癌胚抗原特異性tcr基因修飾的t細胞及其抑癌用圖
【專利摘要】一種癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞及其抑癌用途，包括轉(zhuǎn)錄因子T?bet、Eomes及CEA?TCR的慢病毒載體。本發(fā)明的癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞及其抑癌用途通過蹄選和克隆腫瘤特異性TCR基因,隨后以之轉(zhuǎn)染T細胞賦予其抗原特異性,從而獲得基因工程化抗原特異性T細胞,最終將TCR基因轉(zhuǎn)染T細胞回輸患者體內(nèi),重建針對抗原陽性腫瘤的T細胞免疫反應(yīng)。
【專利說明】
癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞及其抑癌用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及基因修飾細胞及腫瘤治療技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞及其抑癌用途。
【背景技術(shù)】
[0002]過繼細胞治療(adoptive cell therapy，ACT)是生物治療技術(shù)的一種，對自體免疫細胞(主要是T細胞)進行體外擴增，然后將其回輸給腫瘤患者以達到治療目的的方法，被認為是繼手術(shù)、放、化療后的第4種治療方式，在臨床治療中受到廣泛應(yīng)用。過繼細胞治療廣泛應(yīng)用的主要是:淋巴因子活化的殺傷細胞(lymphokine activated“l(fā)ler cell ,LAK)，與幾一 2聯(lián)合治療晚期惡性腫瘤取得了一定療效:腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltratinglymph0CyteS，TIL)，臨床試驗中治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤取得了較好的效果:細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine induced killer cell，CIK)，目前國內(nèi)開展較多的臨床試驗，對肝癌、肺癌等腫瘤取得了顯著的效果。但是目前上述三種治療方法均需活化T細胞，T細胞活化需要兩種活化信號，即T細胞表面的TCR-CD3與MHC-1分子結(jié)合為活化的第一信號，決定“田胞對腫瘤細胞的殺傷活性”田胞表面的共刺激分子與相應(yīng)配體結(jié)合為活化的第二信號，決定T細胞增殖。但腫瘤細胞、腫瘤微環(huán)境可下調(diào)MHC、配體分子，從而抑制T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。因此需要可對其進行基因改造。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:為了解決上述【背景技術(shù)】中存在的問題，提供一種改進的癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞及其抑癌用途，解決腫瘤細胞、腫瘤微環(huán)境可下調(diào)MHC、配體分子，從而抑制T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性的問題。
[0004]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞，包括轉(zhuǎn)錄因子T-bet、E0meS及CEA-TCR的慢病毒載體，所述的CEA-TCR包含TCRa鏈及TCRi3鏈，所述的CEA-TCR TCRa鏈序列為第一序列，所述的CEA-TCR TCRi3鏈序列為第二序列，所述的轉(zhuǎn)錄因子T-bet的序列為第三序列，所述的轉(zhuǎn)錄因子Eomes的序列為第四序列。
[0005]癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞的抑癌用途，所述以穩(wěn)定表達螢火蟲熒光蛋白Iuciferase的CEA陽性結(jié)直腸細胞系W480，HT29作為靶細胞，以穩(wěn)定表達熒光素酶的CEA陰性的肝癌細胞系HuH7作為對照，效應(yīng)細胞為慢病毒載體Iv-EFla-TCR-WPRE感染的T細胞，將靶細胞按照密度IXlO5個/ml接種96孔板中，每孔10ul，按照1:1效靶比將效應(yīng)細胞加入靶細胞，置于5%C02，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，利用熒光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒(E4550)檢測孔板中剩余細胞內(nèi)Luciferase含量，計算殺傷效率，結(jié)果表明，表達CEA-TCR的T淋巴細胞對CEA陽性腫瘤細胞具有殺傷作用，而對CEA陰性細胞無殺傷作用；以穩(wěn)定表達螢火蟲熒光蛋白Iuciferase的CEA陽性結(jié)直腸細胞系W480，HT29作為靶細胞，分別用慢病毒載體Iv-EFla-TCR-WPRE和lv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE感染的T細胞制得效應(yīng)細胞，將靶細胞按照密度2.5X 