專利名稱：：咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及篩選含有替代咸味或修飾咸味的物質(zhì)的咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法。咸味替代或咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)在食品領(lǐng)域等中是有用的。
背景技術(shù)：
：味覺對(duì)于檢測(cè)食品中的營(yíng)養(yǎng)成分或有害成分是重要的。哺乳動(dòng)物的味覺感受經(jīng)由存在于口腔內(nèi)的味蕾中所含的味覺受體細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。所感受的信號(hào)從味覺受體細(xì)胞向進(jìn)入味蕾中的味神經(jīng)傳遞，再傳遞至中樞。通常，哺乳動(dòng)物的味覺分為五種基本味質(zhì)。即甜味、苦味、酸味、咸味和鮮味(umami)，將它們稱作五種基本味道。近年來隨著研究的進(jìn)展，這五種基本味道所對(duì)應(yīng)的受體日益清楚(非專利文獻(xiàn)1、2)。新型味覺受體的鑒定和分離使味覺感受的新的調(diào)節(jié)方法成為可能。例如，通過使用味覺受體進(jìn)行高親和性激動(dòng)劑或拮抗劑的探索，可以進(jìn)行味覺調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選。這種味覺調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠帶來各種消費(fèi)品的味質(zhì)的改善或改良。作為五種基本味道之一的咸味，其參與鈉離子或其他無(wú)機(jī)陽(yáng)離子的檢測(cè)，對(duì)于保持體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。在咸味的感受通路中，認(rèn)為存在受利尿劑阿米洛利(amiloride)抑制的阿米洛利敏感性通路和不受阿米洛利影響的阿米洛利非敏感性通路(非專利文獻(xiàn)幻。參與兩種咸味感受通路的分子存在于味蕾內(nèi)的味覺受體細(xì)胞中并發(fā)揮作用(非專利文獻(xiàn)2)。認(rèn)為阿米洛利敏感性通路是由上皮性鈉通道(ENaC)介導(dǎo)的。ENaC由4種亞基α、β>Y>δ構(gòu)成，以包含α、β和Υ、或δ、β和Υ的組合的異源多聚體(hetero-multimer)的形式發(fā)揮作用(非專利文獻(xiàn)1。但是，雖然在嚙齒類動(dòng)物中觀察到咸味感受明顯被阿米洛利抑制，但是只在一部分人中觀察到這種抑制，暗示在人咸味感受機(jī)制中存在不同的受體。如上所述，關(guān)于咸味感受機(jī)制包括受體在內(nèi)尚未清楚的部分頗多。從食品中攝取過剩的鹽分被認(rèn)為是高血壓或循環(huán)系統(tǒng)疾病的要因之一，包括日本在內(nèi)，全世界都在開展限制鹽分?jǐn)z取量的行動(dòng)(國(guó)際保健機(jī)構(gòu)、非專利文獻(xiàn)4)。—直都存在著減少鹽分?jǐn)z取量的傳統(tǒng)技術(shù)，例如使用氯化鉀作為氯化鈉的替代品的低鹽調(diào)味品和低鹽食品，但氯化鉀存在著具有苦味和刺激味的問題。因此，使用氯化鉀的食物的味道明顯差。為了改善這種缺陷，有人開發(fā)了一種調(diào)味品組合物，其中除氯化鉀以外，還以特定比例混合氯化銨、乳酸鈣、L-天冬氨酸鈉、L-谷氨酸鹽和/或核酸類呈味物質(zhì)(專利文獻(xiàn)1)；包含抗壞血酸的低鈉咸味調(diào)味品(專利文獻(xiàn)幻；以及使用卡拉膠的苦味抑制方法(專利文獻(xiàn)幻等。但是，減鹽技術(shù)尚未達(dá)到以下水平，即去除咸味以外的不愉快的味道、同時(shí)提供與氯化鈉同等程度的咸味強(qiáng)度。并且，有使用即使減少氯化鈉也不會(huì)損及咸味強(qiáng)度的咸味增強(qiáng)物質(zhì)的減鹽方法。例如已知堿性氨基酸、特別是L-精氨酸具有增強(qiáng)咸味的效果(非專利文獻(xiàn)5、6)。作為應(yīng)用該知識(shí)的技術(shù)，有人開發(fā)了L-精氨酸、L-天冬氨酸和氯化鈉的組合(專利文獻(xiàn)4)，使用堿性氨基酸和枸櫞酸的中和鹽的呈味改良劑(專利文獻(xiàn)幻等。但從減鹽效果、風(fēng)味、咸味強(qiáng)度等角度考慮，尚未開發(fā)出任何的可以充分補(bǔ)償氯化鈉的不足的技術(shù)。另一方面，Kv3家族作為鉀通道家族而已知，該鉀通道家族原來被認(rèn)為在進(jìn)行高頻率刺激的神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮作用，當(dāng)細(xì)胞的膜電位去極化至_20mV以上時(shí)釋放鉀離子，顯示出外向電流(非專利文獻(xiàn)7)。但是，對(duì)于這些，只知道其作為電位依賴性鉀通道的作用(非專利文獻(xiàn)811)，關(guān)于其在靜止膜電位(約_60mV-80mV)附近根據(jù)細(xì)胞外鈉濃度作為陽(yáng)離子通道的作用則完全不知。至于與味覺的關(guān)系，報(bào)道了在從大鼠菌狀乳頭分離的味覺細(xì)胞中，通過PCR法確認(rèn)了Kv3.1和Kv3.2的基因表達(dá)(非專利文獻(xiàn)12)。然而，關(guān)于在該味覺細(xì)胞中的作用則完全不知。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1日本特開平11-187841號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本特開平H810M號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3日本特開平4462758號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4美國(guó)專利第5145707號(hào)說明書專利文獻(xiàn)5日本特開2003-0144088公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1Chandrashekar，J.等人，Nature，444:288^4^006)非專利文獻(xiàn)2=Bachmanov,Α.A.等人，Ann.Rev.Nutr,27:387412(2007)##^lJiK3:DeSimone,J.A.^A,Am.J.Physiol.RegulatoryIntegrativeComp.Physiol.，249:5261(1985)非專禾丨J文獻(xiàn)4Reducingsaltintakeinpopulations-ReportaWHOForumandTechnicalMeeting,[online],[2009年9月20日檢索]，互聯(lián)網(wǎng)URL:http://www.who.int/dietphysicalactivity/reducingsalt/en/非專利文獻(xiàn)5:Riha,W.等人，Chem.Senses,22:778(1997)非專利文獻(xiàn)6=Estrella,N.L.等人，Chem.Senses,34:A117-8(2009)非專利文獻(xiàn)7:Rudy,B.等人，TrendsinNeuroscience,24:5175(2001)##^lJ；K8Gutman,G.Α.等人，PharmacologicalReviews57473508(2005)非專利文獻(xiàn)9=McCormack,T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87:52275231(1990)非專利文獻(xiàn)10HERNANDEZ-PINEDA,R.等人、J.Neurophysiol.82:15121528(1999)非專利文獻(xiàn)11=Madeja,M.等人，Neuropharmacology39:202210(2000)非專利文獻(xiàn)12:Liu，L.等人，Am.J.Physiol.CellPhysiol.289:868880(2005)非專利文獻(xiàn)13=Stahler,F.等人，ChemosensoryPerception1:789(^2008)
