專利名稱：唐氏綜合癥產(chǎn)前診斷方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)前診斷唐氏綜合癥的方法，特別是一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的唐氏綜合癥產(chǎn)前診斷方法，還涉及一種用于本發(fā)明診斷方法的試劑盒。
唐氏綜合癥(Down’s syndrome)，又稱先天愚型，或21三體，是最常見的染色體病之一。也是造成先天智力低下的主要原因。其臨床特征為嚴(yán)重智力低下，獨(dú)特的面部和身體畸形(如寬眼距，低鼻梁，肌無力，肢體短小，及貫通手等)，先天性心臟病，消化道畸形等，白血病的發(fā)病率比一般人要高得多。
該病的發(fā)病機(jī)制是生殖細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)不分離。而絕大多數(shù)病例是由卵細(xì)胞第一次(75％)或第二次(15％)減數(shù)分裂不分離所致；發(fā)生于精子細(xì)胞的只占少數(shù)(10％)。所以該病的發(fā)病率與母親年齡有關(guān)，母齡越大，發(fā)病率也越高。例如，母齡為25歲者，發(fā)病率為1/1200；35歲者，發(fā)病率為1/300，而45歲者發(fā)病率可高達(dá)1/50。群體中的平均發(fā)病率為1/700～1/800。與一般的基因病(如常染色體顯/隱性遺傳，或性常染色體顯/隱性遺傳)不同，唐氏綜合癥這類染色體病是偶發(fā)的，每個(gè)孕婦都有一定的危險(xiǎn)性，而且一般沒有種族或家族積聚的現(xiàn)象。
常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法診斷通常需要取胎兒組織(羊水或絨毛)，經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)兩周的細(xì)胞培養(yǎng)，再經(jīng)過繁復(fù)的染色體制片，顯帶，拍照，剪排核型等工續(xù)才能等到細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果。常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法不僅周期長(zhǎng)、操作繁雜，而且效率不高。
曾報(bào)道過用PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來查染色體異常的方法。例如，von Eggeling F等，(Human Genetics.91(6):567-70,1993 Jul.)；Celi FS.等，(Genomics.21(2):304-10,1994 May 15.)；Lee HH．等，(HumanGenetics.99(3):364-7,1997 Mar.)分別報(bào)道了利用天然(基因組中現(xiàn)有的DNA)或人工(利用生物技術(shù)加工出的)擴(kuò)增對(duì)照物的手段定量推測(cè)染色體數(shù)目的試驗(yàn)方法。Adinolfi M．等(Bioessays.17(7):661-4,1995 Jul.)，也對(duì)用PCR擴(kuò)增多態(tài)重復(fù)序列的方法診斷唐氏綜合癥進(jìn)行了報(bào)道。但受限于下述因素上述有關(guān)技術(shù)沒能轉(zhuǎn)化為成型產(chǎn)品用對(duì)照或內(nèi)部參考的定量PCR方法要靠PCR產(chǎn)物的大小來區(qū)分PCR擴(kuò)增出的野生型與對(duì)照物。因?yàn)镻CR產(chǎn)物大小不同，即便使用同樣引物，擴(kuò)增出的產(chǎn)物量也會(huì)差別很大，因此可能導(dǎo)致定量誤差而誤診染色體三體綜合癥。另外，多數(shù)報(bào)道所使用的儀器設(shè)備都較昂貴(如用毛細(xì)管電泳儀，或全自動(dòng)DNA測(cè)序儀等價(jià)值十幾萬美元的設(shè)備)，或應(yīng)用了放射同位素等有害試劑。
如上所述，現(xiàn)有的分子遺傳學(xué)方法由于PCR雜交等操作中存在許多影響擴(kuò)增產(chǎn)物量的因素以及需要昂貴的儀器而不令人滿意。本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單而又結(jié)果準(zhǔn)確的唐氏綜合癥產(chǎn)前診斷方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于唐氏綜合癥產(chǎn)前診斷的試劑盒。
概括地講，本發(fā)明涉及一種唐氏綜合癥的產(chǎn)前診斷方法，包括(a)從含有胎細(xì)胞的取自孕婦的樣品中分離胎細(xì)胞；(b)從所述胎細(xì)胞提取DNA；(c)用三對(duì)或三對(duì)以上PCR引物從上述DNA同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體上三個(gè)或三個(gè)以上的多態(tài)位點(diǎn)；(d)電泳分離PCR產(chǎn)物并顯色，觀察至少一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物三帶型的存在與否。
