci USA1999 ;96 :9236_41)分析胎盤組織和母體血漿DNA樣品中染色體21和參照標(biāo)志物的染色體劑量比較。通過將高甲基化HLCS的量與胎兒從父親遺傳的但不存在于懷孕母親中的SNP等位基因(rs6636，a C/G SNP)的量進(jìn)行比較，進(jìn)行染色體劑量分析。SNP rs6636位于染色體14上含有8個(TMED8)基因的跨膜emp24蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其平均雜合率為 O. 451+/-0. 149(dbSNP build 130)。rs6636 是之前描述的 SNP(Chow等人，Clin Chem2007 ；53 :141_2)之一。在此文獻(xiàn)中將 rs6636SNP 測定表示為 TMED8-C/GSNP測定。甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶(MSRE)消化使用甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶BstUI (New England Biolabs)消化低甲基化DNA。在60C下用BstH酶消化提取的DNA 16小時。對于CVS、胎盤組織和母體血細(xì)胞和正常對照血細(xì)胞，使用40U的Bstn酶消化IOOng的DNA以用于PCR測定。包括經(jīng)模擬消化的等分試樣作為消化對照。對于模擬消化，使等量DNA經(jīng)受相同的消化條件，而不加入酶。對于血漿樣品，使用20U至40U的BstH酶消化來自I. 6-5. 2mL血漿的DNA。用于常規(guī)實(shí)時aPCR分析的測定設(shè)計和反應(yīng)條件對HLCS和TMED8基因座進(jìn)行實(shí)時PCR分析。引物和探針的序列列于表5。HLCS,TMED8-C等位基因和TMED8-G等位基因測定全部以單重反應(yīng)進(jìn)行。在HLCS基因座的PCR擴(kuò)增子內(nèi)，存在2個Bstn酶識別位點(diǎn)。相比之下，TMED8SNP測定不含有任何Bstn酶識別位點(diǎn)。每個反應(yīng)設(shè)置為25 μ L混合物，其終濃度為lxTaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems)、IOOnM TaqMan 探針(Applied Biosystems)、300nM 的每種正向和反向引物(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)以及 25ng DNA輸入量。反應(yīng)在50°C下開始進(jìn)行2分鐘，在95°C下繼續(xù)進(jìn)行10分鐘，然后是40個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C進(jìn)行15秒和60°C進(jìn)行I分鐘。在7300實(shí)時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并通過SDS vl. 3. O軟件(Applied Biosystems)收集和分析突光數(shù)據(jù)。全部反應(yīng)一式兩份進(jìn)行，然后取平均數(shù)。通過從成人男性血細(xì)胞的系列稀釋的基因組DNA(濃度范圍為每個反應(yīng)10000個基因組當(dāng)量(GE)至3個GE)構(gòu)建校正曲線。用于數(shù)字PCR分析的測定設(shè)計和反應(yīng)條件將用于實(shí)時PCR分析的相同寡核苷酸序列用于HLCS和TMED8-C/G SNP數(shù)字PCR分析(表5)。此處，HLCS測定與TMED8-C/GSNP測定中的每一個結(jié)合以雙重反應(yīng)進(jìn)行。將熒光探針標(biāo)記為具有TMED8-C (FAM)的HLCS (VIC)雙鏈體和具有TMED8-G (VIC)的HLCS (FAM)雙鏈體。之前已描述了數(shù)字PCR分析的基礎(chǔ)(Lo等人，Proc Natl Acad Sci USA 2007 ；104 13116-21 ；Lun 等人，Clin Chem 2008 ；54 1664-72)。在 384 孔板中每孔的總反應(yīng)體積為 5μ ,其終濃度為 Ix TaqMan UniversalPCR Master Mix (Applied Biosystems) >IOOnM TaqMan 探針(Applied Biosystems)、和300nM的每種正向和反向引物(Integrated DNA Technologies)。反應(yīng)在50°C下開始進(jìn)行2分鐘,在95°C下繼續(xù)進(jìn)行10分鐘，然后是50個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C進(jìn)行15秒和60°C進(jìn)行I分鐘。在7900HT SequenceDetection System (Applied Biosystems)上以 384 孔形式進(jìn)行實(shí)驗(yàn),然后通過 SDS 2. 3 軟件的“絕對定量”應(yīng)用(Applied Biosystems)收集突光數(shù)據(jù)。
TMED8-C/G SNP測定的特異件使從胎盤組織提取的具有已知TMED8基因型的基因組DNA進(jìn)行HLCS和TMED8雙鏈體測定。用TMED8-C/G SNP測定檢測一個等位基因?yàn)榧兒偷臉悠返牧硪粋€等位基因。C等位基因純和的樣品不應(yīng)該顯示檢測G等位基因TMED8測定的任何信號，反之亦然。β -肌動蛋白測定作為消化對照將之前描述的在胎盤和母體血細(xì)胞二者中皆為非甲基化的β_肌動蛋白區(qū)域用于測定BstUI消化的效率(Chan等人，Clin Chem2006 ；52 :2211_8)。將該β -肌動蛋白測定修改為含有2個Bstn酶識別位點(diǎn)以匹配當(dāng)前HLCS測定的Bstn酶識別位點(diǎn)的數(shù)量。引物和探針的序列列于表5。將相同序列用于實(shí)時qPCR和數(shù)字PCR分析二者中。統(tǒng)計分析使用SigmaStat 3. 5軟件(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計分析。II.結(jié)果和討論通過常規(guī)實(shí)時qPCR進(jìn)行的染色體劑量分析將HLCS和TMED8-C/G SNP測定應(yīng)用于具有雜合的C/G基因型的總計20個整倍體和9個T21胎盤組織樣品。通過使用HLCS與TMED8-C的比率分析6個整倍體和4個T21樣品，并且通過HLCS與TMED8-G的比率分析剩余的14個整倍體和5個T21樣品。通過從成人男性血細(xì)胞提取的系列稀釋的基因組DNA (濃度范圍為每個反應(yīng)10000個GE至3個GE)構(gòu)建校正曲線，將其用于測定檢測樣品中的2個基因座的絕對拷貝數(shù)。將全部3個測定優(yōu)化為具有類似的效率，如通過校正曲線的斜度和y_截距所示。HLCS、TMED8-C和TMED8-G測定的校正曲線的斜度分別為-3. 71,-3. 70和-3. 62，而y-截距顯示循環(huán)閾值分別為39. 62、39. 79和42. 04。胎盤DNA樣品中的HLCS與TMED8-C的比率首先在經(jīng)模擬消化的胎盤DNA樣品中測定HLCS與TMED8-C的比率。由6個整倍體樣品計算的正常參照范圍(限定為HLCS與TMED8-C平均比率±1. 96SD)為I. 78-2. 66。全部4個T21樣品都顯示了比正常參照范圍高的比率(表6A)(圖9A)。然后使相同樣品進(jìn)行Bstn限制性酶消化，之后進(jìn)行實(shí)時PCR分析。盡管非甲基化HLCS分子將被Bstn酶處理消化，從而僅留下抗消化的高甲基化HLCS分子用于PCR檢測，但是TMED8分子將保留完整，因?yàn)樵赥MED8PCR擴(kuò)增子內(nèi)無Bstn酶識別位點(diǎn)。正常參照范圍計算為I. 24-2. 26。正確分類全部樣品(表6B)(圖9B)。在模擬和Bstn消化實(shí)驗(yàn)二者中，包括具有TMED8SNP的純和的GG基因型的胎盤DNA樣品以用于測試測定特異性。當(dāng)應(yīng)用用于檢測C等位基因的TMED8測定時無信號(表6A 和 6B)。