15個/ml，5X105個/ml，1X 15個/ml的密度接種96孔板中，每孔10ul，按照10:1,5:1,2.5:1效靶比將效應(yīng)細胞加入靶細胞，置于5 % CO2，37 V培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h;利用熒光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒(E4550)檢測孔板中剩余細胞內(nèi)Luciferase含量，計算殺傷效率，結(jié)果表明，表達轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴細胞較未表達轉(zhuǎn)錄因子T_bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴細胞對CEA陽性腫瘤細胞具有更強殺傷作用。
[0006]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明的癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞及其抑癌用途通過蹄選和克隆腫瘤特異性TCR基因，隨后以之轉(zhuǎn)染T細胞賦予其抗原特異性，從而獲得基因工程化抗原特異性T細胞，最終將TCR基因轉(zhuǎn)染T細胞回輸患者體內(nèi)，重建針對抗原陽性腫瘤的T細胞免疫反應(yīng)。
【附圖說明】
[0007]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0008]圖1是本發(fā)明中質(zhì)粒Iv-EFIa-TCR(CEA) -WPRE設(shè)計示意圖。
[0009]圖2是本發(fā)明中質(zhì)粒lv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Emoes-WPRE設(shè)計示意圖。
[0010]圖3是本發(fā)明中慢病毒載體Iv-EFla-TCR(CEA)-WPRE和Iv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE感染的T細胞制得效應(yīng)細胞對靶細胞SW480的殺傷效果示意圖。
[0011 ]圖4是本發(fā)明中慢病毒載體IV-EFla-TCR(CEA)-WPRE和IV-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE感染的T細胞制得效應(yīng)細胞對靶細胞HT29的殺傷效果示意圖。
【具體實施方式】
[0012]現(xiàn)在結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細的說明。這些附圖均為簡化的示意圖，僅以示意方式說明本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)，因此其僅顯示與本發(fā)明有關(guān)的構(gòu)成。
[0013]圖1、圖2、圖3和圖4所示的癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞，包括轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Eomes及CEA-TCR的慢病毒載體，所述的CEA-TCR包含TCRa鏈及TCRP鏈，所述的CEA-TCRTCRa鏈序列為第一序列，所述的CEA-TCR TCRi3鏈序列為第二序列，所述的轉(zhuǎn)錄因子T_bet的序列為第三序列，所述的轉(zhuǎn)錄因子Eomes的序列為第四序列。
[0014]第一序列:
[0015]
atgtaggacgcccctccggtcacggcatttctgatagtgcatcgacgtgactcacccgccgacacaggaagagggtg
gagaaccgtctcgggttccaatggctttttcctagtgttttgagggaaagaaacaatctatatatatactcttctag
gcgggcgcccccttcccctcaaactcttttttttcctcctctgccaagctttgtttgttgagaaaaaacaaaaaatt
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tcacagcctcacaagtcgggAGTCGGCTGCTCCCTCCCAGACATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCGGCTCCCCGTGGC
AGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGAaccaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactcttgc；
[0016]第二序列:
[0017]
