專利名稱：：作為HIVgp120抗原的模擬表位的抗獨特型單克隆抗體的制作方法作為HIVgpl20抗原的模擬表位的抗獨特型單克隆抗體本發(fā)明一般地涉及免疫學領域，具體地涉及抗獨特型單克隆抗體或其片段，其與人抗體特異性地反應，所述人抗體能夠結(jié)合人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV)gpl20蛋白，并且當施用給動物、包括人類時能夠誘導抗gpl20反應。
背景技術：
：長久以來，HIV感染的沖擊已經(jīng)到達了全世界范圍。在全世界，估計有大約4千萬感染人口，證實的新感染以每年5百萬新病例持續(xù)增長(UNAIDS—爿/DS5^WemZct/;^/a^—2005)。對感染實行控制枳^的圖景:例如，i非洲撒哈拉以南的某些區(qū)i(世界上-;行影二最大的區(qū)域)，估計超過50%的工作年齡的受試者是血清陽性的，對這個地區(qū)無論如何已經(jīng)毀壞的經(jīng)濟具有明顯的影響。但是，在正在經(jīng)歷著令人印象深刻的經(jīng)濟增長期的地區(qū)，例如，印度次大陸和東南亞，類似的情況也在發(fā)生。在這些地區(qū)，血清陽性的數(shù)量接近i千萬，新的病例每年指數(shù)性地增長(UNAIDS-ATO5^/7zWe脂'ct/j^/a/e-2005).抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，當可以使用時，改善了被感染受試者的生存期望。然而它與一系列的不利因素相聯(lián)系，所述不利因素在數(shù)年內(nèi)可能降低它的積極效果。首先，當今可用的治療不是治愈性的；換句話說，被治療的受試者不能完全消滅病毒，而仍然是受感染的，并因而暴露于發(fā)展嚴重的臨床形式感染(明顯的AIDS),以及無論如何向其他人傳播感染的風險中。此外，可用的藥物受到非常嚴重的副作用的拖累。這導致了患者與治療本身的低相容性。低相容性，與病毒的高度分子適應性和其他因素一起，有助于完全藥物抗性HIV分離4朱的產(chǎn)生和傳播。此外，治療的高成本使得它在世界的貧困地區(qū)大規(guī)模地使用完全不可能，如前所述的，這些地區(qū)代表了全球水平感染的真正的爆發(fā)性儲備地。總體上，以上描述的因素使得在HIV感染控制領域找可替代的，或至少補充性的治療策略的必要性具有最高的重要性，有效的疫苗方法的開發(fā)當然地具有優(yōu)先作用。不幸的是，HIV感染當今仍然是公開的挑戰(zhàn)，并且難以由科學共同體來解決。實際上，基于不能感染、但能夠刺激免疫系統(tǒng)的病毒顆粒施用的傳統(tǒng)的疫苗方法，已經(jīng)被證明對于一種病毒是無效的，所述病毒利用分子多態(tài)性，即，突變能力來逃避免疫反應作為其制勝武器(McMichaelJ.,(2006)J謹.Aev./mm譜/.24:227-55)。在以下的說明書中，在簡要地說明HIV刺激的主要免疫學機制之后，將綜合地回顧現(xiàn)今為止各種主要的疫苗策略，特別地關注本發(fā)明中的方法涉及的策略，其是本專利申請的主題，即，抗獨特型模擬抗體的獲得和施用。4十對HIV的免疫反應HIV感染的天然歷史可見感染后前幾周內(nèi)病毒的不受控制的復制，病毒血水平常常在前21天內(nèi)超過每毫升血漿107個病毒顆粒的值。這個第一階段之后是另一個特征為病毒血水平突然降低的階段，是由于細胞毒性CD8+T細胞和中和抗體的產(chǎn)生所代表的、特異性反應機制的活化。這個階段展現(xiàn)了免疫系統(tǒng)一旦被刺激如何能夠至少部分地控制感染。然而，如前一節(jié)所提及的，主要的關注在于某些病毒蛋白質(zhì)的超變性，其允許病毒克服所刺激的防御，因而恢復不受控制式的復制。