一種定量檢測cea癌胚抗原試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及測定一種定量檢測CEA癌胚抗原的試劑盒，屬于免疫檢測領(lǐng)域。采用該試劑盒進(jìn)行癌胚抗原檢測具有較高的靈敏度和特異性，和更短的獲得檢測結(jié)果的時(shí)間和更簡便的操作方式。本發(fā)明提供的試劑盒，其包含的試劑有CEA癌胚抗原磁分離試劑，酶標(biāo)抗體，增強(qiáng)劑，校準(zhǔn)品、控制品，濃縮液以及底物。本試劑盒采用免疫磁微粒分離技術(shù)與競爭酶聯(lián)免疫技術(shù)結(jié)合，與現(xiàn)有技術(shù)的試劑盒相比，大大縮短了檢測時(shí)間。
【專利說明】一種定量檢測CEA癌胚抗原試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫檢測領(lǐng)域，具體涉及一種定量檢測CEA癌胚抗原的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]癌胚抗原是一種分子量約為22KD的酸性糖蛋白。CEA的編碼基因位于19號(hào)染色體，是胚胎性致癌抗原。CEA主要存在于胎兒消化道上皮組織、胰臟和肝臟，在正常成人血清中含量極低，而失去極性的癌細(xì)胞分泌CEA進(jìn)入血液和淋巴，導(dǎo)致血中CEA水平增高。CEA主要存在于結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等組織中，但在患肺癌、乳腺癌時(shí)，也有不同程度的提聞。
[0003]CEA廣泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌中，如胃癌、大腸癌、肝癌、胰腺癌，也可存在于小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、甲狀腺髓樣癌中。因此，檢測血清中CEA含量對上述癌癥的診斷具有輔助價(jià)值。CEA的臨床意義為:
(I)用于結(jié)腸直腸癌、胃癌、胰癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、乳癌以及甲狀腺髓質(zhì)癌的臨床監(jiān)測。
[0004]a.胰液和膽汁內(nèi)CEA定量可以用于診斷胰腺或膽道癌。
[0005]b.漿液性滲出液的CEA定量可以作為細(xì)胞學(xué)檢查的輔助手段。
[0006]c.尿液化的CEA定量可以作為診斷膀胱癌預(yù)后的參考。
[0007]d.血清中CEA的定量結(jié)合甲狀腺降鈣素測定，有助于甲狀腺髓樣癌的診斷和復(fù)發(fā)的估計(jì)。
[0008](2)用于預(yù)測惡性腫瘤的預(yù)后:CEA濃度越低說明病程較早，治療效果好，存活時(shí)間長。
[0009](3)可以檢測療效:治療后血清水平將下降至正常水平，如復(fù)發(fā)或治療失敗將兩次上升。
[0010](4)可以跟蹤復(fù)發(fā):治療后CEA又復(fù)升高，提示有轉(zhuǎn)移可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于提供一種定量檢測CEA癌胚抗原試劑盒及其檢測方法，
采用該試劑盒進(jìn)行CEA癌胚抗原檢測具有較高的靈敏度和特異性，和更短的獲得檢測結(jié)果的時(shí)間和更簡便的操作方式。
[0012]本發(fā)明提供的試劑盒，其包含的試劑有CEA癌胚抗原磁分離試劑，酶標(biāo)抗體，增強(qiáng)劑，校準(zhǔn)品、控制品，濃縮液以及底物。
[0013]所述的磁分離試劑含有標(biāo)記有癌胚抗原單克隆抗體的磁性微球。
[0014]所述的酶標(biāo)抗體是含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的癌胚抗原單克隆抗體。
[0015]所述的增強(qiáng)劑是含有Tris的緩沖液。
[0016]所述的校準(zhǔn)品及控制品是含有一定量的癌胚抗原抗原的溶液。
[0017]所述濃縮液是含有TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液。[0018]所述的底物為酶促化學(xué)發(fā)光底物。
[0019]本發(fā)明CEA癌胚抗原的定量檢測試劑盒，優(yōu)選通過如下步驟制備而成:
第一步:磁分離試劑的制備步驟:
1、將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg癌胚抗原單克隆抗體溶于PH 9.5的0.lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；
2、用移液槍吸取步驟I中的辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟I的抗體溶液中，置室溫 90min ；
3、將步驟2抗體溶液加入到濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0.5ml ；
4、取0.5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；
5、每次加入1.5ml PH9.50.lmol/L PB，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；將步 驟3獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；
6、加入0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘；
7、每次加入1.5ml PH 7.20.lmol/L PB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，
重復(fù)操作3次；
8、用10ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方為(均為質(zhì)量體積
比)
0、1% BSA, 0.05%吐溫-20，0.02% NaN3，20% 乙醇，4°C保存。