上述方法的(a)步中所述樣品選自血液、尿液、組織樣品和羊水，優(yōu)選為羊水。
上述方法的(c)步中，每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的雜合率大于70％，優(yōu)選大于80％，例如大于83％。
本發(fā)明還涉及用于上述診斷方法的試劑盒，其中包括用于擴(kuò)增21號(hào)染色體上三個(gè)或三個(gè)以上多態(tài)位點(diǎn)的三對(duì)或更多引物和用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑。
本發(fā)明采用分子遺傳學(xué)的方法診斷唐氏綜合癥，其診斷手段是用PCR方法擴(kuò)增位于21號(hào)染色體上的多態(tài)性位點(diǎn)。所謂多態(tài)性是指群體中這個(gè)位點(diǎn)上有許多等位基因。正常人的21號(hào)染色體只有父源和母源兩條，因此每個(gè)位點(diǎn)上只應(yīng)有兩個(gè)等位基因。患唐氏綜合癥時(shí)，多出的一條21號(hào)染色體使患者在每個(gè)位點(diǎn)上有三個(gè)等位基因，也就有三個(gè)分子量不同的PCR產(chǎn)物。我們用來診斷的DNA標(biāo)記是分布在21號(hào)染色體上不同區(qū)域的三個(gè)或更多多態(tài)位點(diǎn)，綜合分析這些位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物可以定性地為97％的病人作出診斷，甚至達(dá)到99.5％以上。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，利用三對(duì)引物擴(kuò)增21號(hào)染色體上三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)的雜合率大于83％。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中等位基因表現(xiàn)為四聚核苷酸重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)不同的DNA片段，它們之間分子量大小的差別足以用凝膠電泳法加以區(qū)分。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物大小，使得可以擴(kuò)增出三組在凝膠電泳上可區(qū)分的PCR產(chǎn)物。即每組中的多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳膠上的遷移位置互鄰，中間沒有被別組的擴(kuò)增產(chǎn)物帶所分隔。優(yōu)選組間擴(kuò)增產(chǎn)物大小相差至少20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少40個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，三對(duì)PCR產(chǎn)物為1號(hào)和2號(hào)序列；3號(hào)和4號(hào)序列；以及5號(hào)和6號(hào)序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法中還包括一個(gè)對(duì)照位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增。優(yōu)選該位點(diǎn)為純合位點(diǎn)。在一具體實(shí)施方案中，該對(duì)照位點(diǎn)為用序列號(hào)7和8引物對(duì)所擴(kuò)增的10號(hào)染色體上的位點(diǎn)。該對(duì)照用作擴(kuò)增反應(yīng)的對(duì)照(AC)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法中還包括一個(gè)檢測(cè)對(duì)照，例如由9,10號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增出的X染色體基因組DNA片段，用作電泳及染色反應(yīng)的對(duì)照。
在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，所用引物對(duì)是被標(biāo)記的，例如用熒光團(tuán)標(biāo)記或用生物素標(biāo)記等。