胎盤DNA樣品中的HLCS與TMED8-G的比率首先在經(jīng)模擬消化的胎盤DNA樣品中測定HLCS與TMED8-G的比率。由14個整倍體樣品計算的正常參照范圍為I. 78-2. 66。來自整倍體和T21組中的每一個的一個樣品被錯誤分類(表7A)(圖10A)。
然后使相同樣品進(jìn)行Bstn限制性酶消化，之后進(jìn)行實(shí)時PCR分析。正常參照范圍計算為O. 90-1. 99。來自整倍體和T21組中的每一個的一個樣品被錯誤分類(表7B)(圖10B)。這些樣品不是在模擬消化實(shí)驗(yàn)中被錯誤分類的相同樣品。在模擬和Bstn消化實(shí)驗(yàn)二者中，包括具有TMED8SNP的純和的CC基因型的胎盤DNA樣品以用于測試陣列特異性。當(dāng)應(yīng)用用于檢測G等位基因的TMED8測定時無信號(表7A 和 7B)。β_肌動蛋白作為消化對照通過將β -肌動蛋白測定應(yīng)用于與用于HLCS與TMED8染色體劑量分析的那些相同的經(jīng)模擬和Bstn消化的胎盤DNA樣品，評估Bstn酶消化效率。使用相同的校正標(biāo)準(zhǔn)對樣品中的肌動蛋白序列的量進(jìn)行定量。校正曲線的斜度為-3.41，而y-截距顯示循環(huán)閾值為37.97。結(jié)果顯示，超過96%的DNA在全部檢測樣品中都被消化(表8A和8B)。通過數(shù)字PCR進(jìn)行的染色體劑量分析TMED8-C/G SNP測定的特異件用HLCS和TMED8雙鏈體測定檢測具有雜合的C/G、純和的C/C和純和的G/G基因型的胎盤DNA樣品，以確定用于檢測SNP等位基因中任一個的特異性。將2個樣品用于三組中的每一組。C等位基因純和的樣品不應(yīng)該顯不檢測G等位基因的TMED8測定的任何f目號，反之亦然。對對于每個靶基因座皆為陽性的孔的數(shù)量進(jìn)行了計數(shù)。分布到384孔面板中的分子的總數(shù)按照泊松分布，并如之前描述進(jìn)行了校正(Tong等人Clin Chem 2010;56:90-8)。通過應(yīng)用HLCS和TMED8-C雙鏈體測定，雜合的C/G和純和的C/C基因型的胎盤DNA樣品顯示了 2個基因座都為陽性的孔，而純和的G/G基因型的樣品僅對于HLCS基因座為陽性的，對于TMED8-C等位基因未觀察到可檢測信號(表9A)。通過應(yīng)用HLCS和TMED8-G雙鏈體測定，雜合的C/G和純和的G/G基因型的胎盤DNA樣品顯示了 2個基因座都為陽性的孔，而純和的C/C基因型的樣品僅對于HLCS基因座為陽性的，對于TMED8-G等位基因未觀察到可檢測信號(表9B)。結(jié)果顯示，TMED8-C/G SNP測定在檢測單個SNP等位基因中是特異性的。通過用不同熒光染料標(biāo)記的等位基因特異性探針賦予了特異性。母體血漿DNA樣品中的HLCS與TMED8-C的比率通過比較信息樣品中抗消化的HLCS與胎兒特異性的TMED8SNP等位基因的比率，進(jìn)行了母體血漿DNA分析。將信息樣品定義為其中胎兒為雜合的而母親為純和的樣品，本實(shí)施例中為TMED8-C/GSNP。將胎兒已從父親遺傳的額外等位基因用作染色體21劑量測定的參照基線。將HLCS和TMED8-C雙鏈體測定應(yīng)用于總計16個整倍體和2個T21妊娠。在這些樣品中，TMED8SNP的胎兒和母體基因型分別為C/G和G/G。胎兒特異性SNP等位基因?yàn)镃等位基因。通過Bstn酶消化后進(jìn)行數(shù)字PCR分析母體血漿DNA樣品。在至少I個84孔板中分析每個樣品。使用陽性孔的總數(shù)計算每個樣品中HLCS與TMED8-C等位基因的比率。由整倍體母體血漿樣品計算的正常參照范圍為2. 12-3. 65。從末三月收集了 8個樣品，從中三月和首三月妊娠中的每一個收集了 4個樣品。在這16個整倍體樣品中，10個來自懷有女性胎兒的妊娠，6個來自懷有男性胎兒的妊娠。全部整倍體樣品的HLCS與TMED8-C等位基因比率落在參照范圍內(nèi)。從中三月和首三月妊娠收集的T21樣品顯示比參照范圍高的比率(圖7A)。2個T21病例都懷有女性胎兒。母體血漿DNA樣品中的HLCS與TMED8-G的比率
在信息樣品中的其它組中，TMED8SNP的胎兒和母體基因型分別為C/G和C/C。胎兒特異性SNP等位基因?yàn)镚等位基因。將HLCS和TMED8-G雙鏈體數(shù)字PCR測定應(yīng)用于來自9個整倍體妊娠和I個T21妊娠的經(jīng)Bstn消化的母體血漿DNA樣品。在至少I個384孔板中分析每個樣品。使用陽性孔的總數(shù)計算每個樣品中HLCS與TMED8-G等位基因的比率。由整倍體母體血漿樣品計算的正常參照范圍為2. 06-3. 68。在9個整倍體樣品中，從末三月、中三月、和首三月妊娠分別收集5個、3個和I個病例。這些病例包括懷有女性胎兒的4個妊娠和懷有男性胎兒的5個妊娠。全部整倍體樣品的HLCS與TMED8-G等位基因比率落在參照范圍內(nèi)。懷有女性胎兒的首三月T21妊娠顯示比參照范圍高的HLCS與TMED8-G的比率(圖7B)。β_肌動蛋白作為消化對照通過將β -肌動蛋白數(shù)字PCR測定應(yīng)用于與用于HLCS與TMED8染色體劑量分析的那些相同的經(jīng)Bstn消化的母體血漿DNA樣品，評估Bstn酶消化效率。經(jīng)消化的DNA樣品的等分試樣(總消化混合物的1/50)經(jīng)確認(rèn)顯示，在進(jìn)行染色體劑量分析前β_肌動蛋白測定的不超過I個陽性孔。III.結(jié)論在上一實(shí)施例中，本發(fā)明人已基本上證明了，該EGG方法是用于母體血漿DNA樣品中胎兒染色體劑量分析的可行方法。將高甲基化HLCS基因座用作表觀遺傳組分，其代表一類胎兒特異性分子，并且ZFY基因座為男性胎兒特異的遺傳標(biāo)志物。通過比較染色體21上的胎兒特異性表觀遺傳標(biāo)志物與參照染色體上的胎兒特異性遺傳標(biāo)志物之間的比率，可以推導(dǎo)出染色體21劑量。在此實(shí)施例中，我們進(jìn)一步證明了，表觀遺傳-遺傳染色體劑量方法可以應(yīng)用于三體的產(chǎn)前診斷，其中使用胎兒特異性SNP等位基因作為代替源自男性胎兒的Y染色體標(biāo)志物的遺傳參照基線。此處，將位于染色體14上的TMED8基因座內(nèi)的SNP rs6636用作實(shí)例。通過比較高甲基化HLCS和胎兒特異性TMED8SNP等位基因之間的比率，可以推導(dǎo)出染色體21劑量。證明了 2個SNP等位基因都可用作這樣的遺傳參照基線。通過使用信息SNP等位基因作為遺傳參照基線，可以將該EGG染色體劑量方法應(yīng)用于男性和女性胎兒二者的21三體的產(chǎn)前診斷。此外，一些此類標(biāo)志物的開發(fā)將確保該方法的廣泛群體覆蓋。如之前所描述(Chow等人Clin Chem 2007 ；53 :141_2)，可以首先檢測母體血沉棕黃層樣品(其主要包含母體DNA)，以確定那些SNP的母體基因型。對于母親顯示為純和的SNP，則可以針對檢測未出現(xiàn)于母體血漿中母體基因型中的等位基因。如果血漿樣品對于非母體等位基因?yàn)殛栃缘?，則其提示胎兒已從父親遺傳了該等位基因。然后可將母體血漿中的父系遺傳的胎兒特異性等位基因的定量用作使用表觀遺傳-遺傳方法的基因劑量評估的參照。最后，使用涉及于其它非整倍性中的對產(chǎn)前檢測重要的其它染色體(例如染色體18和13)的表觀遺傳標(biāo)志物，將進(jìn)一步拓展該EGG方法的臨床效用。實(shí)施例3 :用于檢測胎兒18三體的表 觀遺傳-遺傳染色體劑量方法此實(shí)施例證明了表觀遺傳-遺傳(EGG)染色體劑量方法用于檢測胎兒18三體(T18)的應(yīng)用。