[0020]9、將步驟8獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的體積比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中磁分離試劑；所述磁珠緩沖液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液。
[0021]第二步:酶標(biāo)抗體制備步驟:
1、2.5mg癌胚抗原單克隆抗體溶于1.0ml的N, N-二甲基甲酰胺中，加入Iml的1mg/ml辣根過氧化物酶水溶液和1.3mg碳化二亞胺，I小時(shí)后將1.0ml 20mg/ml的碳化二亞胺加入，混合物不斷攪拌，4°C過夜；
2、將步驟I的溶液裝入透析袋中，對0.15M的PH7.4PBS透析，4°C過夜，收集保留液； 然后加入1ml濃度為15mg/ml的BSA溶液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；最后將收集到的辣根過氧化
物酶與癌胚抗原單克隆抗體的偶聯(lián)物用酶標(biāo)抗體稀釋液以1: 1000的體積比混合均勻，SP得酶標(biāo)抗體；所述酶標(biāo)抗體稀釋液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液。
[0022]第三步:增強(qiáng)劑配制步驟:
1、稱取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于IL容器中;用移液器將Proclin-300量取0.2ml于1ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；
2、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解調(diào)PH，控制PH在 7.35-7.45 之間；
3、稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾。
[0023]第四步:校準(zhǔn)品和控制品的配制:
校準(zhǔn)品濃度分別為O, 2，5，10，20，50，100，200，單位ng/ml ;控制品濃度分別為0.20、
0.80ng/ml。
[0024]第五步:濃縮液配制步驟，配制IL:
1、稱取TRIS 12.54g 和 NaCl 325.6g 于 IL 容器中；
2、稱取5gTween-20于10ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；
3、用移液器將Proclin-300量取0.2ml于盛有1ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；
4、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解?br> 5、調(diào)PH，控制其范圍在7.35-7.45之間；
6、最后定容1000ml,完全溶解后用0.2um濾器過濾即得。
[0025]第六步:底物配制步驟，配制IL:
1、稱取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2S030.002g 和 Proclin-3000.2ml 于 IL 燒杯中；
2、用量筒量取600ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢瑁敝镣耆芙?，調(diào)PH，控制其范圍在 7.95-8.05 之間；
3、加入250mlLum1-Phos 530后,用0.2um濾器過濾收集濾液,用純化水定容至1000ml, 混勻后即得。 [0026]本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于:
1、本發(fā)明試劑盒將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達(dá)到了較佳的性能參數(shù)。
[0027]2、本發(fā)明公開了一種新的專用增強(qiáng)劑以及濃縮液，使得反應(yīng)過程更加穩(wěn)定可靠，實(shí)驗(yàn)數(shù)
據(jù)靈敏有效，可精確到0.01ng，在提高產(chǎn)品性能的同時(shí)，并且大大降低了產(chǎn)品成本；
3、本試劑盒中的癌胚抗原磁分離試劑，酶標(biāo)抗體，增強(qiáng)劑，校準(zhǔn)品、控制品，濃縮液以及底物均是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。
[0028]
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1、
一、癌胚抗原磁分離試劑制備步驟:
1、將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg癌胚抗原單克隆抗體(Santa Cruz公司產(chǎn)品)溶于PH 9.5的0.lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；
2、用移液槍吸取步驟I中的辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟I的抗體溶液中，置室溫 90min ；
3、將步驟2的溶液加入到Centricon-1O濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0.5ml ；
4、取0.5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清； 磁珠為本領(lǐng)域常用磁珠，優(yōu)選濃度25mg/mL,直徑為800nm。
[0030]5、每次加入1.5ml PH9.50.lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；將步驟4獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)； 6、加入0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘；