唐氏綜合癥的發(fā)病機(jī)制是生殖細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)染色體不分離。有85％以上的病例為第一次減數(shù)分裂時(shí)同源染色體不分離，其余15％的病例為第二次減數(shù)分裂時(shí)姐妹染色單體不分離所致。
第一次減數(shù)分裂不分離造成同源的兩條21號(hào)染色體停留在同一個(gè)生殖細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)正常的第二次減數(shù)分裂以后，每個(gè)生殖細(xì)胞內(nèi)有兩條21號(hào)姐妹單體。這種不正常的卵細(xì)胞受精后，加上一條父源的21號(hào)染色體，就變成21三體。因?yàn)橥吹膬蓷l21號(hào)染色體(其中一條來至她的父親，另一條來至她的母親)及來至精子的一條染色體遺傳來源不同，雖然在細(xì)胞水平上三者很難區(qū)分，在分子水平上完全可以靠多態(tài)DNA標(biāo)記加以鑒別。所謂多態(tài)性是指群體中每個(gè)基因位點(diǎn)上都有多個(gè)等位基因，如A位點(diǎn)上可以有A1,A2,A3,……等多個(gè)等位基因。而就群體中某個(gè)正常個(gè)體而言，因?yàn)樗?她)只有兩條同源染色體，所以在某一位點(diǎn)上只可能有兩個(gè)等位基因。這兩個(gè)等位基因的遺傳物質(zhì)完全相同時(shí)為純合體(Homozygous)，不同時(shí)為雜合體(Heterozygous)。本發(fā)明依賴檢測(cè)高度多態(tài)(高雜合率)的四聚核苷酸重復(fù)序列的方法區(qū)別唐氏綜合癥時(shí)的三條21號(hào)染色體。具體方法是通過PCR擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)。一對(duì)PCR引物擴(kuò)增一個(gè)位點(diǎn)，該位點(diǎn)上的數(shù)個(gè)等位基因則表現(xiàn)為四聚核苷酸重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)不同的DNA片段，因?yàn)榉肿恿看笮〉牟煌梢杂媚z電泳法加以區(qū)分。我們所選的21號(hào)染色體上的位點(diǎn)雜合率都在83％以上，純合率為17％。所以，就任何一個(gè)位點(diǎn)而言，有83％的正常人因?yàn)槭请s合體而經(jīng)PCR電泳后可見到兩條帶紋。唐氏綜合癥時(shí)則有三種等位基因組合的可能(1)三條21號(hào)染色體上的等位基因都不相同，為純雜合體。一對(duì)針對(duì)特定位點(diǎn)的PCR引物可以擴(kuò)增出三個(gè)不同分子量的產(chǎn)物，電泳顯示三條帶。(2)三個(gè)等位基因中有兩個(gè)相同，一個(gè)不同，為半雜合。一對(duì)PCR引物可以擴(kuò)增出兩個(gè)不同分子量的產(chǎn)物，電泳顯示兩條帶。(3)三個(gè)等位基因完全相同，為純合體。一對(duì)PCR引物只能擴(kuò)增出一種產(chǎn)物，電泳顯示一條帶。就一個(gè)位點(diǎn)而言，出現(xiàn)三條帶的幾率是68％(83％×83％)，這種情況下唐氏綜合癥可以得到定性診斷；唐氏病人出現(xiàn)兩條帶的幾率是28％(83％×17％×2)，因?yàn)閮煞NPCR產(chǎn)物的量有明顯不同(為2∶1，正常人的兩個(gè)等位基因PCR產(chǎn)物量相同，為1∶1)可以用定量的方法協(xié)助診斷；病人只出現(xiàn)一條帶的幾率是3％(17％×17％)，不能診斷。
本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)就是用增加檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)目的方法提高定性診斷能力。如果綜合分析三個(gè)位點(diǎn)PCR結(jié)果的話，則有97％的病例因?yàn)橹辽儆幸粋€(gè)位點(diǎn)為純雜合體(電泳三條帶)而得到定性診斷。
第二次減數(shù)分裂不分離也能引起唐氏綜合癥。因?yàn)椴环蛛x的是姐妹染色單體，所以如果在減數(shù)分裂以前沒有發(fā)生同源染色體互換的話，就不可能有雜合體存在，也就無法做定性診斷了。本發(fā)明例舉了三個(gè)位點(diǎn)1號(hào)位點(diǎn)GATA49E01；2號(hào)位點(diǎn)GATA8G04；3號(hào)位點(diǎn)GATA70B08。三個(gè)位點(diǎn)分別位于21號(hào)染色體距著絲點(diǎn)45,55,80毫摩(CM)的地方。也就是說三個(gè)位點(diǎn)分別有45％、55％,80％的重組率，加上唐氏綜合癥時(shí)染色體重組率提高至少30％，所以三位點(diǎn)呈純雜合體的可能性分別是40.3％,49.3％，及71.65％。綜合分析三個(gè)位點(diǎn)PCR結(jié)果，則有91.4％的病例因?yàn)橹辽儆幸粋€(gè)位點(diǎn)為純雜合體(電泳三條帶)而得到定性診斷。