該EGG方法的此實(shí)施例涉及母體血漿中分別位于染色體18上的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物和位于參照染色體上的胎兒遺傳標(biāo)志物。胎兒表觀遺傳標(biāo)志物優(yōu)選為標(biāo)志物18A[基因組位置chr18 :10022533_10022724，根據(jù)人類基因組2006年3月匯編(hgl8)定義]，其為位于基因VAPA(囊泡相關(guān)膜蛋白質(zhì))-相關(guān)蛋白質(zhì)A)下游75kb和基因APCDDl (腺瘤性結(jié)腸息肉下調(diào)蛋白)上游的421kb之間的146-bp的基因間區(qū)，通過甲基化DNA免疫沉淀和覆瓦式陣列分析(描述于USSN 61/308, 578)鑒定。然而，此胎兒表觀遺傳標(biāo)志物還可以是位于上述基因座(即chr 18 =10022533-10022724)的上游或下游IOOkb內(nèi)的任何含有胞嘧啶的DNA基因組區(qū)域。此外，此胎兒表觀遺傳標(biāo)志物還可以是具有區(qū)分母體血漿中胎兒和母體染色體18的不同表觀遺傳標(biāo)志(DNA甲基化水平)的任何含有胞嘧啶的DNA基因組區(qū)域。母體血漿中的胎兒遺傳標(biāo)志物優(yōu)選為位于Y染色體上的鋅指Y連鎖(ZFY)基因中的區(qū)域。然而，此胎兒遺傳標(biāo)志物還可以是胎兒和其母親之間的任何遺傳差異，包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)和插入/缺失(indel)多態(tài)性。在此實(shí)施例中，本發(fā)明人采用該EGG方法比較染色體18上的標(biāo)志物18A的濃度和Y染色體上的胎兒遺傳標(biāo)志物鋅指蛋白Y連鎖(ZFY)基因的濃度，以進(jìn)行T18的非侵入性產(chǎn)前檢測。I.材料和方法樣品收集從就診于香港威爾士親王醫(yī)院婦產(chǎn)科或香港贊育醫(yī)院產(chǎn)前診斷和咨詢部(Prenatal Diagnostic and Counselling Department)或英國倫敦國王學(xué)院醫(yī)院哈里斯胎兒醫(yī)學(xué)研究中心(Harris Birthright Research Centre for fetal Medicine)的婦女獲得樣品。招募的全部孕婦都經(jīng)知情同意。相應(yīng)的機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)了該研究。在首三月和中三月中的常規(guī)產(chǎn)前診斷階段期間收集絨毛膜樣品(CVS)。通過完全染色體核型分型確認(rèn)了每個整倍體和T18病例的染色體狀態(tài)。從全部的個體收集母體外周血樣品(在EDTA管中的12mL)。收集來自英國的血漿，冷凍保存然后于干冰上分批送往香港。樣品處理通過如前描述的雙離心操作程序處理外周血樣品(Chiu等人，Clin Chem 2001 ；47 :1607-13)。以2，500g離心血細(xì)胞部分，然后去除任何殘余的血漿。分別用QIAamp DNA Blood Mini Kit和 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit (Qiagen)的血液和體液操作程序提取來自外周血細(xì)胞的DNA和來自母體血漿的DNA。用QIAamp DNAMini Kit(Qiagen)、根據(jù)制造商的組織操作程序提取來自CVS和胎盤的DNA。胎盤和母體血細(xì)胞中的標(biāo)志物18A甲基化狀態(tài)的分析
通過克隆和亞硫酸鹽.測序進(jìn)行的DNA甲基化分析通過克隆和亞硫酸鹽測序在6對胎盤組織和母體血細(xì)胞中分析標(biāo)志物18A的甲基化狀態(tài)。簡而言之，使用EZ DNA Methylation Kit (ZymoResearch)、根據(jù)制造商的說明書對提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。通過靶向標(biāo)志物18A區(qū)域的引物，使經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用于PCR的引物序列列于表10。PCR條件概述于表11A。然后用pGEM T-Easy Clone Kit (Promega)、根據(jù)制造商的說明書,將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體中。用大腸桿菌菌株JM109 (Promega)進(jìn)行克隆。然后使用T7和SP6啟動子引物(Promega)、根據(jù)制造商的說明書，擴(kuò)增來自克隆的插入片段(反應(yīng)條件概述于表IlA中的小標(biāo)題“菌落PCR 測定”下)。然后用 BigDye Terminator 循環(huán)測序 vl. I 試劑盒(Applied Biosystems)、根據(jù)制造商的說明書，使PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)(反應(yīng)條件概述于表IlA中的小標(biāo)題“測序反應(yīng)”下)。然后用乙醇沉淀DNA，重懸于IOyL的Hi-Di甲酰胺，之后在3100DNAAnalyzer (Applied Biosystems)上測序。使用 Se qScape v2. 5 軟件(Applied Biosystems)分析測序數(shù)據(jù)。通過檢驗(yàn)非CpG胞嘧啶殘基的轉(zhuǎn)化率，本發(fā)明人確保每個克隆的> 99%亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。通過將每個樣品的甲基化克隆數(shù)除以克隆總數(shù)計算每個CpG位點(diǎn)處的MI。對于每個CpG位點(diǎn)，計算兩個生物學(xué)重復(fù)的平均MI。通過將每個樣品的甲基化克隆數(shù)除以標(biāo)度的克隆總數(shù)得到甲基化位點(diǎn)頻率。T18和整倍體胎盤中標(biāo)志物18A甲基化狀態(tài)的分析通丄寸Epityper泖I定講對于的DNA甲基IK分析用標(biāo)準(zhǔn)MassCLEAVE 操作程序(Sequenom) (Ehrich 等人 Proc Natl Acad SciUSA2005 ；102 :15785_90)(涉及于操作程序中的各反應(yīng)條件的細(xì)節(jié)概述于表11B)進(jìn)行Epityper測定。簡而言之，用祀向標(biāo)志物18A的Epityper測定使經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列列于表IO。將T7啟動子標(biāo)簽加入到反向引物的3 ’末端，將IO個堿基的標(biāo)簽加入到引物的5’末端，以使正向和反向引物之間的解鏈溫度相等。用EZ DNAMethylation Kit (ZymoResearch)、根據(jù)制造商的說明書，使提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，并用PCR擴(kuò)增。然后使用T7DNA聚合酶和T7RNA聚合酶，將PCR產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄為RNA，并用RNase A在具有A-或G-殘基的堿基處進(jìn)行特異性地切割。該切割反應(yīng)產(chǎn)生了含有CpG的片段或CpG單元，其大小將取決于CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)(即，在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后，對于甲基化和非甲基化CpG分別為CpG或TpG)。