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于鑒定咸味受體蛋白和編碼該蛋白的基因，提供用于探索增強(qiáng)或抑制咸味感受的化合物或咸味替代物質(zhì)的篩選系統(tǒng)。解決課題的方法本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)想若在使用咸味受體或調(diào)節(jié)該受體的分子時(shí)，可以有效率地探索、鑒定增強(qiáng)或抑制咸味感受的化合物或咸味替代物質(zhì)，則進(jìn)而可以開發(fā)不改變呈味的有效的減鹽方法，其結(jié)果，可以制造維持呈味不變的含鹽濃度低的食品。而且，進(jìn)行了深入研究，結(jié)果成功地鑒定了參與咸味感受的分子，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明如下。(1)咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選方法，該方法包括下述步驟使受檢物質(zhì)與表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞接觸，并將所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量和未使上述受檢物質(zhì)與上述細(xì)胞接觸時(shí)所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量進(jìn)行比較。(2)(1)所述的方法，其中，通過在鈉離子存在下測(cè)定上述細(xì)胞的細(xì)胞膜電流，來測(cè)定上述陽(yáng)離子的流入量。(3)(1)所述的方法，其中，通過在鈉離子非存在下測(cè)定上述細(xì)胞的細(xì)胞膜電流，來測(cè)定上述陽(yáng)離子的流入量。(4)上述⑴或⑵所述的方法，其中，咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)為咸味增強(qiáng)物質(zhì)或咸味抑制物質(zhì)。(5)上述(1)或C3)所述的方法，其中，咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)為咸味替代物質(zhì)。(6)上述方法，其中，Kv3.2蛋白具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO18、SEQIDNO40,SEQIDNO47,SEQIDNO:49、SEQIDNO:51或SEQIDNO53的氨基酸序列。(7)上述方法，其中，Kv3.2蛋白與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8,SEQIDNO:10、SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18、SEQIDNO:40,SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的序列顯示至少78%以上的序列同一性，并且能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道。(8)上述方法，其中，Kv3.2蛋白具有包含1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加的SEQIDNO2,SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO:10,SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:40,SEQIDNO:47,SEQIDNO:49,SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的氨基酸序列，并且能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道。(9)上述方法，其中Kv3.2蛋白由下述(a)或(b)所示的DNA編碼(a)DNA，其中具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO9,SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDNO15,SEQIDNO17,SEQIDNO39、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO50或SEQIDNO52的核苷酸序列；(b)DNA，其能夠在嚴(yán)格的條件下和與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO7,SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDNO15,SEQIDNO:17、SEQIDNO39,SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDN0:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列、或可由上述核苷酸序列制備的探針進(jìn)行雜交，并且編碼能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道的蛋白。(10)上述方法，其中，Kv3.2蛋白為選自來自人、小鼠、大鼠、爪蟾屬的蛙、狗、馬、黑猩猩、恒河猴、雞、負(fù)鼠、豬或牛的Kv3.2蛋白同系物，以及它們的突變體、它們的片段和它們的嵌合蛋白。(11)上述方法，其中，上述細(xì)胞為以可表達(dá)的形態(tài)導(dǎo)入有編碼Kv3.2蛋白的多核苷酸的卵母細(xì)胞。(12)上述方法，其中，上述細(xì)胞表達(dá)從選自味覺細(xì)胞、舌上皮、腎上腺、松果體、甲狀腺、黑素細(xì)胞和腎臟的組織中分離的Kv3.2基因。(13)Kv3.2蛋白變體，該變體為下述(a)(c)中任一項(xiàng)所示的蛋白(a)蛋白，其中具有SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO51或SEQIDNO53的序列；(b)蛋白，該蛋白與SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO51或SEQIDNO53的序列顯示至少78%以上的序列同一性，并且能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道；(c)蛋白，其具有包含1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加的SEQIDNO47,SEQIDNO49、SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的氨基酸序列，并且能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道。(14)DNA，其編碼Kv3.2蛋白變體，該DNA是下述(a)或(b)所示的DNA(a)DNA，其具有SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDN0:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列；(b)DNA，其能夠在嚴(yán)格的條件下和與SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO50或SEQIDNO:52的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列、或可上述核苷酸序列制備的探針進(jìn)行雜交，并且編碼能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道的蛋白。