ccatcctgccctgaccctgccatgggcaccaggctcctcttctgggtggccttctgtctcctgggggcagatcacacaggagctggagtctcccagtcccccagtaacaaggtcacagagaagggaaaggatgtagagctcaggtgtgatccaatttcaggtcatactgccctttactggtaccgacagagcctggggcagggcctggagtttttaatttacttccaaggcaacagtgcaccagacaaatcagggctgcccagtgatcgcttctctgcagagaggactgggggatccgtctccactctgaccctacacgcggagtcggctgctccctCCCAGACATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTACCCCTCTAGTGGACACCGGGGAGCTGTTTTTTGGAGAAGGCTCTAGGCTGACCGTACTGGAGGACCtgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtatgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggcttcacctccgagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgcatggccatggtcaagagaaaggattccagaggctagctccaaaaccatcccaggtcattcttcatcctcacccaggattctcctgtacctgctcccaatctgtgttcctaaaagtgattctcactctgcttcatctcctacttacatgaatacttctctcttttttctgtttccctgaagattgagctcccaacccccaagtacgaaataggctaaaccaataaaaaaatggtgtgtt；
[0018]第三序列3:
[0019]
atgggcatcgtggagccgggttgcggagacatgctgacgggcaccgagccgatgccggggagcgacgagggccgggcgcctggcgccgacccgcagcaccgctacttctacccggagccgggcgcgcaggacgcggacgagcgtcgcgggggcggcagcctggggtctccctacccggggggcgccttggtgcccgccccgccgagccgcttccttggagcctacgcctacccgccgcgaccccaggcggccggcttccccggcgcgggcgagtccttcccgccgcccgcggacgccgagggctaccagccgggcgagggctacgccgccccggacccgcgcgccgggctctacccggggccgcgtgaggactacgcgctacccgcgggactggaggtgtcggggaaactgagggtcgcgctcaacaaccacctgttgtggtccaagtttaatcagcaccagacagagatgatcatcaccaagcagggacggcggatgttcccattcctgtcatttactgtggccgggctggagcccaccagccactacaggatgtttgtggacgtggtcttggtggaccagcaccactggcggtaccagagcggcaagtgggtgcagtgtggaaaggccgagggcagcatgccaggaaaccgcctgtacgtccacccggactcccccaacacaggagcgcactggatgcgccaggaagtttcatttgggaaactaaagctcacaaacaacaagggggcgtccaacaatgtgacccagatgattgtgctccagtccctccataagtaccagccccggctgcatatcgttgaggtgaacgacggagagccagaggcagcctgcaacgcttccaacacgcatatctttactttccaagaaacccagttcattgccgtgactgcctaccagaatgccgagattactcagctgaaaattgataataacccctttgccaaaggattccgggagaactttgagtccatgtacacatctgttgacaccagcatcccctccccgcctggacccaactgtcaattccttgggggagatcactactctcctctcctacccaaccagtatcctgttcccagccgcttctaccccgaccttcctggccaggcgaaggatgtggttccccaggcttactggctgggggccccccgggaccacagctatgaggctgagtttcgagcagtcagcatgaagcctgcattcttgccctctgcccctgggcccaccatgtcctactaccgaggccaggaggtcctggcacctggagctggctggcctgtggcaccccagtaccctcccaagatgggcccggccagctggttccgccctatgcggactctgcccatggaacccggccctggaggctcagagggacggggaccagaggaccagggtccccccttggtgtggactgagattgcccccatccggccggaatccagtgattcaggactgggcgaaggagactctaagaggaggcgcgtgtccccctatccttccagtggtgacagctcctcccctgctggggccccttctccttttgataaggaagctgaaggacagttttataactattttcccaactga；