圖1表示本發(fā)明一具體實(shí)例中PCR反應(yīng)后電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物并顯色后的結(jié)果照片。
1號(hào)和2號(hào)序列是一對(duì)PCR引物，用來擴(kuò)增位于21號(hào)染色體上基因組DNA的一個(gè)多態(tài)重復(fù)序列。擴(kuò)增產(chǎn)物大小在124-152個(gè)堿基對(duì)之間。
3號(hào)和4號(hào)序列是一對(duì)PCR引物，用來擴(kuò)增位于21號(hào)染色體上基因組DNA的一個(gè)多態(tài)重復(fù)序列。擴(kuò)增產(chǎn)物大小在162-186個(gè)堿基對(duì)之間。
5號(hào)和6號(hào)序列是一對(duì)PCR引物，用來擴(kuò)增位于21號(hào)染色體上基因組DNA的一個(gè)多態(tài)重復(fù)序列。擴(kuò)增產(chǎn)物大小在209-227個(gè)堿基對(duì)之間。
7號(hào)和8號(hào)序列是一對(duì)PCR引物，用來擴(kuò)增位于10號(hào)染色體上基因組DNA的一段保守序列。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為158個(gè)堿基對(duì)。
9號(hào)和10號(hào)序列是一對(duì)PCR引物，用來擴(kuò)增位于X號(hào)染色體上基因組DNA的一段保守序列。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為236個(gè)堿基對(duì)。
下述具體實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。
本實(shí)例中使用了下列試劑1．DNA提取液(為美國(guó)Gull Laboratory公司產(chǎn)品)，DNA溶解液(1.5ml蒸餾水)。
2．PCR試劑引物(由美國(guó)Research Genetics公司合成)含有四對(duì)引物可以擴(kuò)增21號(hào)染色體上的1,2,3號(hào)位點(diǎn)及10號(hào)染色體上的一個(gè)對(duì)照位點(diǎn)(序列見序列表)，dNTPs(從Boringer Manham公司購(gòu)買)，Taq耐熱DNA多聚酶(Perkin Elmer),10x PCR緩沖液(Genaco)，礦物油(Sigma)。
3．電泳試劑TBE(Tris-硼酸-EDTA)緩沖液，40％聚丙烯酰胺(Fisher)，尿素(Fisher),TEMED(Sigma)，過硫酸銨(Sigma)，點(diǎn)樣緩沖液。
4．顯色試劑鏈親和素AP偶聯(lián)物(Schleicher & Schuell)，封閉緩沖液(Schleicher & Schuell)，清洗液(1.5M NaCl),20％SDS，顯色底物藥片(Schleicher & Schuell)。
Ⅰ．提取胎兒DNA(1)．加30ml雙蒸水將DNA提取液稀釋成1倍制劑備用。用常規(guī)腹壁穿刺的方法取羊水5-10毫升。通過肉眼觀察的方法以粗略估計(jì)羊水中細(xì)胞的密度，并分成四級(jí)+，細(xì)胞極少，羊水幾乎透明；++，細(xì)胞量中等，羊水稍有混濁；+++，細(xì)胞多，羊水混濁；++++，細(xì)胞極多，羊水很混濁。給羊水細(xì)胞含量分級(jí)的目的是為了使以后PCR用的DNA模板量規(guī)范化，病人與病人之間的差異盡可能減小(參見以下有關(guān)準(zhǔn)備PCR反應(yīng)一節(jié))。
(2)．取2ml羊水放入容量為2毫升的微離心管內(nèi)，離心(10,000到14,000轉(zhuǎn)/分鐘)20秒鐘。倒掉上清液，加入0.7ml DNA提取液，蓋緊試管，用振蕩器懸浮沉淀的細(xì)胞顆粒。將余下的羊水放置4℃冰箱保存以防萬一需要重復(fù)檢測(cè)。
(3)．將試管放入微波爐的中央，微波(775瓦)加熱10秒鐘。每次加熱不超過8管。加熱后DNA提取液會(huì)由清澈透明變成霧樣混濁，試管也會(huì)非常熱。
(4)．輕輕晃動(dòng)試管以混勻內(nèi)容物，但不要將液體搖晃到試管蓋子里面去。如果蓋子里面有液體，請(qǐng)略加離心。
(5)．再將試管放入微波爐中加熱3秒鐘(2325瓦-秒)。DNA提取液又會(huì)變混濁。注意如果提取液不變混濁，離心管的管壁也不熱的話，說明加熱不夠，很可能導(dǎo)致DNA提取失敗并造成假陰性。
(6)．將加熱過的離心管放置室溫冷卻3分鐘(或放置冰上1分鐘)。冷卻有助于分離不必要的蛋白質(zhì)。
(7)．離心1分鐘，以將變性的蛋白質(zhì)沉淀。
(8)．移取500μl上清液放入一個(gè)新的1.5ml微離心管內(nèi)，盡量不去擾動(dòng)蛋白質(zhì)沉淀顆粒。移液時(shí)一定注意每個(gè)病人標(biāo)本更換一次槍頭。如果蛋白質(zhì)沉淀顆粒被攪動(dòng)，重新離心1分鐘。