(15)探索具有正向或負(fù)向調(diào)節(jié)Kv3.2活性的功能的蛋白或構(gòu)成咸味受體的蛋白的方法，該方法包括鑒定在Kv3.2基因表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)的基因中的顯示表達(dá)概況與Kv3.2基因類似的基因、或在Kv3.2基因表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)被抑制的基因。(16)通過鑒定與Kv3.2蛋白或表達(dá)該蛋白的細(xì)胞作用的化合物來探索咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法。(17)探索呈味物質(zhì)或風(fēng)味物質(zhì)的方法，該方法包括鑒定與由Kv3.2蛋白和在味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的蛋白構(gòu)成的通道或復(fù)合體作用的化合物。(18)分離的卵母細(xì)胞或味覺細(xì)胞，其中以可表達(dá)的形態(tài)導(dǎo)入有編碼Kv3.2蛋白的多核苷酸。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明鑒定的咸味受體蛋白構(gòu)成在味覺細(xì)胞中表達(dá)的咸味受體離子通道。激活該受體的物質(zhì)作為咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)、即咸味替代物、咸味增強(qiáng)劑或咸味抑制劑的候選物質(zhì)是有效的。另外，若使用在細(xì)胞表面表達(dá)上述受體的細(xì)胞，則可以提供咸味替代物、咸味增強(qiáng)劑或咸味抑制劑的簡(jiǎn)便的篩選系統(tǒng)。另外，包含咸味替代物質(zhì)或咸味增強(qiáng)物質(zhì)的食品對(duì)抑制過剩的鹽分?jǐn)z取有效，從而對(duì)高血壓或循環(huán)系統(tǒng)疾病的預(yù)防有效。圖1顯示表明小鼠的各種組織中的Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3和Kv3.4基因表達(dá)的RT-PCR結(jié)果(電泳照片)。泳道1舌尖部分(包括菌狀乳頭)、泳道2輪廓乳頭區(qū)、泳道3舌兩側(cè)部分(包括葉狀乳頭)、泳道4不含味蕾的舌上皮、泳道5無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶、泳道6腎臟。圖2顯示當(dāng)細(xì)胞外鈉離子濃度發(fā)生變化時(shí)所觀察到的表達(dá)Kv3.2蛋白(人)的非洲爪蟾卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜電流的變化。KCNC2顯示Kv3.2cRNA的注入。圖3顯示當(dāng)細(xì)胞外鈉離子濃度由OmM變?yōu)?6mM時(shí)所觀察到的表達(dá)Kv3蛋白(人)的非洲爪蟾卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜電流之差。圖4顯示表明小鼠舌上皮中的Kv3.2基因的表達(dá)位點(diǎn)的原位雜交結(jié)果(顯微鏡照片)。圖5顯示所觀察到的表達(dá)與低分子有機(jī)化合物A接觸的Kv3.2蛋白(人)的卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜電流。KCNC2顯示Kv3.2cRNA的注入。圖6顯示當(dāng)細(xì)胞外鈉離子濃度發(fā)生變化時(shí)所觀察到的表達(dá)Kv3.2蛋白(非洲爪蟾)的非洲爪蟾卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜電流。Χ1Κν3.2顯示非洲爪蟾的Kv3.2cRNA的注入。具體實(shí)施例方式以下，詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明的發(fā)明人在含有味蕾的小鼠舌上皮組織中確認(rèn)到編碼屬于Kv3家族的離子通道Κν3·1、Κν3.2、Kv3.3和Κν3·4(Rudy等人，TrendsinNeuroscience,24:517526(2001))的基因的表達(dá)，所述離子通道是原來被認(rèn)為在進(jìn)行高頻率刺激的神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮作用，當(dāng)細(xì)胞的膜電位去極化至_20mV以上時(shí)顯示出電流的鉀通道；還發(fā)現(xiàn)人Kv3.2基因在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的表達(dá)能夠以細(xì)胞膜電流隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的形式參與咸味感受?；谠摪l(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Kv3.2發(fā)揮咸味受體離子通道的作用，可用于篩選新的咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)。另外，他們確認(rèn)Kv3.2基因在味蕾中表達(dá)，在咸味響應(yīng)靈敏度不同的兩種小鼠中發(fā)現(xiàn)了Kv3.2基因存在著相應(yīng)于靈敏度的表達(dá)量之差，進(jìn)一步確認(rèn)Kv3.2為咸味受體。另外，本發(fā)明的發(fā)明人新發(fā)現(xiàn)了味蕾中的Kv3.2蛋白的剪接變體。本發(fā)明的方法包括下述步驟使受檢物質(zhì)與表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞接觸，并將所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量和未使上述受檢物質(zhì)與上述細(xì)胞接觸時(shí)所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量進(jìn)行比較。Kv3.2蛋白是構(gòu)成作為Kv3家族的一員的鉀通道的蛋白，由本發(fā)明的發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)了Kv3.2蛋白具有隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道活性。Kv3.2蛋白是由Kcnc2基因(也記作KCNC2)編碼的多肽。在本發(fā)明中，Kv3.2蛋白的例子包括具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18、SEQIDNO:40,SEQIDNO:47,SEQIDNO:49,SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的氨基酸序列的蛋白。作為編碼人Kv3.2蛋白的多核苷酸，有4種核苷酸序列注冊(cè)在基因數(shù)據(jù)庫(kù)(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/或Ensemblproject,http://www.ensembl.org/index.html,NM_139136,NM_139137,NM_153748,AY243473)中。SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5禾口SEQIDNO:7的核苷酸序列相當(dāng)于上述各核苷酸序列。