在HIV感染的情況中，在病毒改變之后免疫系統(tǒng)由此被持續(xù)地喚起運行；然而，感染的天然歷史表明，免疫系統(tǒng)在這種追逐中持續(xù)地失敗。有效的預防性疫苗的主要目的是自首次接觸起為病毒呈現(xiàn)免疫反應，所述免疫反應能夠阻斷病毒并因而阻止病毒在機體中不受控制的增殖。使得目標細胞感染成為可能的HIV表面蛋白(gpl20和gp41),是免疫反應、特別是體液型免疫反應的主要目標。然而在天然感染的過程中產(chǎn)生的抗體產(chǎn)生一種保護，其限于刺激這種反應的病毒。換句話說，正是這些抗體將不能保護產(chǎn)生它們的患者免受將發(fā)展的新的病毒變體，并且(從疫苗角度來看最重要的方面)更加不能保護被其他HIV變體感染的其他患者。然而，HIV誘導的抗體反應的研究已經(jīng)證明了一些抗體克隆的可能的作用，所述抗體克隆具有對許多病毒分離林的廣泛中和活性(PantophletR.andBurtonD.R.,(2006)Aev./附附wwo/.24:739-769)。并且，僅僅少數(shù)患者能夠產(chǎn)生具有類似特征的抗體，這將容許它們控制感染長得多的時間，減慢朝向明顯AIDS的發(fā)展(BraibantM.等，(2006)j鄉(xiāng).20:1923-30)。這些患者被科學共同體定義為長期不進展者(LTNP)，并且當然地代表了為了有效疫苗的開發(fā)而被研究的抗HIV免疫反應的實例。根據(jù)采集的數(shù)據(jù)，科學共同體在此幾乎普遍地認識到，有效的預防性或治療性疫苗將能夠刺激足夠的抗體反應，類似于在LTNP患者中描述的。潛在有效的體液反應的主要靶點是，如前所述的，兩種表面糖蛋白(gpl20和gp41),其以三聚體的形式構成了刺突，刺突允許病毒結(jié)合目標細胞并穿透到目標細胞內(nèi)。然而，特別地，保守的關鍵表位，因而對于不同的病毒分離林是共同的，可能在這些蛋白質(zhì)中被檢測到。實驗室和臨床實驗數(shù)據(jù)實際證明了，廣泛的中和活性反應實際上是針對這些表位的(BraibantM.等，(2006X4薦.20:1923-30)?？茖W共同體一致地認識到，存在具有與病毒第一次接觸時類似特征的抗體，將最有可能能夠中和感染，來獲得甚至是最有效的治療方案也未能成功獲得的，即，完全的病毒清除(PantophletR.andBurtonD.R.,(2006)」謹.Aev./mm畫/.24:739-769)。病毒逃避機制在文獻中已經(jīng)深度研究了細胞和體液免疫反應針對HIV病毒發(fā)揮的選擇壓力，然而它對免疫學缺陷的發(fā)展以及在臨床上的影響還不清楚。自早期感染階段開始，中和抗體產(chǎn)生的選擇壓力實際上很容易在體外和體內(nèi)觀察到。實際上，病毒通過一系列突變來逃避，所述突變使得通常產(chǎn)生的非廣泛性中和抗體無效。有時涉及單個氨基酸殘基的這種突變一般涉及表面糖蛋白，特別是所謂的gpl20蛋白V(可變)區(qū)域。因而，容易理解的是，這種關鍵抗原的序列可變性是自然感染過程中產(chǎn)生的抗體不能完全阻斷病毒的主要原因之一。通過用完整病毒顆?；蛑亟Mgpl20免疫受試者獲得保護性反應的所有"經(jīng)典"嘗試失敗的分子原因同樣是可以容易理解的(PantophletR.andBurtonD.R.,(2006)J國.Tev./國w"o/.24:739-769)。然而，HIV防衛(wèi)機制不限于本身已經(jīng)很有效的超變性的策略。病毒的結(jié)構研究實際上已經(jīng)揭示了HIV如何利用它自己的超變區(qū)i或來向免疫系統(tǒng)隱藏關鍵表位，例如CD4結(jié)合位點和所謂的gpl20共同受體結(jié)合位點，即，在感染時物理地結(jié)合目標細胞受體和共同受體的蛋白質(zhì)部分。換句話說，病毒將僅在與目標細胞直接相互作用時暴露這些關鍵區(qū)域，因而限制了它們對免疫系統(tǒng)的暴露。