(9)．在放有上清液的微離心管內(nèi)加入分子生物學(xué)純度的異丙醇500微升。將微離心管顛倒十?dāng)?shù)次以混合內(nèi)含物。
(10)．將微離心管放入離心機(jī)內(nèi)，離心1分鐘。如果微離心管的管頸都是統(tǒng)一朝上的話，沉淀顆粒將會(huì)在試管的同一方向。離心以后有可能觀察到一個(gè)很小的DNA沉淀顆粒。
(11)．小心倒掉上清液，加入1ml 70％的酒精并用振蕩器清洗沉淀顆粒。
(12)．再次將樣品離心1分鐘。在不擾動(dòng)沉淀顆粒的前提下吸去上清液(或?qū)⑸锨逡旱沟?。將微離心管倒置涼干約5分鐘。
(13)．根據(jù)第一步時(shí)為羊水細(xì)胞密度進(jìn)行的估計(jì)，每個(gè)病人加不同量的DNA溶解液+者加10微升；++加20微升；+++，30微升；++++，加40微升。
(14)．如標(biāo)本不馬上使用的話，放置-20冰箱內(nèi)保存。
Ⅱ．建立PCR反應(yīng)PCR試劑1中含有4對(duì)PCR引物，其中三對(duì)可以擴(kuò)增21號(hào)染色體上的三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，分別為序列1∶2；序列3∶4及序列5∶6；另一對(duì)則擴(kuò)增10號(hào)染色體上的一個(gè)非多態(tài)性位點(diǎn)(用來做PCR正對(duì)照)，即序列7∶8。
(1)．首先在PCR用的小離心管上標(biāo)記好病人編號(hào)。每個(gè)病人要準(zhǔn)備一個(gè)小離心管。按照編號(hào)在每個(gè)病人的兩管中分別加入2μl從羊水中提取出的DNA。注意每添加一個(gè)病人的標(biāo)本要更換一次移液槍頭。
(2)．根據(jù)病人數(shù)量按比例制成PCR反應(yīng)混合液。例如，一次試驗(yàn)要給八個(gè)病人做檢測(cè)則按如下配方引物混合液(每個(gè)引物含25ng)130μldNTPs 32μlTaq酶 2μl10倍緩沖液 20μl總計(jì) 184μl反應(yīng)混合液配制好以后在每個(gè)已經(jīng)加好DNA模板的小離心管內(nèi)加入23μl反應(yīng)混合液，PCR反應(yīng)的最終體積為25μl。
(3)．每管加入一滴礦物油。離心一分鐘。按如下條件編排PCR擴(kuò)增程序先做95℃,3分鐘一個(gè)周期；然后，94℃,1分鐘；61℃,2分鐘；72℃,3分鐘。擴(kuò)增6個(gè)周期以后換條件為94℃,45秒鐘；61℃,45秒鐘；72℃,45秒鐘。在這個(gè)新條件下擴(kuò)增24個(gè)周期后，再加一個(gè)72℃7分鐘的周期。反應(yīng)停止后標(biāo)本放室溫保存。
Ⅲ．電泳分離PCR產(chǎn)物(1)．配制10倍的TBE緩沖液。
(2)．配制6％聚丙烯酰胺變性膠液。
(3)．按照廠家說明安裝玻璃板，制備凝膠。
(4)配制0.6倍TBE電泳緩沖液。將膠預(yù)跑一小時(shí)使玻璃板的溫度達(dá)到大約50-55℃。電壓強(qiáng)度大約在500伏左右，不同品牌的電泳儀條件可能不同。
(5)．在每份25℃的PCR產(chǎn)物中加入17μl的點(diǎn)樣緩沖液(點(diǎn)樣緩沖液中含有用第9,10號(hào)引物擴(kuò)增出的一個(gè)大小為236個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物。放在點(diǎn)樣緩沖液中的目的是做電泳及下一步顯色反應(yīng)的正對(duì)照)。振蕩混均后加熱94-100℃五分鐘(可以在PCR儀中進(jìn)行加熱變性)。
(6)．用注射器徹底清洗點(diǎn)樣井孔底部尿素，將加熱變性將后的標(biāo)本點(diǎn)在每個(gè)井孔中，在500伏下電泳大約35分左右，等到大分子量的染料(跑得慢的淺綠色帶)剛剛跑出膠底后停止電泳。
(7)．轉(zhuǎn)膜。將夾著凝膠的玻璃板分開。凝膠通常與其中一塊玻璃板結(jié)合在一起(為了讓膠每次都跟著特定的一塊玻璃走，應(yīng)該在另一塊玻璃上涂一層silicon)。將尼龍膜用去離子水浸5分鐘，把潮濕的尼龍膜齊膠底放在凝膠上(因?yàn)樗邢嚓P(guān)產(chǎn)物都已跑到膠的下半部，只有一半需要轉(zhuǎn)膜，上半部用保鮮膜搭膠邊蓋住，以保證轉(zhuǎn)膜成功)。在尼龍膜上放兩張轉(zhuǎn)膜濾紙，放回拆開來的那層玻璃，顛倒兩塊玻璃使凝膠內(nèi)的DNA能借重力及虹吸效應(yīng)轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。加一重物在玻璃板上以加快轉(zhuǎn)膜過程。轉(zhuǎn)膜過程需要至少4小時(shí)。
Ⅳ．顯色反應(yīng)(1)．取4.5μl的鏈霉親和素-AP偶聯(lián)物稀釋到7.5ml 1倍的封閉緩沖液中。