由各核苷酸序列編碼的氨基酸序列見SEQIDNO2,SEQIDNO4,SEQIDNO:6和SEQIDNO:8。這些各氨基酸序列除C末端區(qū)外具有共通的序列(相當(dāng)于SEQIDNO:2的1538位的部分)，認(rèn)為它們是剪接變體。另夕卜，在同樣的數(shù)據(jù)庫(kù)中，有1種編碼小鼠Kv3.2蛋白的多核苷酸被注冊(cè)(ΝΜ_001025581，SEQIDNO:9)。由SEQIDNO:9的核苷酸序列編碼的氨基酸序列見SEQIDN0:10。另外，作為編碼大鼠Kv3.2蛋白的多核苷酸，有4種核苷酸序列注冊(cè)(NM_139216，NM_139217，ENSRN0T00000049943，X62839)。這些核苷酸序列見SEQIDNO=IUSEQIDN0:13、SEQIDNO:15和SEQIDNO:17。由這些核苷酸序列編碼的氨基酸序列見SEQIDNO12,SEQIDNO14,SEQIDN0:16和SEQIDNO:18。這些氨基酸序列除C末端區(qū)外也具有共通的序列(相當(dāng)于SEQIDN0:12的1593位的部分)，認(rèn)為它們是剪接變體。另外，如后述實(shí)施例所示，非洲爪蟾的Kv3.2蛋白基因被分離出來，顯示該蛋白具有隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道活性。該基因的核苷酸序列見SEQIDNO39,由該基因編碼的Kv3.2蛋白的氨基酸序列見SEQIDNO:40。并且，如后述實(shí)施例所示，從包含味蕾的小鼠舌上皮組織中分離出4種小鼠Kv3.2基因的剪接變體。這些剪接變體的核苷酸序列見SEQIDNO46,SEQIDNO48、SEQIDN0:50和SEQIDN0:52。由這些核苷酸序列編碼的氨基酸序列分別見SEQIDNO47、SEQIDNO:49、SEQIDNO51和SEQIDNO:53。SEQIDNO:10、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO51和SEQIDNO53的氨基酸序列除C末端區(qū)外具有共通的序列(相當(dāng)于SEQIDNO10的1597位的部分)。本發(fā)明的方法中使用的Kv3.2蛋白還包含種間同系物，例如除了上述的具有來自人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的序列的蛋白外，還可以是來自狗、馬、黑猩猩、雞、負(fù)鼠、豬或牛的Kv3.2蛋白。編碼這些蛋白的基因的序列信息分別以下述編號(hào)注冊(cè)，即，狗XM_538289、馬ΧΜ_001488185、黑猩猩XR_020952、雞XM_0012352M、負(fù)鼠ΧΜ_001363374,ΧΜ_001363455、豬ΧΜ_001926426、ΧΜ_001924780,以及牛XM_590276。另外，關(guān)于恒河猴、變色龍蜥蜴、絨猴、豚鼠、懶猴、犰狳、長(zhǎng)鼻袋鼠、小馬島猬、刺猬、三刺魚、大猩猩、大象、沙袋鼠、狐猴、小蝙蝠、鼠兔、兔、嬰猴、紅毛猩猩、蹄兔、果蝠、駒鼯、松鼠、斑馬雀、橫紋東方飩、眼鏡猴、樹駒、以及海豚，編碼它們的Kv3.2蛋白的基因的序列信息分別以下述編號(hào)注冊(cè)，即，恒河猴ENSMMUG00000012362、變色龍蜥蜴ENSACAG00000007691、絨猴ENSCJAG00000001261、豚鼠ENSCP0G00000003474、懶猴ENSCH0G00000007167、犰狳ENSDN0G00000013383、長(zhǎng)鼻袋鼠ENSD0RG00000000056、小馬島猬ENSETEG00000010484、刺猬ENSEEUG00000002220、三刺魚ENSGACG00000019441、大猩猩ENSGG0G00000003896、大象ENSLAFG00000031982、沙袋鼠ENSMEUG00000007789、狐猴ENSMICG00000017734、小蝙蝠ENSMLUG00000010813、鼠兔ENS0PRG00000017272、兔ENS0CUG00000004467、嬰猴ENS0GAG00000000768、紅毛猩猩ENSPPYG00000004780、蹄兔ENSPCAG00000015808、果蝠ENSPVAG00000010964、駒鼯ENSSARG00000006415、松鼠ENSST0G00000004842、斑馬雀ENSTGUG00000007;354、橫紋東方飩ENSTRUG00000003532、眼鏡猴ENSTSYG00000010689、樹鼠句ENSTBEG00000001105、以及海豚ENSTTRG00000013226。編碼Kv3.2的基因并不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，只要由所選擇的基因編碼的Kv3.2蛋白能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道，這些基因的同系物或人工修飾體等具有保守突變的基因也可使用。即，可以是編碼下述蛋白的基因具有在1個(gè)或多個(gè)位置包含1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加的公知蛋白的氨基酸序列的蛋白等。所述Kv3.2蛋白“能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道”是指，當(dāng)表達(dá)該蛋白的細(xì)胞與鈉離子接觸時(shí)，具有增加由于陽(yáng)離子向細(xì)胞內(nèi)流入所產(chǎn)生的細(xì)胞膜電位的活性。陽(yáng)離子的例子包括鈉離子、鈣離子、鎂離子、鋰離子、銨離子等，優(yōu)選為鈉離子。這里，盡管“1個(gè)或多個(gè)”氨基酸殘基的數(shù)目是指根據(jù)氨基酸殘基在蛋白的立體結(jié)構(gòu)中的位置或氨基酸殘基的種類而不同，但具體可以優(yōu)選120個(gè)、更優(yōu)選110個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選15個(gè)、特別優(yōu)選13個(gè)。保守突變的代表性突變?yōu)楸Ｊ厝〈Ｗ鳛楸Ｊ厝〈?，?dāng)取代位點(diǎn)為芳族氨基酸時(shí)，是指Wie、Trp和Tyr間互相取代的突變；當(dāng)取代位點(diǎn)為疏水性氨基酸時(shí)，是指Leu、Ile和Val間互相取代的突變；當(dāng)為極性氨基酸時(shí)，是指Gln和Asn間互相取代的突變；當(dāng)為堿性氨基酸時(shí)，是指Lys、Arg和His間互相取代的突變；當(dāng)為酸性氨基酸時(shí)，是指Asp和Glu間互相取代的突變；當(dāng)為具有羥基的氨基酸時(shí)，是指Ser和Thr間互相取代的突變。被看作保守取代的取代具體包括由Ala取代成Ser或Thr；由Arg取代成GlruHis或Lys；由Asn取代成Glu、Gln、Lys、His或Asp；由Asp取代成AsruGlu或Gln；由Cys取代成Ser或Ala；由Gln取代成Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg；由Glu取代成Gly、Asn、Gin、Lys或Asp；由Gly取代成Pro；由His取代成Asn、Lys,Gin、Arg或Tyr；由Ile取代成Leu、Met、Val或Phe；由Leu取代成lie、Met、Val或Phe；由Lys取代成Asn,Glu,Gin、His或Arg；由Met取代成lie、Leu、Val或Phe；由Phe取代成Trp,Tyr、Met、Ile或Leu；由Ser取代成Thr或Ala；由Thr取代成Ser或Ala；由Trp取代成Phe或Tyr；由Tyr取代成His、Phe或Trp；以及由Val取代成Met、Ile或Leu。上述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等還可以是由于基因所來源的微生物的個(gè)體差異或種的不同等天然發(fā)生的突變或變異的結(jié)果(突變體或變體)。