并且，HIV已經(jīng)發(fā)展了隱藏gpl20最重要的表位的另一種策略分子的50%實際上被碳水化合物覆蓋，這使得蛋白質(zhì)表面對于免疫系統(tǒng)實際上"不可見"。在體內(nèi)，病毒還可以修飾這種糖類包被的4立置，因而產(chǎn)生了動態(tài)進化模式的假說，所謂的多糖護盾(glycanshield)。HIV實際上能夠調(diào)節(jié)糖基化，持續(xù)地適應它時常要面對的免疫反應種類。因而，逃避免疫反應的能力不是廣泛的現(xiàn)象，不是對所有病毒顆粒共同的固有特征，而是對每次刺激的中和抗體反應的特異性的和持續(xù)的適應。作為潛在的疫苗把點的gp120如在之前兩個小節(jié)中公開的，gpl20是HIV病毒中和免疫反應的主要靶點。然而，在前一小節(jié)中，已經(jīng)指出了為什么經(jīng)典的疫苗方法、甚至計劃利用對病毒如此重要的抗原不能產(chǎn)生積極結(jié)果的分子學原因。特別地，利用滅活的完整病毒顆?；騡pl20重組單體形式，引起了免疫反應的刺激，其僅限于免疫方案中使用的病毒、或獲取所述重組蛋白質(zhì)的病毒。例如，刺激的反應最后限于在實驗室中在永生化T細胞系培養(yǎng)物中生長的適應的HIV分離林。反而，針對"原始，，病毒分離抹，即，直接來自感染的患者的分離林沒有見到抗病毒效果。這些方法的失敗引發(fā)了將在說明書的這個小節(jié)中簡要公開的可能的替代途徑的研究，可以綜合地分成兩個組。a)更好地代表了HIV刺突上展示的蛋白質(zhì)結(jié)構的gpl20三聚物制品的開發(fā)。這種方法依靠施用gpl20,不再是單聚形式，而是與其他病毒表面糖蛋白、gp41蛋白締合的異三聚形式。這種策略根源的原理是基于單聚gpl20與三聚形式相比不同的抗原特征的觀察結(jié)果(PantophletR.andBurtonD.R.,(2006)j麵.版/畫wwo/.24:739-769)。然而，從關于這種策略的方法采集的第一手數(shù)據(jù)揭示了一系列相互緊密聯(lián)系的問題，都是從技術角度以及從關于方法本身的有效性的角度。從8在于獲得穩(wěn)定的異三聚形式的能力，所述異三聚形式最好能夠模擬病毒包膜刺突的組織機構。在HIV表面，實際上，gpl20-gp41相互作用是由必要的非共價相互作用介導的，以對刺突的總體結(jié)構給予表征其功能的不可缺少的結(jié)構適應性。在實驗室中，已經(jīng)證實了特別難以獲得這樣的分子，其一方面應當足夠穩(wěn)定以免解離成單獨的單體，然而另一方面應當能夠展示蛋白質(zhì)、特別是gpl20的關鍵部分。因而必需的是采用一系列的技術策略來穩(wěn)定三聚物(原始多聚蛋白裂解位點中的突變、半胱氨酸殘基向結(jié)構的非重要部分中的插入)，或?qū)⑺鼈冋宫F(xiàn)在與病毒包膜盡可能類似的結(jié)構上(包含到蛋白脂質(zhì)體中，在病毒樣顆粒上表達)。然而，后面的方法都不能容許完全解決三聚體穩(wěn)定化和純化難題，就有效性以及特別是中和活性的程度而言，與用gpl20的單聚形式獲得的結(jié)果相比，它們也沒有產(chǎn)生明確優(yōu)越的結(jié)果。計劃利用突變的gpl20重組形式以使蛋白質(zhì)的關鍵部分對免疫系統(tǒng)更可獲得的方法，所獲得的結(jié)果類似地是不令人滿意的。b)創(chuàng)新的基于表位的疫苗的開發(fā)，即，基于gpl20的保守的、因而潛在保護性的部分對免疫系統(tǒng)的暴露。這一組與抗獨特型模擬表位策略相關聯(lián)，本專利申請中例舉的發(fā)明也是基于此。上文例舉的所有策略的主要難題涉及除了類型特異性中和反應之外不能刺激廣泛的中和反應。所謂的基于表位的方法必需在一些嘗試的范圍內(nèi)考慮，來降低類型特異性反應和增強交叉中和反應。為了更好地理解這組中涉及的策略，對gp120抗原結(jié)構進行簡要的介紹是有用的。