然后純化產(chǎn)物，用基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時間(MALDI-T0F)質(zhì)譜(MassARRAY Analyzer Compact)進(jìn)行解析。通過將甲基化產(chǎn)物的峰高除以甲基化和非甲基化產(chǎn)物二者的峰高總和計算每個CpG單元的甲基化指數(shù)(MI)。分娩前和分娩后的母體血漿中的甲基化標(biāo)志物18A序列的檢測將實(shí)時定量PCR(qPCR)測定設(shè)計為靶向標(biāo)志物18A。策略性地定位引物和探針，使得母體DNA中的非甲基化CpG位點(diǎn)(而非胎兒DNA中的甲基化CpG位點(diǎn))將被相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶特異性地切割。甲基化敏感的限制件核酸內(nèi)切酶(MSRE)消化使用兩種類型的MSRE 即 HpaII 和 HinPlI (New England Biolabs)消化血衆(zhòng) DNA。對于每個血漿樣品，從O. 8mL-3. 2mL血漿提取DNA并在50 μ L水中稀釋。然后將35 μ L的經(jīng)稀釋的 DNA 與各 20U 的 HpaII 和 HinP 11 (New England Biolabs)在 37°C 下、在 IX NEBufferl中一起孵育2小時。常規(guī)實(shí)時定量PCR分析
I)胎兒分娩前和分娩后的抗消化的標(biāo)志物18A的濃度MSRE消化后，在ABI 7300HT序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)上，通過常規(guī)qPCR擴(kuò)增標(biāo)志物18A的高甲基化DNA序列。每個qPCR測定的反應(yīng)體積為50 μ L，其含有 IX TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)、1500nmol/L 的每種正向和反向 PCR 引物(Integrated DNA Technologies)、和 250nmol/L TaqMan 探針(Integrated DNA Technologies)。用FAM在探針的5’末端進(jìn)行標(biāo)記作為報告分子。加熱情況為50°C下進(jìn)行2分鐘，95°C下進(jìn)行10分鐘，40個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C進(jìn)行15秒和60°C進(jìn)行I分鐘。引物和探針序列列于表12。2)在從懷有男性胎兒的妊娠獲得的分娩前母體血漿中抗消化的標(biāo)志物18A的濃度和ZFY的濃度的關(guān)系在ABI7300HT序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)上,用之前建立的測定(Lun等人，Clin Chem 2008 ;54 :1664-72)，通過qPCR測定ZFY的濃度。每個qPCR測定的反應(yīng)體積為 50μ ,其含有 IX TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) >300nmol/L的每種正向和反向PCR引物、和100nmol/L TaqMan 探針(AppliedBiosystems)。用VIC在探針的5’末端進(jìn)行標(biāo)記作為報告分子。加熱情況為50°C進(jìn)行2分鐘，95°C進(jìn)行10分鐘，40個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C進(jìn)行15秒和60°C進(jìn)行I分鐘。引物和探針序列列于表12。對于通過qPCR分析進(jìn)行定量，通過從男性外周血細(xì)胞樣品提取的系列稀釋的已知濃度的基因組 DNA (其通過 NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Waltham),使用DNA-50設(shè)置進(jìn)行定量)生成校正曲線。然后使用其構(gòu)建具有從每個反應(yīng)3個拷貝至每個反應(yīng)10，000個拷貝的線性動態(tài)范圍的定量標(biāo)準(zhǔn)。檢測的限值(LOD)為每個反應(yīng)3個拷貝。在LOD濃度下進(jìn)行20個重復(fù)的反應(yīng)，100%的孔為陽性的且具有39. I的定量循環(huán)中值(范圍為38. 2-40. 8)。將檢測到的高于該限值的任何信號看作是不可檢測的。全部反應(yīng)進(jìn)行兩次，取平均數(shù)。在每一次PCR運(yùn)行中都包括多個水空白(無模板的對照)。EGG染色體劑量分析本發(fā)明人采用該EGG方法比較了從整倍體和T18妊娠獲得的胎盤組織(CVS)和母體血漿樣品中染色體18上的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物即標(biāo)志物18A的相對劑量與Y染色體上的胎兒遺傳標(biāo)志物即ZFY的相對劑量。甲基化敏感的限制件核酸內(nèi)切酶(MSRE)消化涉及標(biāo)志物18A的EGG分析的消化操作程序與用于qPCR分析的相同。為了分析胎盤樣品，使50ng的DNA進(jìn)行消化。全部胎盤組織都從首三月獲得。為了分析血漿樣品，從獲自整倍體或T18妊娠的首三月、中三月和末三月的I. 6mL-3. 2mL血漿提取DNA。將來自每個病例的提取的DNA稀釋到50 μ L水中，然后將其35 μ L進(jìn)行消化。用于數(shù)字PCR分析的測定設(shè)計和反應(yīng)條件開發(fā)了雙鏈體數(shù)字PCR測定以擴(kuò)增抗消化的標(biāo)志物18Α和ZFY序列。之前已描述了數(shù)字 PCR 分析的基礎(chǔ)(Lo 等人 Proc Natl Acad Sci U SA 2007 ；104 13116-21 ；Tong等人Clin Chem 2010;56:90-8)。每孔的反應(yīng)體積為5 μ L，其終濃度為Ix TaqMan Universal PCRMaster Mix (Applied Biosystems)和每個祀標(biāo)的相應(yīng)引物和探針濃度。對于標(biāo)志物 18A,反應(yīng)包括 250nM TaqMan 探針(Integrated DNA Technologies)和1500nM的每種正向和反向引物(Integrated DNA Technologies)。對于ZFY,反應(yīng)包括IOOnM TaqMan 探針(Applied Biosystems)和300nM的每種正向和反向引物(Integrated DNA Technologies)。用報告分子FAM標(biāo)記標(biāo)志物18A的探針,而用報告分子FAM標(biāo)記ZFY的探針(表12)。每個靶標(biāo)的數(shù)字PCR反應(yīng)的總數(shù)為384。引物和探針序列與用于qPCR的那些相同。為了檢驗(yàn)消化完全，開發(fā)了其它數(shù)字PCR測定，以革巴向β -肌動蛋白基因上的區(qū)域，其(i)在來自首三月的胎盤和母體血細(xì)胞中為完全非甲基化的(圖17);且(ii)含有和標(biāo)志物18A類似的MSRE的識別位點(diǎn)數(shù)量和類型。通過克隆的亞硫酸鹽測序確認(rèn)此特定 區(qū)域的甲基化狀態(tài)(圖17)。用于涉及于亞硫酸鹽測序分析的PCR擴(kuò)增的引物序列列于表10。反應(yīng)條件和針對標(biāo)志物18A描述的相同。預(yù)期完全消化后無β-肌動蛋白序列可檢測至丨J。反應(yīng)體積為每孔 5 μ L,其終濃度為 lxTaqMan Universal PCR Master Mix (AppliedBiosystems)以及 250nMTaqMan 探針(Applied Biosystems)和 900nM 的每種正向和反向引物(Integrated DNA Technologies)。