(2)．將帶有DNA的尼龍膜放入一個(gè)塑料口袋中，加入上述7.5ml顯色試劑混合液。將塑料袋加熱封閉。室溫下?lián)u動(dòng)反應(yīng)一小時(shí)。
(3)．配制清洗液，把尼龍膜放入50ml含1％SDS的清洗液中搖動(dòng)清洗5分鐘。重復(fù)清洗一次。
(4)．用50ml不含SDS的清洗液清洗5分鐘。
(5)．將底物藥片溶解在30ml蒸餾水中。再將洗干凈的尼龍膜放入一個(gè)塑料口袋中，加入15ml底物(另外15m放存到下次用)，加熱封口。天藍(lán)色的帶紋在20分鐘到2小時(shí)內(nèi)開始顯示。
Ⅴ．結(jié)果分析圖1為分子生物學(xué)診斷結(jié)果。DC由第9,10號(hào)引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物用來做電泳及顯色反應(yīng)對(duì)照；1號(hào)位點(diǎn)顯帶區(qū)2號(hào)位點(diǎn)顯帶區(qū)；AC擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)照；3號(hào)位點(diǎn)顯帶區(qū)。如圖所示，分析時(shí)應(yīng)首先觀察DC，AC兩個(gè)對(duì)照位點(diǎn)。每個(gè)標(biāo)本都應(yīng)在DC位點(diǎn)看到產(chǎn)物，說明電泳，轉(zhuǎn)膜，顯色等程序沒有問題。每個(gè)標(biāo)本也都應(yīng)該在AC位點(diǎn)看到一條大小衡定的產(chǎn)物，說明DNA提取，PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑等都沒有問題。然后依次觀察三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。正常人雜合體時(shí)每個(gè)位點(diǎn)有兩個(gè)等位基因，表現(xiàn)為強(qiáng)度相等的兩條帶紋。也有17％純合的可能性，電泳顯示一條帶。唐氏綜合癥病人如果在某位點(diǎn)(如圖中的2號(hào)位點(diǎn))為純雜合體，就有三個(gè)不相同的等位基因，則電泳后可見到強(qiáng)度相等的三條帶紋。如位點(diǎn)為半雜合體，則三個(gè)等位基因有兩個(gè)相同，電泳后可見強(qiáng)度為2∶1的兩條帶紋(如圖中的1,3號(hào)位點(diǎn))。如前所述，根據(jù)發(fā)病機(jī)制的不同，綜合觀察三個(gè)位點(diǎn)的PCR結(jié)果，可以分別為97％(第一次減數(shù)分裂不分離)或91.4％(第二次減數(shù)分裂不分離)做定性診斷。實(shí)際上，如果加上半雜合時(shí)的定量診斷(靠2∶1的帶紋強(qiáng)度)，則在兩種機(jī)制下診斷率都可達(dá)到99％以上。序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人韓健(ⅱ)發(fā)明題目唐氏綜合癥產(chǎn)前診斷方法和試劑盒(ⅲ)序列數(shù)目8(ⅳ)聯(lián)系人地址(A)聯(lián)系人王冰女士(B)街號(hào)海淀區(qū)正福寺四號(hào)(C)城市北京市(D)國(guó)家中華人民共和國(guó)(E)郵編100081(ⅴ)電腦可讀文件(A)儲(chǔ)存媒介3.5英寸磁盤(B)電腦IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)Microsoft Windows(D)應(yīng)用軟件Microsoft Word 6.0(2)有關(guān)1號(hào)序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)核苷酸(B)種類脫氧核糖核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(ⅱ)分子種類DNA(ⅲ)假設(shè)性非(ⅳ)反義鏈非(?、?特殊加工生物素5′端標(biāo)記(ⅹⅰ)序列描述1號(hào)序列CATTCCCCTC TCAATTGTTT GTCTACC(2)有關(guān)2號(hào)序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)核苷酸(B)種類脫氧核糖核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(ⅱ)分子種類DNA(ⅲ)假設(shè)性非(ⅳ)反義鏈有(?、?特殊加工無(ⅹⅰ)序列描述2號(hào)序列CGTATATTAT TGAGTCCTGT GAAATG(2)有關(guān)3號(hào)序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)核苷酸(B)種類脫氧核糖核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(ⅱ)分子種類DNA(ⅲ)假設(shè)性非(ⅳ)反義鏈非(?、?