[0020]第四序列:
[0021]
atgcagttaggggagcagctcttggtgagctcagtgaacctgcctggcgcgcacttctacccgctggagagtgcgcgaggcggcagcggcgggagcgctggccacctccccagcgcggccccctctcctcagaagttggacttagacaaagcgtccaagaagttttccggcagtctctcctgcgaggcggtgagcggggagcccgcagccgccagcgcaggggcccccgcggccatgcttagtgacaccgacgccggggacgcatttgccagcgctgcggcagtggccaagccggggcccccggacggccgcaagggctccccctgcggggaggaggagctgccctccgccgctgcagccgccgccgccgccgccgccgcggctgcggccactgcgcgctactccatggacagcctgagctccgagcggtactacctccagtcccccggtcctcaggggteggagctggctgcgccctgctcactcttcccgtaccaggcggcggctggggcgccccacggacctgtgtacccggctcctaacggggcgcgctacccctacggctccatgctgccccccggcggcttccccgcggctgtgtgcccacccgggagggcgcagttcggcccaggagccggtgcgggcagtggcgcgggcggtagcagcggcgggggcggcggcccgggcacctatcagtacagccagggggctccgctctacgggccgtaccctggagccgcagcggcgggatcttgcggaggactggggggcctgggggttccaggttctggcttccgtgcccacgtctacctgtgcaaccggcctctgtggctcaaattccaccgccaccaaactgagatgatcattacgaaacagggcaggcgcatgtttcctttcttgagcttcaacataaacggactcaatcccactgcccactacaatgtgttcgtagaggtggtgctggcggaccccaaccactggcgcttccaggggggcaaatgggtgacctgtggcaaagccgacaataacatgcagggcaacaaaatgtatgttcacccagagtctcctaatactggttcccactggatgagacaggagatttcattcgggaaattaaaactcaccaataacaaaggcgcaaataacaacaacacccagatgatagtcttacaatccttacacaaataccaaccccgactgcatattgttgaagttacagaggatggcgtggaggacttgaatgagccctcaaagacccagacttttaccttctcagaaacgcaattcattgcagtgactgcctaccaaaacaccgatattactcaactaaagattgatcataacccctttgcaaaaggcttcagagacaactatgattccatgtacaccgcttcagaaaatgacaggttaactccatctcccacggattctcctagatcccatcagattgtccctggaggtcggtacggcgttcaatccttcttcccggagccctttgtcaacactttacctcaagcccgctattataatggcgagagaaccgtgccacagaccaacggcctcctttcaccccaacagagcgaagaggtggccaaccctccccagcggtggcttgtcacgcctgtccagcaacctgggaccaacaaactagacatcagttcctatgaatctgaatatacttctagcacattgctcccatatggcattaaatccttgccccttcagacatcccatgccctggggtattacccagacccaacctttcctgcaatggcagggtggggaggtcgaggttcttaccagaggaagatggcagctggactaccatggacctccagaacaagccccactgtgttctctgaagatcagctctccaaggagaaagtgaaagaggaaattggctcttcttggatagagacacccccttccatcaaatctctagattccaatgattcaggagtatacaccagtgcttgtaagcgaaggcggctgtctcctagcaactccagtaatgaaaattcaccctccataaagtgtgaggacattaatgctgaagagtatagtaaagacacctcaaaaggcatgggagggtattatgctttttacacaactcccta0