用報告分子VIC在探針的5’末端進(jìn)行標(biāo)記(表10)。在7900HT序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行測定。在50°C下開始反應(yīng)2min，在95°C下繼續(xù)進(jìn)行l(wèi)Omin，然后是55個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C進(jìn)行15秒和60°C進(jìn)行I分鐘。對于每個靶標(biāo)，數(shù)字PCR反應(yīng)的總數(shù)為96。通過SDS 2. 3軟件的“絕對定量”應(yīng)用(Applied Biosystems)收集全部數(shù)字PCR測定的熒光數(shù)據(jù)。統(tǒng)計分析用SigmaStat 3. O軟件(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計分析。II.結(jié)果標(biāo)志物18A是潛在的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物之前的研究顯示，在胎盤和母體血細(xì)胞之間為差別甲基化的基因組區(qū)域具有被開發(fā)為母體血漿中的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物的潛力(Chim等人Clin Chem 2008;54:500-11;Tong等人Clin Chem 2010;56:90-8)?？寺『蛠喠蛩猁}測序結(jié)果揭示了，標(biāo)志物18A在整倍體胎盤(η = 6)中主要為甲基化的，而在母體血細(xì)胞中基本上為非甲基化(η = 6)(圖12)。胎盤和母體血細(xì)胞中的平均甲基化指數(shù)分別為0. 68和0. 01。本發(fā)明人已通過Epityper研究了標(biāo)志物18Α在整倍體(η = 6)和Τ18 (η = 6)胎盤中的甲基化水平。進(jìn)行了曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)，以比較在每個CpG單元處整倍體胎盤與Τ18胎盤的MI (圖13)。合理地認(rèn)為，如果標(biāo)志物18Α的甲基化水平不在整倍體和Τ18胎盤之間顯著改變，則其可以用于比較整倍體和Τ18母體血漿中的胎兒染色體18的劑量。發(fā)現(xiàn)在標(biāo)志物18Α的靶區(qū)域中，全部CpG單元都不在整倍體和Τ18胎盤之間具有顯著的差別甲基化(圖13)。在酶消化后的母體血漿中的標(biāo)志物18Α檢測本發(fā)明人分析并比較了分娩前和分娩后24小時獲得的母體血漿DNA中抗消化的標(biāo)志物18Α的濃度。在每一個消化后樣品中都無法檢測到非甲基化肌動蛋白序列，這指示消化完全。在分娩胎兒前，在末三月妊娠(η = 10)中的抗消化的標(biāo)志物18Α序列的中值濃度為806個拷貝/mL。分娩后，血漿濃度下降到測定的檢測限值以下，估計為每反應(yīng)3個拷貝。胎兒分娩前和分娩后的抗消化的標(biāo)志物18A序列的血漿濃度是統(tǒng)計上顯著差異的(Wilcoxon 符號秩檢驗(yàn)，P-值=O. 002)(圖 14A)。已經(jīng)進(jìn)一步證實(shí)了，抗消化的標(biāo)志物18A序列的血漿濃度與ZFY基因的血漿濃度顯著相關(guān)，所述ZFY基因是已建立的分娩前胎兒遺傳標(biāo)志物(η = 13, r = 0.91 ;P-值< O. 00001 ；Spearman相關(guān)性)(圖14B)。這些結(jié)果提示了，母體血漿中的抗消化的標(biāo)志物18A序列源自胎兒。EGG染色體-劑量分析胎盤DNA樣品中的標(biāo)志物18A與ZFY的比率
用標(biāo)志物18A和ZFY的雙鏈體數(shù)字PCR測定分析來自懷有男性胎兒的首三月胎盤DNA樣品(T18的為5個，整倍體的為5個)。整倍體和T18樣品中標(biāo)志物18A與ZFY的比率為顯著差異的(曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)，P-值=O. 023)。限定為標(biāo)志物18A與ZFY的平均比率±1. 96SD的整倍體樣品的正常參照范圍為I. 20-1. 66。全部的T18病例都具有比參照上限高的比率(圖15)。母體血漿樣品中的標(biāo)志物18A與ZFY的比率為了證明此方法是非侵入性地檢測母體血漿中的T18的可行方法，本發(fā)明人分析了從懷有整倍體男性胎兒的孕婦獲得的27個母體血漿樣品和從懷有T18男性胎兒的孕婦獲得的9個母體血漿樣品。在該27個整倍體病例中，分別從首三月、中三月和末三月獲得了 18個、4個和9個病例。從首三月獲得了全部T18病例。整倍體和T18組的中值妊娠期分別為14. I和13. 3。正常參照范圍為O. 34-3. 04 (圖16)?；诖藚⒄辗秶?，27個整倍體病例中有26和9個T18中有8個被正常分類，得到的靈敏度為88. 9%，特異性為96. 3%。β_肌動蛋白作為消化對照通過用β_肌動蛋白測定分析經(jīng)酶消化的母體血漿樣品，評估酶消化效率，所述β -肌動蛋白測定靶向胎盤和母體血細(xì)胞中完全非甲基化的、同時含有類似的MSRE限制性位點(diǎn)作為標(biāo)志物18Α擴(kuò)增子的區(qū)域(圖17)。在全部的經(jīng)消化的血漿樣品中都無法檢測到β-肌動蛋白序列。III.結(jié)論此實(shí)施例示例了，使用高甲基化標(biāo)志物18Α作為染色體18上的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物和使用ZFY作為Y染色體上的胎兒遺傳標(biāo)志物，可以應(yīng)用該EGG方法以從母體血漿獲得胎兒染色體18的相對劑量。還已經(jīng)證明了，通過用該EGG方法比較整倍體和Τ18母體血漿樣品中的該相對染色體劑量，18三體的非侵入性產(chǎn)前檢測是可行的。使用此EGG方法進(jìn)行18三體的非侵入性產(chǎn)前檢測，可以通過代替Y-特異性胎兒遺傳標(biāo)志物(其在此實(shí)施例中用作示例)與其它胎兒遺傳標(biāo)志物(例如參照染色體上父系遺傳的SNP) —起，覆蓋一般群體中的更多胎兒，從而特異性地測量母體血漿中的胎兒參照染色體的劑量。實(shí)施例4 :用于檢測胎兒13三體的表觀遺傳-遺傳染色體劑量方法此實(shí)施例證明了表觀遺傳-遺傳(EGG)染色體劑量方法用于檢測胎兒13三體(Τ13)的應(yīng)用。此EGG方法涉及分別位于染色體13上的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物和位于參照染色體上的胎兒遺傳標(biāo)志物。胎兒表觀遺傳標(biāo)志物優(yōu)選為標(biāo)志物13Α[基因組位置chrl3 105941431-105941818，根據(jù)人類基因組2006年3月匯編(hgl8)定義]。其為位于基因EFNB2 (ephrin-B2)的3’末端處的188_bp區(qū)域，通過甲基化DNA免疫沉淀和覆瓦式陣列分析(描述于USSN 61/308, 578)進(jìn)行鑒定。然而，此胎兒表觀遺傳標(biāo)志物還可以是位于上述基因座(即chrl3 105941431-105941818)上游或下游IOOkb內(nèi)的任何含有胞嘧啶的DNA基因組區(qū)域。此外，此胎兒表觀遺傳標(biāo)志物還可以是具有區(qū)分母體血漿中胎兒和母體染色體13的不同表觀遺傳標(biāo)志(DNA甲基化水平)的任何含有胞嘧啶的DNA基因組區(qū)域。母體血漿中的胎兒遺傳標(biāo)志物優(yōu)選為位于Y染色體上的鋅指Y連鎖(ZFY)基因中的區(qū)域。然而，此胎兒遺傳標(biāo)志物還可以是胎兒和其母親之間的任何遺傳差異，包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)和插入/缺失(indel)多態(tài)性。