根據(jù)比較性序列分析，gpl20的研究揭示了，作為糖蛋白，5個保守的(Cl-C5)和5個可變的(Vl-V5)片段。進一步的研究展現(xiàn)了Cl和C5區(qū)域可能涉及與gp41接觸，已經(jīng)證明的是針對這個區(qū)域的抗體僅識別單體形式的gpl20，而不識別三聚的形式。反而，C2、C3和C4區(qū)域的某些部分可能形成gpl20分子內(nèi)隱藏的和相對疏水的核，可能涉及CD4受體識別。不像保守的區(qū)域，可變區(qū)域(特別是V1、V2和V3)是在蛋白質(zhì)上充分暴露的和可接近的?；诒砦坏姆椒▽嶋H上嘗試利用gpl20結(jié)構特征以獲得能夠?qū)ｉT地或主要地將免疫反應靶向它的關鍵表位的分子。在這種情境下，一種策略是利用gpl20單體，其中除去了VI、V2和V3區(qū)域，以將保守的CD4結(jié)合部分暴露給免疫系統(tǒng)。類似的方法還沒有得到滿意的結(jié)果，也是因為從蛋白質(zhì)中除去這種大的部分對它的整體構象、由此對CD4結(jié)合部分具有不可避免的影響，其可能喪失它自身的獨特特;f正。另一種可能的策略是對免疫系統(tǒng)有利地利用先前公開的HIV逃避才幾制之一，即，gpl20部分的超糖基化。就此而論，已經(jīng)在實l全室中獲得了人工糖基化的gpl20s,以隱藏非保護性的位點并將反應專門地耙向蛋白質(zhì)的重要部分。然而，用這種方法獲得的結(jié)果不是令人滿意的，在大量的這種策略中，雖然引起了針對分子的非保守部分的免疫反應的降低，但未能引起對gpl20關鍵部分的廣泛的反應。在這一點上，想到，在很少見的情況下和在非常低的滴度下，在某些天然感染的過程中，產(chǎn)生了能夠中和廣泛的病毒分離林的抗體是有用的。這些抗體(從科學的角度看極度稀少和寶貴)因而代表了基于極端耙向的表位的方法的理想模板。利用這些分子的獨特型(即，特異性識別和結(jié)合抗原的抗體部分)，通過利用反向疫苗學方法，可能獲得其他的(抗獨特型)抗體分子，其特異性地針對廣泛中和抗體的獨特型，因而能夠模擬它們識別的關鍵表位。換句話說，良好設計的抗獨特型抗體可能代表了實驗室中優(yōu)越的人工抗原，因為它們能夠僅將中和抗體識別的關鍵表位暴露給免疫系統(tǒng)。在先的科學和專利文獻中的分析已經(jīng)容許指出，基于抗獨特型的策略已經(jīng)應用于HIV感染。然而，就發(fā)明人所知的，在先的文獻的大部分涉及抗獨特型抗體，其是利用非人類衍生的、特別是小鼠衍生的抗體分子，即，用重組gpl20免疫實驗室小鼠獲得的抗體作為克隆模板。許多次科學地證明了，一種相同的表位能夠在實驗動物中刺激特定的抗體反應，但在人類中不能，利用非人類衍生的多克隆制品或單克隆抗體作為獲取抗獨特型抗體的模板的選擇，使得對于免疫目的有用的抗獨特型抗體的獲得在人類中是不確定的。即，不確定的是，它們能效地模擬人類免疫系統(tǒng)識別的基礎性gp120抗原部分，并且因而能夠在人類中刺激有效的免疫反應。人類衍生的模板抗體然而，少數(shù)在先文件描述了具有中和活性的人類單克隆抗體，其在某些情況下被提出作為獲得抗獨特型分子的模板。然而，這些在先文件的大部分沒有以實踐的方式描述抗獨特型分子的產(chǎn)生，也沒有描述它們的性質(zhì)和應用。發(fā)明人僅獲得了一個在先專利文件，其中具體地公開了從人類衍生的模板抗體開始獲取抗獨特型抗體。它是1992年9月17日公開的國際專利申請WO92/15885。該專利申請公開了對用于HIV感染的預防性和治療性處理的疫苗目的有用的、抗獨特型單克隆抗體的選擇方法。簡要地，該方法計劃利用完整抗gpl20人類Igs(Abls)的多克隆制品作為模板獲得抗獨特型單克隆抗體(Gl-Ab2s),隨后選擇抗獨特型單克隆抗體的亞組(G2-Ab2s)，其特征在于體外與多種HIV毒抹中和抗gpl20抗體反應的能力，并選擇能夠在靈長類宿主中產(chǎn)生抗抗獨特型抗體(Ab3)反應的進一步的抗獨特型單克隆抗體的亞組(G3-Ab2s),所述抗體與gpl20抗原反應并具有HIV中和性質(zhì)。