[0022]癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞的抑癌用途，所述以穩(wěn)定表達螢火蟲熒光蛋白Iuciferase的CEA陽性結(jié)直腸細胞系W480，HT29作為靶細胞，以穩(wěn)定表達熒光素酶的CEA陰性的肝癌細胞系HuH7作為對照，效應(yīng)細胞為慢病毒載體Iv-EFla-TCR-WPRE感染的T細胞，將靶細胞按照密度IXlO5個/ml接種96孔板中，每孔10ul，按照1:1效靶比將效應(yīng)細胞加入靶細胞，置于5%C02，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，利用熒光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒(E4550)檢測孔板中剩余細胞內(nèi)Luciferase含量，計算殺傷效率，結(jié)果表明，表達CEA-TCR的T淋巴細胞對CEA陽性腫瘤細胞具有殺傷作用，而對CEA陰性細胞無殺傷作用；以穩(wěn)定表達螢火蟲熒光蛋白Iuciferase的CEA陽性結(jié)直腸細胞系W480，HT29作為靶細胞，分別用慢病毒載體Iv-EFla-TCR-WPRE和lv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE感染的T細胞制得效應(yīng)細胞，將靶細胞按照密度2.5X 15個/ml，5X105個/ml，1X 15個/ml的密度接種96孔板中，每孔10ul，按照10:1,5:1,2.5:1效靶比將效應(yīng)細胞加入靶細胞，置于5 % CO2，37 V培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h;利用熒光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒(E4550)檢測孔板中剩余細胞內(nèi)Luciferase含量，計算殺傷效率，結(jié)果表明，表達轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴細胞較未表達轉(zhuǎn)錄因子T_bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴細胞對CEA陽性腫瘤細胞具有更強殺傷作用。
[0023]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明的癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞及其抑癌用途通過蹄選和克隆腫瘤特異性TCR基因，隨后以之轉(zhuǎn)染T細胞賦予其抗原特異性，從而獲得基因工程化抗原特異性T細胞，最終將TCR基因轉(zhuǎn)染T細胞回輸患者體內(nèi)，重建針對抗原陽性腫瘤的T細胞免疫反應(yīng)。
[0024]隨著TCR多樣性及TCR識別抗原肽/MHC復(fù)合物機制等相關(guān)理論知識的不斷豐富，結(jié)合分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的深入發(fā)展。腫瘤過繼性細胞治療逐漸明確了一條全新思路-TCR基因工程化T細胞(TCR gene engineered T cell)。即首先蹄選和克隆腫瘤特異性TCR基因，隨后以之轉(zhuǎn)染T細胞賦予其抗原特異性，從而獲得基因工程化抗原特異性T細胞，最終將TCR基因轉(zhuǎn)染T細胞回輸患者體內(nèi)，重建針對抗原陽性腫瘤的T細胞免疫反應(yīng)。
[0025]癌胚抗原(careinoembryonic antigen，CEA)是一種糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，相對分子質(zhì)量為200kDa，最初由GO Id和Freedman報道，表達于上皮源性腫瘤中如結(jié)直腸癌，胃癌、肺癌、子宮內(nèi)膜腺癌、卵巢癌，目前廣泛應(yīng)用于臨床輔助診斷。
[0026]結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，全世界每年大約新增一百萬的結(jié)腸癌患者有五十萬左右的結(jié)腸癌患者死亡，其發(fā)病率居惡性腫瘤第四位。自上世紀70年代以來，我國結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率有不斷上升趨勢。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展是因為一系列遺傳性改變累積而成，包括癌基因、抑癌基因和DNA修復(fù)基因的改變。在散發(fā)性結(jié)腸癌中，這些基因的改變是必要的，主要可能是由一些外源性或者內(nèi)源性的致癌物質(zhì)引起的。相反，在一些腫瘤結(jié)合征比如家族性結(jié)直腸息肉結(jié)合征(FAP)和遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(HNPCC)中，這些基因的改變是遺傳獲得的。在家族性結(jié)直腸息肉綜合癥中，是由于APC基因的胚系突變造成腺瘤樣息肉；而遺傳非息肉病性結(jié)直腸癌則是由于DNA修復(fù)基因的突變造成遺傳性改變加性累積從而增加癌癥發(fā)生的風險。近年來出現(xiàn)了很多有可能用于結(jié)腸癌的標志物，這些標志物可以在血清、組織和糞便中檢測到，從而對結(jié)腸癌的早期診斷和預(yù)后給予一定的指導(dǎo)作用[[4-G]。本綜述系統(tǒng)地闡述了結(jié)腸癌的各種標志物以及其臨床意義。