特殊加工生物素5′端標(biāo)記(ⅹⅰ)序列描述3號(hào)序列TTCAGGGCTA CATAGAGAAA CAGAACC(2)有關(guān)4號(hào)序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)核苷酸(B)種類脫氧核糖核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(ⅱ)分子種類DNA(ⅲ)假設(shè)性非(ⅳ)反義鏈有(?、?特殊加工無(ⅹⅰ)序列描述4號(hào)序列ACACACACAC ACACACATGG(2)有關(guān)5號(hào)序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)核苷酸(B)種類脫氧核糖核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(ⅱ)分子種類DNA(ⅲ)假設(shè)性非(ⅳ)反義鏈非(?、?特殊加工生物素5′端標(biāo)記(ⅹⅰ)序列描述5號(hào)序列TATGTACGAT ACGTAATACT TGACAA(2)有關(guān)6號(hào)序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)核苷酸(B)種類脫氧核糖核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(ⅱ)分子種類DNA(ⅲ)假設(shè)性非(ⅳ)反義鏈有(?、?特殊加工無(ⅹⅰ)序列描述6號(hào)序列AATATGTCCC AAAGGACCTG CTC(2)有關(guān)7號(hào)序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)核苷酸(B)種類脫氧核糖核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(ⅱ)分子種類DNA(ⅲ)假設(shè)性非(ⅳ)反義鏈非(ⅰⅳ)特殊加工生物素5′端標(biāo)記(ⅹⅰ)序列描述7號(hào)序列GAGTTTATTG GTACAGGTGC AG(2)有關(guān)8號(hào)序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)核苷酸(B)種類脫氧核糖核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(ⅱ)分子種類DNA(ⅲ)假設(shè)性非(ⅳ)反義鏈有(?、?特殊加工無(ⅹⅰ)序列描述8號(hào)序列ATGGACAGTA GCCTATATGC C(2)有關(guān)9號(hào)序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)核苷酸(B)種類脫氧核糖核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(ⅱ)分子種類DNA(ⅲ)假設(shè)性非(ⅳ)反義鏈非(?、?特殊加工生物素5′端標(biāo)記(ⅹⅰ)序列描述9號(hào)序列TGTATGCCTT GGCAATTTAA(2)有關(guān)10號(hào)序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)核苷酸(B)種類脫氧核糖核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(ⅱ)分子種類DNA(ⅲ)假設(shè)性非(ⅳ)反義鏈有(?、?特殊加工無(ⅹⅰ)序列描述10號(hào)序列CATGTTTCAC AGGAAAGTTC
權(quán)利要求
1．一種唐氏綜合癥的產(chǎn)前診斷方法，包括(a)從含有胎細(xì)胞的取自孕婦的樣品中分離胎細(xì)胞；(b)從所述胎細(xì)胞提取DNA；(c)用三對(duì)或三對(duì)以上PCR引物從上述DNA同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體上三個(gè)或三個(gè)以上的多態(tài)位點(diǎn)；(d)電泳分離PCR產(chǎn)物并顯色，觀察至少一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物三帶型的存在與否。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品選自血液、尿液、組織樣品和羊水。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述樣品為羊水。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的雜合率大于70％。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的雜合率大于80％。