7、每次加入1.5ml PH 7.20.lmol/L PB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，
重復(fù)操作3次；
8、用10ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方為0.1 % BSA，
0.05 %吐溫-20，0.02 % NaN3, 20 %乙醇(均為質(zhì)量體積比)，4°C保存。
[0031]9、將步驟8獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的體積比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中磁分離試劑；所述磁珠緩沖液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液。
[0032]實(shí)施例2
一、酶標(biāo)抗體的制備步驟:
1、2.5mg癌胚抗原單克隆抗體溶于1.0ml的N, N-二甲基甲酰胺中，加入Iml的1mg/ml辣根過氧化物酶水溶液和1.3mg碳化二亞胺，I小時(shí)后將1.0ml 20mg/ml的碳化二亞胺加入，混合物不斷攪拌，4°C過夜；
2、將步驟I的溶液裝入透析袋中，對0.15M的PH7.4PBS透析，4°C過夜，收集保留液； 然后加入1ml濃度為15mg/ml的BSA溶液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；最后將收集到的辣根過氧化
物酶與癌胚抗原單克隆抗體的偶聯(lián)物用酶標(biāo)抗體稀釋液以1: 1000的體積比混合均勻，SP得酶標(biāo)抗體；所述酶標(biāo)抗體稀釋液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液。
[0033]實(shí)施例3
增強(qiáng)劑配制步驟:
1、稱取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于IL容器中;用移液器將Proclin-300量取0.2ml于1ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；
2、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解調(diào)PH，控制PH在 7.35-7.45 之間；
3、稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾。
[0034]Mak33是羅氏公司的商品化的試劑。
[0035]實(shí)施例4
校準(zhǔn)品和控制品的配制步驟:
1、癌胚抗原定量檢測試劑盒癌胚抗原校準(zhǔn)品原料(購于Santa Cruz公司)用純化水配制成濃度點(diǎn)為0，2，5，10，20，50，100，200，單位ng/ml ;控制品用純化水配制的濃度點(diǎn)為
0.20、0.80ng/ml。
[0036]2、完全溶解后，貼好標(biāo)簽于2_8°C冷庫貯存，有效期為12個(gè)月。
[0037]實(shí)施例5:
濃縮液配制步驟:
1、稱取癌胚抗原12.54g和NaCl 325.6g于IL容器中；
2、稱取5gTween-20于10ml容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
3、用移液器將Proclin-300量取0.2ml于盛有1ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；
4、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解?br> 5、用HCL或NaOH調(diào)PH,測量其范圍在7.35-7.45之間；6、最后定容1000ml，測PH值，范圍在7.35-7.45之間即符合要求，完全溶解后用0.2um濾器過濾；過濾完后，貼好標(biāo)簽于2-8°C冷庫貯存，有效期為12個(gè)月；
實(shí)施例6
底物配制操作步驟:
1、稱取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 IL 燒杯中；
2、用量筒量取600ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解；用HCl或NaOH調(diào)PH，測量其范圍在7.95-8.05之間；
3、加入250mlLum1-Phos 530后,用0.2um濾器過濾收集濾液,用純化水定容至1000ml, 混勻后，貼好標(biāo)簽于2-8°C冷庫貯存，有效期為12個(gè)月。
[0038]本發(fā)明試劑盒的使用方法如下:
1、加15 μ I癌胚抗原校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待測標(biāo)本至對應(yīng)試管底部。
[0039]2、加25 μ I酶標(biāo)抗體至每一試管中。
[0040]3、加25 μ I增強(qiáng)劑至每一試管中。
[0041]4、加25 μ I磁分離試劑至每一試管中。
[0042]5、多管混勻器輕輕振蕩放有試管的試管架30s后，置37°C水浴30分鐘。
[0043]6、試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘，然后緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液。
[0044]7、濃縮液用純化水稀釋10倍后，加100 μ I稀釋后的濃縮液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s。
[0045]8、加100μ I底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測。
【權(quán)利要求】