i0027] T-bet是由Szabo等人于2000年首先發(fā)現(xiàn)，屬于T-box轉(zhuǎn)錄因子。鑒于該基因編碼的蛋白上帶有T-box DNA結(jié)合域，并且局限表達于T細胞，特別是Thl細胞，因此命名為T-bet。然而，隨后的研究證實轉(zhuǎn)錄因子T-bet除在T細胞上表達外，還表達于NK細胞。小鼠動物模型實驗顯示，T-bet敲基因型⑶4+T細胞上IFN-γ的表達顯著降低，并且無法分化成為Thl細胞。進一步研究發(fā)現(xiàn)T-bet敲基因NK細胞在IFN- γ表達和細胞毒性作用方面也同樣具有缺陷。此外，敲除T-bet基因B細胞表達的IgG 2a顯著減少，T-bet基因缺陷的小鼠也不會產(chǎn)生自身免疫型糖尿病。隨后又有更多的研究發(fā)現(xiàn)并報道了T-bet在調(diào)控免疫應(yīng)答及自身免疫病方面所發(fā)揮的重要作用，提示T-bet具有廣泛的免疫調(diào)控作用。
[0028]Eomes是由Kimura等人于1999年首先發(fā)現(xiàn)并報道的，其基因可表達于活化后的⑶8+T細胞以及CD300a+CD4+T細胞，活化后的NK細胞。Pearce等人發(fā)現(xiàn)，Eomes可能對T-bet功能發(fā)揮起協(xié)同作用，并且在細胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮了關(guān)鍵性的調(diào)控作用。該轉(zhuǎn)錄因子還參與調(diào)控CD8+T細胞向效應(yīng)T細胞和記憶T細胞分化。并且有報道顯示Eomes在過繼性免疫治療腫瘤的過程中也發(fā)揮著相當重要的作用。
[0029]CD8+T細胞在抗病毒以及抗腫瘤免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，而T-bet和Eomes可以共同調(diào)控了細胞毒效應(yīng)T細胞上革El基因的轉(zhuǎn)錄。過表達T_bet或者Eomes可以有效誘導(dǎo)⑶8+T細胞上IFN-γ，穿孔素和顆粒酶B的表達。相反，缺失T-bet或者Eomes的T細胞則下調(diào)IFN-γ，穿孔素和顆粒酶B的表達。同時敲除T-bet和Eomes基因，會導(dǎo)致小鼠缺乏⑶8+Τ細胞，并且與細胞毒T細胞相關(guān)的基因表達也存在缺陷。此外，IL-15受體⑶122的表達也依賴于T-bet和Eomes。以上研究結(jié)果提示我們T-bet和Eomes在調(diào)控細胞毒T細胞上的基因轉(zhuǎn)錄及調(diào)控由IL-15介導(dǎo)的T細胞穩(wěn)態(tài)平衡方面發(fā)揮了協(xié)同作用，兩者具有代償性。此外，T-bet 的表達水平能決定 CD8+T細胞向 SLECs (short-lived effector cel Is)或MPECs (memoryprecursor effector cells)分化。在炎癥環(huán)境中，T_bet高表達，可促進⑶8+T細胞最終分化為KLRGhi IL-7Rlci的SLECs細胞。而T-bet低表達則促進可長期存活的CD8+記憶T細胞的產(chǎn)生。有證據(jù)表明IL-12可以增強初始⑶8+T細胞中mTOR激酶的活性，而維持T-bet的表達及CD8+效應(yīng)T細胞的產(chǎn)生依賴于mTOR激酶。rapamycin處理CD8+T細胞可以抑制mTOR激酶的活性，從而阻斷T-bet的表達，促進Eomes的表達。⑶8+T細胞中Eomes表達水平升高可以促進記憶T細胞的產(chǎn)生。因此，通過控制mTOR激酶的活性可以調(diào)節(jié)T-bet和Eomes這兩個轉(zhuǎn)錄因子之間的平衡，從而決定CD8+T細胞成為效應(yīng)細胞還是記憶細胞。
[0030]實驗方法及結(jié)果
[0031]1、構(gòu)建表達CEA-TCR的慢病毒載體;構(gòu)建表達轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes及CEA TCR的慢病毒載體；
[0032]2、慢病毒的包裝
[0033]本實施例包裝慢病毒采用磷酸鈣法，具體步驟如下:用含10%(Wt)FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細胞，至較佳狀態(tài);然后將293T細胞以IX 105/cm2的密度傳至I個75cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)22h，保證轉(zhuǎn)染時細胞匯合度為70-80 % ;再用預(yù)熱的含2 % (wt )FBS的DMEM培養(yǎng)基換液，培養(yǎng)2h，備用；將680ul ddH20，20ug慢病毒載體，20ug pMDLg/pRRE質(zhì)粒、20ug pRSV-Rev和1ug pMD2.G質(zhì)粒、10ul 2.5mM CaC12加入15ml離心管中，混合均勻，混勻后用移液器向混合液中逐滴加入2XHBS，同時用1ml移液器吹打混勻，混勻后室溫靜置15min，然后將混合液逐滴加入上述制備的細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)12-16h后，用含10%FBS(wt)的DMEM培養(yǎng)基更換培液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，72h后分別收集細胞上清并用于病毒純化。
[0034]3、慢病毒的純化