這樣的基因例如可以通過位點(diǎn)特異性誘變法修飾公知的基因的核苷酸序列使所編碼的蛋白的特定位點(diǎn)的氨基酸殘基包括氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加而獲得。并且，上述的具有保守突變的基因可以是編碼下述蛋白的基因相對(duì)于所編碼的氨基酸序列整體具有78%以上、優(yōu)選80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選97%以上、特別優(yōu)選99%以上的同源性，并且與野生型Kv3.2蛋白具有同等功能的蛋白。在本說明書中，“同源性”(homology)有時(shí)是指“同一性”(identity)。另外，基因序列中的各密碼子可被取代成在導(dǎo)入有基因的宿主中容易使用的其它密碼子。具有保守突變的基因可以是通過誘變劑處理等通常用于突變處理的方法獲得的基因。并且，Kv3.2基因只要可以在基因?qū)氲剿拗骷?xì)胞中時(shí)表達(dá)Kv3.2蛋白，可以包含1個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子。編碼Kv3.2的DNA(以下有時(shí)記作“Kv3.2基因”。)的例子包括在嚴(yán)格的條件下可以和與公知的基因序列互補(bǔ)的核苷酸序列或可由該互補(bǔ)序列制備的探針進(jìn)行雜交，并且編碼與公知的Kv3.2蛋白具有同等功能的蛋白的多核苷酸?！皣?yán)格的條件”是指，形成所謂的特異性雜化物、而不形成非特異性雜化物的條件。雖然難以將該條件明確地?cái)?shù)值化，但嚴(yán)格條件的例子包括同源性高的多核苷酸彼此之間、例如具有78%以上同源性、優(yōu)選80%以上同源性、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上同源性、更優(yōu)選95%以上同源性、特別優(yōu)選97%以上同源性的多核苷酸彼此之間雜交、而同源性較其低的多核苷酸彼此之間不雜交的條件；或普通DNA雜交的清洗條件、即在相當(dāng)于在60°C下、1XSSC、0.1%SDS，優(yōu)選在60°C下、0.1XSSC、0.1%SDS，進(jìn)一步優(yōu)選在68°C下、0.IXSSC,0.1%SDS的鹽濃度和溫度下清洗1次、更優(yōu)選2或3次的條件。作為探針，還可以使用與該基因互補(bǔ)的部分序列。這樣的探針可以以根據(jù)公知的基因序列制作的寡核苷酸為引物、以包含這些核苷酸序列的DNA片段為模板，通過PCR來制作。例如，當(dāng)使用具有約300bp長(zhǎng)度的DNA片段作為探針時(shí)，雜交的清洗條件可以是50°C、2XSSC、0.1%SDS。比較各種Kv3家族蛋白的同源性時(shí)，雖然在上述各種動(dòng)物的Kv3.2蛋白同系物間顯示出78%以上的同源性(同一性)，但在比較Kv3.2蛋白與其他Kv3家族蛋白時(shí)最高的同源性為74%。Kv3.2基因可如下獲得根據(jù)公知的Kv3.2基因或本說明書中公開的新的Kv3.2基因、例如編碼具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:40、SEQIDNO47,SEQIDNO49、SEQIDNO:51或SEQIDNO:53所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的核苷酸序列的信息設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊锘蛱结槪褂蒙鲜鲆锘蛱结樅蛠碜阅繕?biāo)生物[例如哺乳動(dòng)物(例如人、小鼠、大鼠、狗、馬、黑猩猩、恒河猴、雞、負(fù)鼠、豬或牛等)]的試樣(例如總RNA、mRNA組分、cDNA文庫(kù))，通過實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法、DNA雜交或RNA雜交等而獲得。Kv3.2基因只要編碼能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道的蛋白即可，可以是片段，也可以是編碼Kv3.2蛋白或其片段與其他蛋白的嵌合蛋白的基因。例如，如上所述，存在Kv3.2蛋白的剪接變體，該共通部分(例如SEQIDNO2的1538位)的C末端側(cè)區(qū)域可被缺失或取代成其他序列的可能性高。將編碼Kv3.2蛋白的多核苷酸以可表達(dá)的形態(tài)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，使Kv3.2蛋白表達(dá)，從而可以獲得具有咸味受體離子通道的細(xì)胞。例如，通過將編碼Kv3.2蛋白的直鏈狀DNA或包含編碼Kv3.2蛋白的序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，可以使Kv3.2蛋白表達(dá)?？杀磉_(dá)的形態(tài)的序列的例子包括根據(jù)DNA信息制備的、并且在編碼Kv3.2蛋白的序列的上游包含編碼Kv3.2蛋白的序列和轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的序列的序列，使能夠生成Kv3.2蛋白。另外，通過向宿主細(xì)胞中注入編碼Kv3.2蛋白的cRNA，也可以獲得具有咸味受體離子通道的細(xì)胞。此時(shí)，在cRNA的5’末端側(cè)包含翻譯所必需的序列。轉(zhuǎn)錄所必需的序列的例子包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列。還可以包含轉(zhuǎn)錄終止序列。翻譯所必需的序列的例子包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)。并且，根據(jù)需要可以包含加工信息位點(diǎn)、例如RNA剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)等。啟動(dòng)子的例子包括來自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、巨細(xì)胞病毒等的啟動(dòng)子。作為導(dǎo)入有編碼Kv3.2蛋白的多核苷酸的細(xì)胞，優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母，特別優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞。例如，可以使用味覺細(xì)胞被濃縮的組分、分離的味覺細(xì)胞、或從選自舌上皮、腎上腺、松果體、甲狀腺、黑素細(xì)胞和腎臟的組織中分離的組織等。認(rèn)為在導(dǎo)入表達(dá)編碼Kv3.2蛋白的多核苷酸的重組載體時(shí)可以進(jìn)行暫時(shí)的功能表達(dá)的細(xì)胞的具體例子包括非洲爪蟾卵母細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、人胚腎(HEK)細(xì)胞、Sf-9昆蟲細(xì)胞等。本發(fā)明提供以能夠表達(dá)的形態(tài)導(dǎo)入有這樣的編碼Kv3.2蛋白的多核苷酸的細(xì)胞。作為細(xì)胞，優(yōu)選卵母細(xì)胞或味覺細(xì)胞，特別優(yōu)選味覺細(xì)胞，其適用于咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選。作為向這些細(xì)胞中導(dǎo)入編碼Kv3.2蛋白的多核苷酸的方法，可以采用公知的方法。向細(xì)胞中導(dǎo)入多核苷酸等的操作所必需的技術(shù)記載在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis,Τ.,"MolecularCloningALaboratoryManual,第二版，，，ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989)等中。如實(shí)施例所示，表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞具有隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道活性。