WO92/15885申請中描述的步驟顯示了幾個缺點。首先，通過使用完整的免疫球蛋白作為模板，獲得了一組抗免疫球蛋白單克隆抗體，其主要針對模板免疫球蛋白的無用的部分，即，獨特型之外的部分，并且其大部分因而不是真實的抗獨特型。此外，在本專利申請中公開的在靈長類中實現(xiàn)的中和反應是微弱的，需要在免疫中使用的抗體的預先純化。因而可以斷定，用W092/15885方法獲得的抗體，除了對于抗gpl20免疫球蛋白的有用部分(獨特型)沒有足夠特異性之外，不能激發(fā)強的中和免疫反應(低抗體滴度)并因而作為疫苗不是特別有前景。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是解決上文例舉的現(xiàn)有技術的難題。更具體地，本發(fā)明的一個目的是提供抗免疫球蛋白單克隆抗體或其抗體片段，其能夠免疫學地結(jié)合人類抗HIVgpl20抗體的獨特型，并且因而其能被定義為"抗獨特型"抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供如上文定義的抗獨特型單克隆抗體或其抗體片段，其能夠抑制gpl20抗原和人類抗gpl20抗體之間的免疫學結(jié)合。本發(fā)明的另一目的是提供如上文定義的抗獨特型單克隆抗體或其片段，其在施用給動物包括人類時能夠激發(fā)針對mv的快速和強烈的抗抗獨特型抗體免疫反應。本發(fā)明的另一個目的是提供制備如上文定義的抗獨特型單克隆抗體或其片段的方法，容許獲得一組單克隆抗體，所述單克隆抗體特異性地針對用作模板的人類抗gpl20免疫球蛋白的有用部分，即，它們的獨特型，并且其能夠中和HIV病毒。發(fā)明描述通過附隨的權利要求中所定義的抗獨特型抗體、它們的核苷酸和氨基酸序列以及其制備方法，實現(xiàn)了這些和其他目的。權利要求形成了說明書的整體部分。更具體地，本發(fā)明涉及制備適合的抗獨特型單克隆抗體的方法，所述抗體用于HIV感染或其相關疾病的預防性或治療性處理，所述制備方法包括第一步驟，其中提供針對HIVgpl20抗原的人類多克隆抗體(并因而進一步稱為"抗gpl20抗體")的制品，所述制品隨后將用作模板用于抗獨特型抗體的制備。重要的是，隨后被用作模板的人類多克隆抗gpl20抗體的制品是針對它對抗HIV的廣泛中和活性預選4奪的。所述預選擇優(yōu)選地通過選擇臨床特征在于緩慢疾病進展的HIV陽性患者(長期不進展者)的血清作為抗體來源來進行。這些患者通過根據(jù)說明書的實驗小節(jié)中例舉的極度嚴格的臨床病毒學標準來選擇。這些標準的觀察容許獲得具有可觀的廣泛HIV中和活性的血清樣品。中和活性的驗i正可以通過利用本身已知的方法和技術來進行，本領域技術人員能夠?qū)⑺龇椒ê图夹g應用于具體情況而不需進行發(fā)明性活動和沒有過度的實驗。優(yōu)選的，用作模板的人類多克隆抗gpl20抗體是純化的抗gpl20免疫球蛋白G(IgG)。純化優(yōu)選地通過(免疫)親和層析過程來進行，例如，通過利用含有G蛋白的瓊脂糖柱用于IgG純化，含有gpl20的柱用于特異性針對HIVgpl20抗原的抗體的純化。用作模板的人類多克隆抗gpl20抗體的另一個優(yōu)選的特征是，它們是Fab片段的形式。因而，在所述方法的優(yōu)選的實施方式中，具有廣泛HIV中和活性的、純化的抗gpl20IgGs作為Fab片段來提供。這種具有中和活性的抗gpl20Fab片段將進一步被稱為"RBlFabs"。12在所述方法的第二個步驟中，RBlFabs被用作模板用于產(chǎn)生抗免疫球蛋白單克隆抗體，其針對用作模板的所述RBlFabs的獨特型。這種抗免疫球蛋白抗體被進一步稱為"抗獨特型抗體"。