[0035]將病毒上清收集在50ml離心管中，3000r/min離心1min;然后用0.45um過濾膜過濾，濾液在3000r/min離心1min至新的50ml離心管;然后根據(jù)病毒上清量，分別加入質(zhì)量分數(shù)為50 %的PEG6000和4M NaCl，再用醫(yī)用鹽水定容至35mL，使PEG6000終濃度為8.5%, NaCl終濃度為0.3M，定溶后于4°C冰箱靜置90min，30min/次顛倒混勻;然后于4°C，5000r/min條件下離心30min，棄盡上清，用200ul含10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸病毒，1.5ml EP管分裝，每管40ul，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036]4、慢病毒感染T細胞及感染后細胞的擴增培養(yǎng)
[0037]I)人外周血單核細胞的分離
[0038]用加有抗凝劑的采血管采集外周血約60ml，分裝于50ml離心管各30ml，加入7.5ml輕乙基淀粉稀釋;室溫自然沉降約30min，收集上層血楽；，將收集的上層血楽于1400rpm/min條件下離心15min ;然后用生理鹽水重懸沉淀，約1:1加到淋巴細胞分離液上，梯度離心，400g/min，離心機降速DEC為5，離心15min;離心后，離心管由上至下分為:第一層:血楽層；第二層:環(huán)狀乳白色淋巴細胞層;第三層:透明分離液層;第四層:紅細胞層;取第二層白色淋巴細胞層，并用生理鹽水洗滌2次，第一次400g/min，離心1min，第二次1100rpm/min，離心5min，生理鹽水重懸細胞，加入含有10 %FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，得人外周血單核細胞。
[0039]5、慢病毒載體感染T淋巴細胞
[0040]用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)新制備的單個核細胞PBMC，第I天加入抗⑶3單克隆抗體活化;前3天進行慢病毒感染;加入20M0I的慢病毒載體I v-EFla-TCR(CEA)-WPRE，未感染的T淋巴細胞作為空白對照；24h后將培養(yǎng)基更換為含有500IU/ml重組人IL-2的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10-20天，然后觀察T淋巴細胞生長情況。結(jié)果顯示:細胞在感染Iv-EFla-TCR(CEA)-WPRE病毒后，能夠形成典型的增殖克隆團，通過對細胞進行計數(shù)，細胞在19天的時間內(nèi)增殖了近3000倍。
[0041]6、流式細胞術(shù)檢測TCR(CEA)在T細胞中的表達
[0042]將培養(yǎng)至14天的已感染病毒的T細胞，300g/min，離心5min，棄盡上清以收集細胞；用含有I %胎牛血清的PBS溶液重懸細胞，并將細胞調(diào)整密度為IXlO6個/ml;將收集的細胞分裝為6管，每管10ul，向每管細胞中加入20ul PE標記抗小鼠抗人⑶4單克隆抗體(BD公司PRA-T4克隆)，Percep標記小鼠抗人CD8單克隆抗體(BD公司SKl克隆)抗體、APC標記小鼠抗人CD56單克隆抗體(BD公司B159克隆)；2ul羊抗鼠Fab單克隆抗體(sigma公司)；4°C孵育30min，PBS溶液洗滌2次，上流式細胞儀進行檢測，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示經(jīng)過14天的培養(yǎng)，CEA-TCR-T細胞CD3陽性率為91.4% ,CD3CD4雙陽性細胞比率為57.6%,CD3CD8雙陽性細胞比率為38.4%。
[0043 ] 7、表達靶向CEA的嵌合抗原受體的T淋巴細胞抗腫瘤效果驗證
[0044]以穩(wěn)定表達螢火蟲熒光蛋白Iuciferase的CEA陽性結(jié)直腸細胞系W480，HT29作為靶細胞，以穩(wěn)定表達熒光素酶的CEA陰性的肝癌細胞系HuH7作為對照，效應(yīng)細胞為慢病毒載體Iv-EFla-TCR(CEA)-WPRE感染的T細胞;將靶細胞按照密度IXlO5個/ml接種96孔板中，每孔10ul;按照1:1效靶比將效應(yīng)細胞加入靶細胞，置于5%⑶2，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;利用熒光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒(E4550)檢測孔板中剩余細胞內(nèi)Luciferase含量，計算殺傷效率;結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，表達CEA-TCR的T淋巴細胞對CEA陽性腫瘤細胞具有殺傷作用，而對CEA陰性細胞無殺傷作用。
[0045]8、表達轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴細胞抗腫瘤效果驗證