材料和方法樣品收集從就診于香港威爾士親王醫(yī)院婦產(chǎn)科或英國倫敦國王學(xué)院醫(yī)院哈里斯胎兒醫(yī)學(xué)研究中心的婦女獲得樣品。招募的全部孕婦都經(jīng)知情同意。相應(yīng)的機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)了該研究。在首三月和中三月中的常規(guī)產(chǎn)前診斷階段期間收集絨毛膜樣品(CVS)。通過完全染色體核型分型確認(rèn)了每個整倍體和T 13病例的染色體狀態(tài)。從全部的個體收集母體外周血樣品(在EDTA管中的12mL)。收集來自英國的CVS，冷凍保存然后于干冰上分批送往香港。在此研究中，招募了 5個T13病例(4個來自首三月，I個來自中三月)和10個整倍體病例(全部來自首三月)。樣品處理通過如前描述的雙離心操作程序處理母體外周血樣品(Chiu等人，Clin Chem2001 ；47 :1607-13)。以2，500g離心血細(xì)胞部分，然后去除任何殘余的血漿。用QIAamp DNABlood Mini Kit(Qiagen)的血液和體液操作程序提取來自外周血細(xì)胞的DNA。用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)、根據(jù)制造商的組織操作程序提取來自CVS和胎盤的DNA。胎盤和母體血細(xì)胞中標(biāo)志物13A甲基化狀態(tài)的分析通過克降和亞硫酸鹽測序講行的DNA甲基化分析通過克隆和亞硫酸鹽測序，在6對胎盤組織和母體血細(xì)胞中分析標(biāo)志物13A的甲基化狀態(tài)。使用EZ DNA Methylation Kit (ZymoResearch)、根據(jù)制造商的說明書,對提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。用祀向標(biāo)志物13A區(qū)域的正向引物'5-aggaagagagGGAGGATAGGAGGAGGGAGTTATAGT-31 和反向引物'5-cagtaatacgactcac tatagggagaaggctAAAATTACACACAATACACACCAAAAAAT，使經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將此組弓I物設(shè)計為用Epityper測定進(jìn)行分析，但其還可應(yīng)用于經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA的PCR擴(kuò)增以進(jìn)行亞硫酸鹽測序分析。PCT條件概述于表13A。之后用pGEMT-Easy Clone Kit (Promega)、根據(jù)制造商的說明書將PCR產(chǎn)物TA克隆到質(zhì)粒載體中。用大腸桿菌菌株JM109 (Promega)進(jìn)行克隆。然后使用T7和SP6啟動子引物(Promega)、根據(jù)制造商的說明書，擴(kuò)增來自克隆的插入片段(反應(yīng)條件概述于表13A中的小標(biāo)題“菌落PCR測定”下)。然后用BigDye TerminatorCycle Sequencing vl. I試劑盒(Applied Biosystems)、根據(jù)制造商的說明書使PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)(反應(yīng)條件概述于表13A中的小標(biāo)題“菌落PCR測定”下)。然后用乙醇沉淀DNA,重懸于 10 μ L 的 Hi-Di 甲酸胺，并在 3100DNA Analyzer (Applied Biosystems)上測序。使用SeqScape ν2· 5軟件(Applied Biosystems)分析測序數(shù)據(jù)。通過檢驗(yàn)非CpG胞卩密唳殘基處的轉(zhuǎn)化率，本發(fā)明人確保了每個克隆的> 99 %亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。通過將每個樣品(我們實(shí)驗(yàn)中為8個)的甲基化克隆數(shù)除以克隆總數(shù)計算每個CpG位點(diǎn)處的MI。對于每個CpG位點(diǎn)，計算兩個生物學(xué)重復(fù)的平均MI。通過將每個樣品中的甲基化克隆數(shù)除以標(biāo)度的克隆總數(shù)得到甲基化位點(diǎn)頻率。在T13和整倍體胎盤中標(biāo)志物13A甲基化狀態(tài)的分析
通丄寸Epityper泖I定講對于的DNA甲基IK分析用標(biāo)準(zhǔn)MassCLEAVE 操作程序(Sequenom) (Ehrich 等人 Proc Natl Acad SciUSA2005 ；102 :15785_90)(涉及于操作程序中的各反應(yīng)條件的細(xì)節(jié)概述于表13B)進(jìn)行Epityper測定。簡而言之，用祀向標(biāo)志物13A區(qū)域的正向引物'5-aggaagagagGGAGGATAGGAGGAGGGAG TTATAG T-3 1 和反向引物'5-cagtaatacgactcactatagggagaaggctAAAA TTACACACAATACACACCAAAAAAT-3 '，使經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在此組引物中，將T7啟動子標(biāo)簽加入到反向引物的T末端，將10個堿基的標(biāo)簽加入到引物的5'末端，以使正向和反向引物之間的解鏈溫度相等。用EZ DNA MethylationKit (ZymoResearch)、根據(jù)制造商的說明書,使提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,并用PCR擴(kuò)增。然后使用T7DNA聚合酶和T7RNA聚合酶，將PCR產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄為RNA，并用RNase A在具有A-或G-殘基的堿基處進(jìn)行特異性地切割。該切割反應(yīng)產(chǎn)生了含有CpG的片段或CpG單元，其大小將取決于CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)(即，在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變后，對于甲基化和非甲基化CpG分別為CpG或TpG)。然后純化產(chǎn)物，用基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時間(MALDI-T0F)質(zhì)譜(MassARRAY Analyzer Compact)解析。通過將甲基化產(chǎn)物的峰高除以甲基化和非甲基化產(chǎn)物二者的峰高總和計算每個CpG單元的甲基化指數(shù)(MI)。EGG染色體劑量分析本發(fā)明人采用該EGG方法比較了從整倍體和T13妊娠獲得的胎盤組織(CVS)中染色體13上的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物即標(biāo)志物18A和Y染色體上的胎兒遺傳標(biāo)志物即ZFY的相對劑量。甲基化敏感的限制件核酸內(nèi)切酶(MSRE)消化使用三種類型的MSRE 即 AccI、NlaIV和 HpaII (FastDigest 酶,Fermentas LifeSciences)消化胎盤DNA。對于每個樣品，將50ng的胎盤DNA與各2FDU的上述酶在37°C下、在IX FastDigest Buffer中一起孵育2小時，然后在65°C下酶滅活20分鐘。用于數(shù)字PCR分析的測定設(shè)計和反應(yīng)條件開發(fā)了 2個單鏈體數(shù)字PCR測定以分別擴(kuò)增抗消化的標(biāo)志物13A和ZFY。