1.一種定量檢測CEA癌胚抗原試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含CEA癌胚抗原磁分離試劑，酶標(biāo)抗體，增強(qiáng)劑，校準(zhǔn)品、控制品，濃縮液以及底物。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的磁分離試劑含有標(biāo)記有癌胚抗原單克隆抗體的磁性微球；所述的酶標(biāo)抗體是含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的癌胚抗原單克隆抗體。 所述的增強(qiáng)劑是含有Tris的緩沖液；所述的校準(zhǔn)品及控制品是含有一定量的癌胚抗原抗原的溶液；所述濃縮液是含有TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液；所述的底物為酶促化學(xué)發(fā)光底物。
3.如權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法: 第一步:CEA癌胚抗原磁分離試劑的制備步驟: 1)將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg癌胚抗原單克隆抗體溶于PH9.5的0.lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ； 2)用移液槍吸取步驟I中的辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟I的抗體溶液中，置室溫 90min ； 3)將步驟2獲得的溶液加入到濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0.5ml ； 4)取0.5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，放入試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清； 5)加入步驟3獲得的抗體溶液，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)； 6)加入0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘； 7)加入1.5ml PH7.20.1moI/LPB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清； 8)用10ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方為0.1 % BSA,0.05%吐溫-20，0.02% NaN3，20% 乙醇，4°C保存； 9)將步驟8獲得的溶液用磁珠緩沖液按照1:1的體積比例混勻，即得試劑盒中磁分離試劑；所述磁珠緩沖液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液； 第二步:酶標(biāo)抗體制備步驟: 1)2.5mg癌胚抗原單克隆抗體溶于1.0ml的N, N-二甲基甲酰胺中，加入1ml的1mg/ml辣根過氧化物酶水溶液和1.3mg碳化二亞胺，I小時(shí)后將1.0ml20mg/ml的碳化二亞胺加入，混合物不斷攪拌，4°C過夜； 2)將步驟I的溶液裝入透析袋中，對0.15M的PH7.4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；然后加入1ml濃度為15mg/ml的BSA溶液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；最后將上述溶液用酶?biāo)抗體稀釋液以1: 1000的體積比混合均勻，即得酶標(biāo)抗體；所述酶標(biāo)抗體稀釋液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液； 第三步:增強(qiáng)劑配制步驟: 1)稱取TRIS1.56g和NaC14.23g于IL容器中;用移液器將Proclin_300量取0.2ml于1ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中； 2)用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢瑁敝镣耆芙?，調(diào)PH在7.35-7.45 之間； 3)稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾；第四步:校準(zhǔn)品和控制品的配制:將癌胚抗原配制濃度分別為O，2，5，10，20，50，100，200，單位ng/ml的校準(zhǔn)品；將癌胚抗原配制成濃度分別為0.20、0.80ng/ml的控制品； 第五步: 濃縮液配制步驟，配制IL: 1)稱取癌胚抗原12.54g和NaC1325.6g于IL容器中；2)稱取5gTween-20于10ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中； 3)用移液器將Proclin-300量取0.2ml于盛有1ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中； 4)用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解? 5)調(diào)PH，控制其范圍在7.35-7.45之間； 6)最后定容1000ml,完全溶解后用0.2um濾器過濾即得； 第六步:底物配制步驟，配制IL:1)稱取TRIS2.35g、NaC16.41g、Na2S030.002g 和 Proclin-3000.2ml 于 IL 燒杯中； 2)用量筒量取600ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解，調(diào)PH在7.95-8.05之間； 3)加入250mlLum1-Phos530后,用0.2um濾器過濾收集濾液,用純化水定容至1000ml,混勻后即得。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK104034898SQ201410279286
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月21日
【發(fā)明者】李永鋒, 陳國勇, 傅汝毅, 陶玲云, 藍(lán)文苑 申請人:廣西博士海意信息科技有限公司