[0046]以穩(wěn)定表達螢火蟲熒光蛋白Iuciferase的CEA陽性結(jié)直腸細胞系W480，HT29作為靶細胞，分別用慢病毒載體 Iv-EFla-TCR(CEA)-WPRE 和 lv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE感染的T細胞制得效應(yīng)細胞;將靶細胞按照密度2.5X 15個/ml，5X105個/ml，1X 15個/ml的密度接種96孔板中，每孔10ul;按照10:1，5:1，2.5:1效靶比將效應(yīng)細胞加入靶細胞，置于5%C02，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h;利用熒光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒(E4550)檢測孔板中剩余細胞內(nèi)Lucif erase含量，計算殺傷效率;結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，表達轉(zhuǎn)錄因子T_bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴細胞較未表達轉(zhuǎn)錄因子T_bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴細胞對CEA陽性腫瘤細胞具有更強殺傷作用。
[0047]以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完全可以在不偏離本項發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進行多樣的變更以及修改。本項發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于說明書上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來確定其技術(shù)性范圍。
【主權(quán)項】
1.一種癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞，包括轉(zhuǎn)錄因子T-bet、E0meS及CEA-TCR的慢病毒載體，其特征是:所述的CEA-TCR包含TCRa鏈及TCRMl，所述的CEA-TCRTCRa鏈序列為第一序列，所述的CEA-TCRTCRi3鏈序列為第二序列，所述的轉(zhuǎn)錄因子T-bet的序列為第三序列，所述的轉(zhuǎn)錄因子Eomes的序列為第四序列。2.癌胚抗原特異性TCR基因修飾的T細胞的抑癌用途，其特征是:所述以穩(wěn)定表達螢火蟲熒光蛋白Iuciferase的CEA陽性結(jié)直腸細胞系W480，HT29作為靶細胞，以穩(wěn)定表達熒光素酶的CEA陰性的肝癌細胞系HuH7作為對照，效應(yīng)細胞為慢病毒載體Iv-EFla-TCR-WPRE感染的T細胞，將靶細胞按照密度IXlO5個/ml接種96孔板中，每孔10ul，按照1:1效靶比將效應(yīng)細胞加入靶細胞，置于5 % CO2,37 0C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，利用熒光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒(E4550)檢測孔板中剩余細胞內(nèi)Lucif erase含量，計算殺傷效率，結(jié)果表明，表達CEA-TCR的T淋巴細胞對CEA陽性腫瘤細胞具有殺傷作用，而對CEA陰性細胞無殺傷作用；以穩(wěn)定表達螢火蟲熒光蛋白Iuciferase的CEA陽性結(jié)直腸細胞系W480，HT29作為靶細胞，分別用慢病毒載體Iv-EFla-TCR-WPRE 和 lv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE 感染的 T 細胞制得效應(yīng)細胞，將靶細胞按照密度2.5X105個/ml，5X105個/ml，1XlO5個/ml的密度接種96孔板中，每孔10ul，按照10:1，5:1，2.5:1效靶比將效應(yīng)細胞加入靶細胞，置于5%CO2 ,370C培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h;利用熒光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒(E4550)檢測孔板中剩余細胞內(nèi)Luciferase含量，計算殺傷效率，結(jié)果表明，表達轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes及CEATCR的T淋巴細胞較未表達轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes及CEATCR的T淋巴細胞對CEA陽性腫瘤細胞具有更強殺傷作用。
【文檔編號】A61P35/00GK106047818SQ201610639710
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月5日 公開號201610639710.8, CN 106047818 A, CN 106047818A, CN 201610639710, CN-A-106047818, CN106047818 A, CN106047818A, CN201610639710, CN201610639710.8
【發(fā)明人】雷菁, 唐小琴, 其他發(fā)明人請求不公開姓名
【申請人】武漢賽云博生物科技有限公司