之前已描述了數(shù)字PCR分析的基礎(chǔ)(Lo 等人Proc Natl Acad SciUSA2007 ；104 :13116_21 ;Tong等人 Clin Chem 2010 ；56 :90_8)。每孔的反應(yīng)體積為5 μ L,其終濃度為Ix TaqMan Universal PCRMasterMix (Applied Biosystems)和每個祀標(biāo)的相應(yīng)引物和探針濃度。對于標(biāo)志物13A,反應(yīng)包括250nMTaqMan 探針(Integrated DNA Technologies)和 9OOnM 的每種正向和反向引物(Integrated DNA Technologies)。對于 ZFY,反應(yīng)包括 IOOnM TaqMan 探針和 300nM 的每種正向和反向引物(Integrated DNA Technologies)。用報告分子FAM標(biāo)記標(biāo)志物13A的探針，而用報告分子FAM標(biāo)記ZFY的探針(表14)。每個靶標(biāo)的數(shù)字PCR反應(yīng)的總數(shù)為192。在7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)在50°C下開始進(jìn)行2分鐘，在95°C下繼續(xù)進(jìn)行10分鐘，對于標(biāo)志物13A然后是55個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C進(jìn)行15秒和60°C進(jìn)行I分鐘；對于ZFY然后是45個循環(huán)，每個循環(huán)為95°C進(jìn)行15秒和60°C進(jìn)行I分鐘。通過SDS 2. 3軟件的“絕對定量”應(yīng)用(AppliedBiosystems)收集突光數(shù)據(jù)。統(tǒng)計分析 用SigmaStat 3. O軟件(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計分析。II.結(jié)果標(biāo)志物13A是潛在的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物之前的研究已顯示，在胎盤和母體血細(xì)胞之間為差別甲基化的基因組區(qū)域具有被開發(fā)為母體血漿中的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物的潛力(Chim等人Clin Chem 2008 ；54 500-11 ；Tong等人Clin Chem 2010;56:90-8)?？寺『蛠喠蛩猁}測序結(jié)果揭示了，標(biāo)志物13A在整倍體胎盤(η = 6)中主要為甲基化的，而在母體血細(xì)胞中基本上為非甲基化(η = 6)(圖18)。胎盤和母體血細(xì)胞中的平均甲基化指數(shù)分別為O. 78和O. 00。本發(fā)明人已通過Epityper研究了標(biāo)志物13Α在整倍體(η = 5)和Τ18 (η = 5)胎盤中的甲基化水平。進(jìn)行了曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)，以比較在每個CpG單元處5個整倍體胎盤與5個Τ13胎盤的MI (圖19)。合理地認(rèn)為，如果標(biāo)志物13Α的甲基化水平不在整倍體和Τ18胎盤之間顯著改變，則其可以用于比較整倍體和Τ18胎兒組織或母體血漿中的胎兒染色體13的劑量。發(fā)現(xiàn)在標(biāo)志物13Α的靶區(qū)域中，3個CpG單元都不在整倍體和Τ13胎盤之間具有顯著的差別甲基化(圖19)。因此，通過靶向這3個CpG單元，本發(fā)明人設(shè)計了其后續(xù)的數(shù)字PCR測定。使用胎盤DNA樣品的EGG染色體-劑量分析用標(biāo)志物13Α和ZFY的單鏈體數(shù)字PCR測定分析來自懷有男性胎兒的妊娠的胎盤DNA樣品(Τ13的為5個，整倍體的為10個)。整倍體和Τ13樣品中標(biāo)志物13Α與ZFY的比率為顯著差異的(曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)，P-值=O. 023)。限定為標(biāo)志物13Α與ZFY的平均比率±1. 96SD的整倍體樣品的正常參照范圍為I. 40-2. 10。除一個以外，全部Τ13病例都具有比參照上限大的比率(圖20)。III.結(jié)論此實(shí)施例示例了，使用高甲基化標(biāo)志物13Α作為染色體13上的胎兒表觀遺傳標(biāo)志物和使用ZFY作為Y染色體上的胎兒遺傳標(biāo)志物，可以應(yīng)用該EGG方法以在首三月和中三月期間獲得的胎盤組織中獲得胎兒染色體13的劑量。通過比較整倍體和Τ13胎盤組織中的該相對染色體劑量，檢測13三體是可行的。此方法具有應(yīng)用于以非侵入性方式獲得母體血漿中胎兒染色體13的相對染色體劑量和檢測13三體的潛力。出于各種目的，本申請中引用的全部專利、專利申請、和其它公開文件(包括GenBank登記號)都通過引用全文并入。序列表SEQ ID NO : lrs6636 的 dbSNP (獲自網(wǎng)站 ncbi. nlm. nih. gov/snp)
GAAGATTTTC CAAACTACTT TATGTCATTT AGCTTCTATT TTCTGAAGGG CTTTCTTTGGTGCCATGTAC TCAGATCAGT CAGTTGACTG AAAGATGATC ATGTTTTCTT CGTAAAGATTTAAGCAATTG GCAACTACAA AGACATTATT TTCTTACTGT TCTATATCAT GTACTGTTGCTGACATTACA AAAAGGGTCT GGAAGGGAAA CCGTGTCACT GTTTTATCTT TTTTCTTTAAAATACAAAAG TATCCCAACT AATCATTTAT TATGGTCAGC TTGTTTTACA TGTCCCCTAT[C/G]ATGAGAAATG CTATCAACAT CTGTGATTTC TAAGAGTCTT ACCAAATTGT TACTTTAATTCTTGTGTCCT GCTGAGTGGT TTTTCTTTTA AAATACCATT TTTATCACCC TGTGGCACTGGGTGTGTTAC TGCGATTACA CTGATGATTC TGAGCTGTGC TTCTTCAAGT AGCTCAGTTCTTGCGTTTTA TATTAGGTAA CAGTTTTGTG ATGCTTTTGT GCATTCTTTG TCATCTCTTCTGAGTTTTCG AATCTGTCAT AAATAAACTT TTTCACTATG CACCTGGTAA CATCTGAGTTSEQ ID NO 2包括SNP rs6636上游和下游IOObp的DNA序列(獲自網(wǎng)站genome,ucsc. edu/cgi-bin/hgGateway)GGAAGGGAAACCGTGTCACTGTTTTATCTTTTTTCTTTAAAATACAAAAGTATCCCAACTAATCATTTATTATGGTCAGCTTGTTTTACATGTCCCCTAT[C/G]ATGAGAAATGCTATCAACATCTGTGATTTCTAAGAGTCTTACCAAATTGTTACTTTAATTCTTGTGTCCTGCTGAGTGGTTTTTCTTTTAAAATACCATT表I.用于常規(guī)實(shí)時PCR和數(shù)字PCR測定的寡核苷酸序列和特異性
PCT 條件
權(quán)利要求