因此，在細(xì)胞中表達(dá)的Kv3.2蛋白能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道。推測(cè)Kv3.2蛋白以多聚體的形式構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道，但只要表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞具有隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道活性，Kv3.2蛋白可以是單體或多聚體?！瓣?yáng)離子通道”是指，允許鈉離子、鈣離子和鉀離子等陽(yáng)離子流入或流出細(xì)胞內(nèi)的通道。并且，如實(shí)施例所示，編碼Kv3.2蛋白的基因在味覺感受器即舌的味蕾中表達(dá)，由于其表達(dá)量在咸味感受靈敏度高的小鼠種系中較在咸味感受靈敏度低的小鼠種系中高，由此支持了Kv3.2蛋白是調(diào)節(jié)咸味感受靈敏度的咸味受體蛋白。因此，通過鑒定與Kv3.2蛋白或表達(dá)該蛋白的細(xì)胞作用的化合物，可以探索咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)。作為這樣的化合物的鑒定方法，除上述方法外，例如還可以通過測(cè)定純化的Kv3.2蛋白與受檢物質(zhì)的結(jié)合來進(jìn)行。此外，通過以相關(guān)蛋白(例如Kv1.2、Chen等人、Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,107:1135211357(2010))的立體結(jié)構(gòu)信息為參考使用計(jì)算機(jī)推測(cè)其立體結(jié)構(gòu)，再使用計(jì)算機(jī)選擇與能夠影響離子通道活性的位點(diǎn)具有親和性的化合物，可以有效率地探索與Kv3.2蛋白作用的化合物。使受檢物質(zhì)與如上操作得到的表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞接觸，再將所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量和未使上述受檢物質(zhì)與上述細(xì)胞接觸時(shí)所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量進(jìn)行比較，從而可以篩選咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)。若在受檢物質(zhì)與表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞接觸時(shí)所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量較未使上述受檢物質(zhì)與上述細(xì)胞接觸時(shí)所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量多，則判斷為受檢物質(zhì)激活咸味受體通道；若在受檢物質(zhì)與表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞接觸時(shí)所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量較未使上述受檢物質(zhì)與上述細(xì)胞接觸時(shí)所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量少，則判斷為受檢物質(zhì)使咸味受體通道失活。另外，在Kv3.2基因表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)的基因中，通過鑒定顯示表達(dá)概況與Kv3.2基因類似的基因或在Kv3.2基因表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)被抑制的基因，還可以探索具有正向或負(fù)向調(diào)節(jié)Kv3.2活性的功能的蛋白或構(gòu)成咸味受體的蛋白。Kv3.2活性是指，Kv3.2蛋白構(gòu)成在表達(dá)其的細(xì)胞中隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道的功能。另外，Kv3.2活性還是指Kv3.2蛋白作為咸味受體蛋白的活性。顯示表達(dá)概況與Kv3.2基因類似的基因是指，基因表達(dá)的組織特異性與Kv3.2基因表達(dá)的組織特異性類似的基因。作為鑒定顯示表達(dá)概況類似的基因的方法之一，可以列舉DNA微陣列法等綜合性基因表達(dá)分析方法。具體而言，從各種組織中提取RNA，利用DNA微陣列法等綜合性基因表達(dá)分析方法探索與Kv3.2基因顯示基因表達(dá)的組織特異性類似的基因，從而可以鑒定這樣的基因。在Kv3.2基因表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)被抑制的基因是指，在Kv3.2基因表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)被抑制、在Kv3.2基因未表達(dá)的細(xì)胞中可以確認(rèn)到表達(dá)的基因。作為鑒定表達(dá)被抑制的基因的方法之一，可以列舉DNA微陣列法等綜合性基因表達(dá)分析方法。具體而言，從各種組織中提取RNA，利用DNA微陣列法等綜合性基因表達(dá)分析方法在Kv3.2基因表達(dá)組織中探索未觀察到表達(dá)的基因，從而可以鑒定這樣的基因。如上所述鑒定的基因，是編碼具有調(diào)節(jié)Kv3.2活性的功能的蛋白或構(gòu)成咸味受體的蛋白的基因，推測(cè)這樣的蛋白與Kv3.2蛋白一同構(gòu)成通道或復(fù)合體，參與味覺感受。并且，通過鑒定與由作為味覺受體的Kv3.2蛋白和在味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的蛋白構(gòu)成的通道或復(fù)合體作用的化合物，還可以探索呈味物質(zhì)或風(fēng)味物質(zhì)。風(fēng)味物質(zhì)是指修飾呈味的物質(zhì)，其可以作為風(fēng)味添加劑在食品中使用。作為呈味物質(zhì)或風(fēng)味物質(zhì)，更具體而言，可以列舉咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)。已知激活味覺受體的物質(zhì)通過促進(jìn)味覺受體細(xì)胞的興奮而顯示出呈味或增強(qiáng)呈味。因此，使用在細(xì)胞膜上表達(dá)咸味受體通道的細(xì)胞，可以篩選激活咸味受體通道或使其失活的物質(zhì)、即咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)。即，激活咸味受體通道的物質(zhì)被期待著通過促進(jìn)原來咸味受體離子通道被表達(dá)的咸味受體細(xì)胞的興奮來增強(qiáng)咸味感受。因此，在鈉離子非存在下激活咸味受體通道的物質(zhì)作為咸味替代物質(zhì)的候選是有效的，而在鈉離子存在下激活咸味受體通道的物質(zhì)作為咸味增強(qiáng)物質(zhì)的候選物質(zhì)是有效的。因此，可以將表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞本身用于篩選咸味替代或咸味增強(qiáng)物質(zhì)。另外，使咸味受體通道失活的物質(zhì)作為咸味抑制物質(zhì)的候選是有效的。表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量，可以通過將細(xì)胞懸浮于包含陽(yáng)離子的溶液中，之后直接或間接地測(cè)定流入細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子的量來測(cè)定。