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中使用三對(duì)PCR引物擴(kuò)增三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中三對(duì)引物如下CATTCCCCTC TCAATTGTTT GTCTACCCGTATATTAT TGAGTCCTGT GAAATG；TTCAGGGCTA CATAGAGAAA CAGAACCACACACACAC ACACACATGC；和TATGTACGAT ACGTAATACT TGACAAAATATGTCCC AAAGGACCTG CTC。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的方法，其中在(c)步還包括PCR擴(kuò)增一個(gè)純合的擴(kuò)增對(duì)照位點(diǎn)。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中用于擴(kuò)增對(duì)照位點(diǎn)的PCR引物對(duì)為GAGTTTATTG GTACAGGTGC AGATGGACAGTA GCCTATATGC C。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的方法，其中在(c)步還包括PCR擴(kuò)增一個(gè)檢測(cè)對(duì)照位點(diǎn)。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中用于檢測(cè)對(duì)照位點(diǎn)的PCR引物對(duì)為TGTATGCCTT GGCAATTTAACATGTTTCAC AGGAAAGTTC。
12．一種用于唐氏綜合癥產(chǎn)前診斷的試劑盒，其中包括用于擴(kuò)增21號(hào)染色體上至少三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的至少三對(duì)引物和用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其中每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的雜合率大于70％。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其中每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的雜合率大于80％。
15．根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的試劑盒，其中使用三對(duì)PCR引物擴(kuò)增三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的試劑盒，其中對(duì)引物如下CATTCCCCTC TCAATTGTTT GTCTACCCGTATATTAT TGAGTCCTGT GAAATG；TTCAGGGCTA CATAGAGAAA CAGAACCACACACACAC ACACACATGC；和TATGTACGAT ACGTAATACT TGACAAAATATGTCCC AAAGGACCTG CTC。
17．根據(jù)權(quán)利要求12-14之一的試劑盒，其中還包括用于PCR擴(kuò)增一個(gè)純合的擴(kuò)增對(duì)照位點(diǎn)的引物對(duì)。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，其中用于擴(kuò)增對(duì)照位點(diǎn)的PCR引物對(duì)為GAGTTTATTG GTACAGGTGC AGATGGACAGTA GCCTATATGC C。
19．根據(jù)權(quán)利要求12-14之一的試劑盒，其中還包括PCR擴(kuò)增一個(gè)檢測(cè)對(duì)照位點(diǎn)的引物。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的試劑盒，其中用于檢測(cè)對(duì)照位點(diǎn)的PCR引物對(duì)為TGTATGCCTT GGCAATTTAACATGTTTCAC AGGAAAGTTC。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種唐氏綜合癥的產(chǎn)前診斷方法,其中包括PCR擴(kuò)增21號(hào)染色體上至少三個(gè)位點(diǎn)并觀察這些位點(diǎn)的多態(tài)性。還公開了用于上述方法的試劑盒,其中包括用于PCR擴(kuò)增的特異性引物。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1215165SQ9812094
公開日1999年4月28日 申請(qǐng)日期1998年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月12日
發(fā)明者韓健 申請(qǐng)人:韓健