1.用于檢測孕婦懷有的胎兒中的染色體非整倍性的方法，所述方法包括下述步驟(a)測定取自所述孕婦的生物樣品中胎兒來源的甲基化標(biāo)志物的量，其中所述甲基化標(biāo)志物位于與所述染色體非整倍性相關(guān)的染色體上或位于與所述染色體非整倍性相關(guān)的染色體的區(qū)段內(nèi)，并且其中所述胎兒來源的甲基化標(biāo)志物由于DNA差別甲基化而與其母體來源的對應(yīng)物相區(qū)分；(b)測定所述樣品中胎兒來源的遺傳標(biāo)志物的量，其中所述遺傳標(biāo)志物位于參照染色體上，并且其中所述胎兒來源的遺傳標(biāo)志物由于多核苷酸序列的差別而與所述樣品中其母體來源的對應(yīng)物相區(qū)分，或所述遺傳標(biāo)志物不存在于母體基因組；(C)測定來自(a)和(b)的所述量的比率；以及(d)將所述比率與標(biāo)準(zhǔn)對照進(jìn)行比較，其中所述比率高于或低于所述標(biāo)準(zhǔn)對照指示所述胎兒中存在所述染色體非整倍性。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述胎兒來源的甲基化標(biāo)志物來自胎盤。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述母體來源的對應(yīng)物來自所述孕婦的血細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述胎兒來源的甲基化標(biāo)志物比其母體來源的對應(yīng)物甲基化程度高。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述胎兒來源的甲基化標(biāo)志物比其母體來源的對應(yīng)物甲基化程度低。
6.如權(quán)利要求I所述的方法,其中所述樣品為母體全血、血清、血漿、尿液、羊水、生殖道灌洗液、胎盤組織樣品、絨毛膜樣品、或含有分離自母體血液的胎兒細(xì)胞的樣品。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述樣品含有胎兒核酸。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述甲基化標(biāo)志物為全羧化酶合成酶(HLCS)基因的一部分或鄰近全羧化酶合成酶(HLCS)基因。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述甲基化標(biāo)志物為所述HLCS基因的推定啟動子。
10.如權(quán)利要求I所述的方法,其中所述甲基化標(biāo)志物為標(biāo)志物18A或標(biāo)志物13A。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟(a)包括用差別修飾甲基化和非甲基化DNA的試劑處理所述樣品。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述試劑包括亞硫酸氫鹽或者基于甲基化狀態(tài)結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)或化學(xué)品。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述試劑包括優(yōu)先切割甲基化DNA的酶。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述試劑包括優(yōu)先切割非甲基化DNA的酶。
15.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述遺傳標(biāo)志物不存在于所述母體基因組中。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述遺傳標(biāo)志物位于Y染色體上。
17.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述胎兒來源的遺傳標(biāo)志物由于遺傳多態(tài)性與所述母體來源的遺傳標(biāo)志物相區(qū)分。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述多態(tài)性包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、簡單串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性、或插入-缺失多態(tài)性。
19.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述遺傳標(biāo)志物為鋅指蛋白Y連鎖(ZFY)基因。
20.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述遺傳標(biāo)志物包括TMED8基因中的SNPrs6636。
21.如權(quán)利要求I所述的方法，其中使用多于一種甲基化標(biāo)志物或遺傳標(biāo)志物。
22.如權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟(a)或(b)包括擴(kuò)增所述甲基化標(biāo)志物或遺傳標(biāo)志物。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述擴(kuò)增是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述PCR為甲基化特異性PCR。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述擴(kuò)增為核酸序列特異性擴(kuò)增。
26.如權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟(a)或(b)通過分子計數(shù)進(jìn)行。
27.如權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟(a)或(b)包括數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、陣列捕獲、基于核酸序列的檢測、大規(guī)模平行基因組測序、單分子測序、或用彩色編碼探針對進(jìn)行的多核苷酸多重檢測。
28.如權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟(a)或(b)包括質(zhì)譜或與微陣列雜交、熒光探針、或分子信標(biāo)。
29.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述與染色體非整倍性相關(guān)的染色體為染色體13、18、21、或X染色體。
30.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述比率高于或低于所述標(biāo)準(zhǔn)對照至少I個標(biāo)準(zhǔn)偏差指示了所述胎兒中存在所述染色體非整倍性。
31.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述比率高于或低于所述標(biāo)準(zhǔn)對照至少2個標(biāo)準(zhǔn)偏差指示了所述胎兒中存在所述染色體非整倍性。
32.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述比率高于或低于所述標(biāo)準(zhǔn)對照至少3個標(biāo)準(zhǔn)偏差指示了所述胎兒中存在所述染色體非整倍性。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于通過分析來自孕婦的樣品檢測染色體非整倍性的新的非侵入性方法。所述檢測基于位于與非整倍性相關(guān)的染色體上的胎兒甲基化標(biāo)志物的量和位于參照染色體上的胎兒遺傳標(biāo)志物的量之間的比率，提供了改善的準(zhǔn)確性。
文檔編號C12Q1/68GK102625854SQ201080045399
公開日2012年8月1日 申請日期2010年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者盧煜明, 徐慧怡, 湯羽君, 詹兆沖, 趙慧君, 金勝男 申請人:香港中文大學(xué)