細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量，例如可以通過測(cè)定在細(xì)胞外陽(yáng)離子存在下的上述細(xì)胞的電生理學(xué)性質(zhì)、例如細(xì)胞電流來測(cè)定。例如，在鈉離子的存在下使表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞與受檢物質(zhì)接觸，檢測(cè)細(xì)胞膜電位或膜電流的變化、或細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子濃度，從而可以篩選咸味增強(qiáng)物質(zhì)或咸味抑制物質(zhì)等咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)。另外，通過在鈉離子非存在下使表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞與受檢物質(zhì)接觸，之后檢測(cè)細(xì)胞膜電位或膜電流的變化、或細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子濃度，可以篩選咸味替代物質(zhì)。以下例示使用表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞篩選咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)的具體方法。(1)使編碼Kv3.2蛋白的cRNA在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)，按照雙極電壓鉗法，以咸味受體離子通道電流的增強(qiáng)或減弱為指標(biāo)，檢索與咸味受體離子通道發(fā)生作用的配體。例如，若向膜電位夾鉗在保持電位-60SOmV的細(xì)胞的細(xì)胞外液中添加試驗(yàn)化合物時(shí)與未添加試驗(yàn)化合物時(shí)相比內(nèi)向電流增加，則可以判定上述試驗(yàn)化合物是激活本發(fā)明的多肽的物質(zhì)。另外，使細(xì)胞外鈉離子濃度階段性或連續(xù)地發(fā)生變化，可以測(cè)定內(nèi)向電流。(2)對(duì)于使咸味受體離子通道在細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞，在按照電壓鉗法、特別是全細(xì)胞膜電壓鉗法進(jìn)行了膜電位夾鉗的狀態(tài)下，以咸味受體離子通道電流的增強(qiáng)或減弱為指標(biāo)，檢索與咸味受體離子通道發(fā)生作用的配體。例如，若在鈉離子存在下向膜電位夾鉗在保持電位-SOmV的細(xì)胞的細(xì)胞外液中添加試驗(yàn)化合物時(shí)與未添加試驗(yàn)化合物時(shí)相比內(nèi)向電流增加，則可以判定上述試驗(yàn)化合物為激活本發(fā)明的多肽的物質(zhì)、即咸味增強(qiáng)物質(zhì)。(3)對(duì)于使咸味受體離子通道在細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞，預(yù)先使其攝取膜電位敏感性色素，之后在鈉離子存在下添加試驗(yàn)化合物，通過分析(即測(cè)定或檢測(cè))此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的上述色素的熒光強(qiáng)度的變化，來分析Kv3.2蛋白是否被活化。本方法利用了膜電位敏感性色素可以光學(xué)檢測(cè)離子通道的開放所伴隨的膜電位的變化的性質(zhì)。更具體而言，作為上述膜電位敏感性色素，可以使用DiBAC[雙(1，3_二丁基巴比妥酸)三次甲基氧雜菁，MolecularProbes]或其衍生物、或膜電位測(cè)定試劑盒(MolecularDevices)等。(4)對(duì)于使咸味受體離子通道在細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞，預(yù)先導(dǎo)入陽(yáng)離子敏感性色素(例如，SBFI，CoroNaGreen,SodiumGreen(MolecularProbes等)，之后在鈉離子存在下使配體候選化合物與咸味受體離子通道表達(dá)細(xì)胞接觸一定時(shí)間，以此時(shí)的熒光強(qiáng)度比(細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子濃度)的變化為指標(biāo)，檢索咸味增強(qiáng)或抑制的物質(zhì)。(5)通過在鈉離子非存在下實(shí)施上述(2)⑷所述的方法，可以探索咸味替代物質(zhì)。實(shí)施例以下，參照實(shí)施例來具體說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不限定本發(fā)明的范圍。只要沒有特別說明，則按照公知的方法(Maniatis，T.等人，“MolecularCloning-ALaboratoryManual，，,ColdSpringHarborLaboratory,NY,1982；禾口Hille,B.,IonicChannelsofExcitableMembranes，第二版，SinauerAssociatesInc.,MA,1992)實(shí)施這些實(shí)施例的程序。〔實(shí)施例1〕小鼠Kv3家族通道基因的表達(dá)分析使用小鼠舌上皮組織，通過RT-PCR法，按照以下程序分析編碼具有SEQIDNO=IO所示的氨基酸序列的蛋白的Kv3家族通道基因在舌上皮中的表達(dá)分布。從小鼠的舌上分離上皮，再分別切除包含菌狀乳頭的舌尖部分、包含輪廓乳頭的區(qū)域(舌中央后部)、包含葉狀乳頭的舌兩側(cè)部分、以及不含味蕾的上皮。另外切除腎臟，并粉碎。使用RNA提取試劑盒(AbsolutelyRNAMicroprep試劑盒，Stratagene)，從各組織中提取RNA。使用RT-PCR用SuperScriptIII第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)使提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。以得到的第一鏈cDNA為模板，組合表1所示的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增Κν3.1、Κν3.2、Kv3.3和Kv3.4各蛋白的基因的cDNA。表權(quán)利要求1.咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選方法，該方法包括下述步驟使受檢物質(zhì)與表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞接觸，并將所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量和未使上述受檢物質(zhì)與上述細(xì)胞接觸時(shí)所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量進(jìn)行比較。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過在鈉離子存在下測(cè)定上述細(xì)胞的細(xì)胞膜電流，來測(cè)定上述陽(yáng)離子的流入量。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過在鈉離子非存在下測(cè)定上述細(xì)胞的細(xì)胞膜電流，來測(cè)定上述陽(yáng)離子的流入量。4.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)為咸味增強(qiáng)物質(zhì)或咸味抑制物質(zhì)。5.權(quán)利要求1或3所述的方法，其中，咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)為咸味替代物質(zhì)。6.權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，Kv3.2蛋白具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO16,SEQIDNO18、SEQIDNO40、SEQIDNO47、SEQIDNO49、SEQIDNO:51或SEQIDNO53的氨基酸序列。7.權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，Kv3.2蛋白與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6,SEQIDN0:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDNO:40、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51或SEQIDNO53的序列顯示至少78%以上的序列同一性，并且能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道。8.權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，Kv3.2蛋白具有包含1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加的SEQIDNO2,SEQIDN0:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:40,SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的氨基酸序列，并且能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道。9.權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的方法，其中Kv3.2蛋白由下述(a)或(b)所示的DNA編碼(a)DNA，其具有SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11,SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:39、SEQIDNO:46,SEQIDNO:48、SEQIDNO:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列；(b)DNA，其能夠在嚴(yán)格的條件下和與SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:39,SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列、或可由上述核苷酸序列制備的探針進(jìn)行雜交，并且編碼能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道的蛋白。10.權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，Kv3.2蛋白為選自來自人、小鼠、大鼠、爪蟾屬的蛙、狗、馬、黑猩猩、恒河猴、雞、負(fù)鼠、豬或牛的Kv3.2蛋白同系物，以及它們的突變體、它們的片段和它們的嵌合蛋白。11.權(quán)利要求110中任一項(xiàng)所述的方法，其中，上述細(xì)胞為以可表達(dá)的形態(tài)導(dǎo)入有編碼Kv3.2蛋白的多核苷酸的卵母細(xì)胞。12.權(quán)利要求110中任一項(xiàng)所述的方法，其中，上述細(xì)胞表達(dá)從選自味覺細(xì)胞、舌上皮、腎上腺、松果體、甲狀腺、黑素細(xì)胞和腎臟的組織中分離的Kv3.2基因。13.Kv3.2蛋白變體，該變體為下述(a)(c)中任一項(xiàng)所示的蛋白(a)蛋白，其具有SEQIDNO47,SEQIDNO49、SEQIDNO:51或SEQIDNO:53的序列；(b)蛋白，該蛋白與SEQIDNO47,SEQIDNO:49、SEQIDNO:51或SEQIDNO53的序列顯示至少78%以上的序列同一性，并且能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道；(c)蛋白，其具有包含1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加的SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO51或SEQIDNO53的氨基酸序列，并且能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道。14.DNA,其編碼Kv3.2蛋白變體，該DNA是下述(a)或(b)所示的DNA(a)DNA，其具有SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDN0:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列；(b)DNA，其能夠在嚴(yán)格的條件下和與SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO:50或SEQIDNO:52的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列、或可由上述核苷酸序列制備的探針進(jìn)行雜交，并且編碼能夠構(gòu)成活性隨著細(xì)胞外鈉離子濃度變化而變化的陽(yáng)離子通道的蛋白。15.探索具有正向或負(fù)向調(diào)節(jié)Kv3.2活性的功能的蛋白或構(gòu)成咸味受體的蛋白的方法，該方法包括鑒定在Kv3.2基因表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)的基因中的顯示表達(dá)概況與Kv3.2基因類似的基因、或在Kv3.2基因表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)被抑制的基因。16.探索咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法，該方法包括鑒定與Kv3.2蛋白或表達(dá)該蛋白的細(xì)胞發(fā)生作用的化合物。17.探索呈味物質(zhì)或風(fēng)味物質(zhì)的方法，該方法包括鑒定與由Kv3.2蛋白和在味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的蛋白構(gòu)成的通道或復(fù)合體發(fā)生作用的化合物。18.分離的味覺細(xì)胞，其中以可表達(dá)的形態(tài)導(dǎo)入有編碼Kv3.2蛋白的多核苷酸。全文摘要通過使受檢物質(zhì)與表達(dá)Kv3.2蛋白的細(xì)胞接觸，并將所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量和未使上述受檢物質(zhì)與上述細(xì)胞接觸時(shí)所觀察到的上述細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子流入量進(jìn)行比較，來篩選咸味替代化合物、或者增強(qiáng)或抑制咸味感受的化合物等咸味調(diào)節(jié)物質(zhì)。文檔編號(hào)C12N15/09GK102575279SQ20108004501公開日2012年7月11日申請(qǐng)日期2010年9月29日優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日發(fā)明者前川譽(yù)實(shí),開裕子,江藤讓,石渡裕申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社