表述"針對(directedtowards),(directedagainst)，，用于表明，所關注的抗體能夠反應于，即，免疫結(jié)合于所指抗原。如已知的，F(xiàn)ab片段是能夠結(jié)合抗原的抗體片段，可通過用木瓜蛋白酶消化完整免疫球蛋白獲得。更具體地，F(xiàn)ab片段由與重鏈的VH-Cyl片段締合的完整輕鏈組成。通過用木瓜蛋白酶消化完整IgG,獲得兩個相同的Fab片段。在本發(fā)明的方法的范圍內(nèi)，利用Fab片段作為模板用于產(chǎn)生抗免疫球蛋白單克隆抗體有利地允許獲得一組抗體，所述抗體更特異性地針對用作模板的免疫球蛋白的有用部分，即，它們的獨特型。因而，這樣的抗體被稱為"抗獨特型"。術語"獨特型"是指免疫球蛋白的可變結(jié)構域的超變區(qū)的全體，就是說表征了抗體分子的同質(zhì)群體的那些結(jié)構，例如，骨髓瘤的蛋白質(zhì)或單克隆抗體，并因而容許區(qū)分抗體分子的一個同質(zhì)群體和另一個同質(zhì)群體(例如，一個單克隆抗體和另一個)。用于制備單克隆抗體的任何常規(guī)技術，例如，但不限制地，雜交瘤技術、噬菌體展示技術、酵母展示技術、核糖體展示技術，可以用于獲得一組抗獨特型單克隆抗體。優(yōu)選的，在這個步驟中獲得的抗獨特型單克隆抗體是小鼠抗體，通過用RBlFabs免疫小鼠的雜交瘤技術產(chǎn)生。最后，在所述方法的第三個步驟中，篩選在第二個步驟中獲得的抗獨特型單克隆抗體組來選擇抗體的亞組，所述抗體亞組具有抑制gpl20與人類抗gpl20抗體、優(yōu)選地與用作模板的RBlFabs結(jié)合的能即，能夠免疫學地模擬gpl20抗原的抗獨特型抗體。篩選可以通過用于這種目的的任何適合的已知方法來進行，例如通過ELISA,如在以下的實驗小節(jié)所描述的。本發(fā)明的范圍還包括一組抗獨特型單克隆抗體，優(yōu)選小鼠抗體，其特征在于特異性地針對人類抗gpl20抗體的獨特型，以及能夠抑制gpl20和人類抗gpl20抗體之間的結(jié)合。這種抗獨特型單克隆抗體組可通過本發(fā)明的方法獲得。術語"抗獨特型抗體組"被用于表明用本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的抗免疫球蛋白單克隆抗體的不同群體的總體。得益于所使用的特定制備方法，獲得的抗免疫球蛋白單克隆抗體的各種群體，雖然在抗原結(jié)合區(qū)的結(jié)構方面相互明確不同，但都享有共同的特征，即，它們針對用作模板的RBlFabs的獨特型，因而可以被定義為抗獨特型單克隆抗體的群體。根據(jù)上述解釋，因而明顯的是，在本說明書的范圍內(nèi)，術語"抗免疫球蛋白抗體"與術語"抗獨特型抗體"不是同義的。抗免疫球蛋白抗體一般是通過用免疫球蛋白免疫動物獲得的抗體，所述免疫球蛋白在這種情況下用作抗原?？姑庖咔虻鞍卓梢葬槍τ米骺乖娜魏蚊庖咔虻鞍讌^(qū)域，包括，例如，Ig恒定區(qū)或其他保守的部分。相反，抗獨特型抗體是特異性地針對用作抗原的免疫球蛋白的獨特型的抗免疫球蛋白抗體。因而，抗獨特型抗體的類別是比抗免疫球蛋白抗體的類別更具體的。本專利申請的實驗小節(jié)詳細說明了用于制備本發(fā)明的抗獨特型單克隆抗體的方法，以及免疫學特征，其使得獲得的某些抗體在針對HIV感染或與之相關的疾病的疫苗(治療或預防性)應用中特別有效。處于Fab片段形式的抗獨特型單克隆抗體的獲取在實驗小節(jié)中特別說明了。并且，描述了兩種具體的抗獨特型Fabs(稱為Pl和P2),其通過從雜交瘤開始的分子生物學技術獲得，并通過它們的重鏈和輕鏈的可變部分的氨基酸和核苷酸序列來確定。在標題為"序列表"的說明書小節(jié)中提供了這些序列。明顯地，本發(fā)明的抗獨特型抗體，包括P1和P2，可以以Fabs以外的其他形式制備和使用，例如，作為完整的免疫球蛋白、或以其他抗體片段類型(例如，F(xiàn)(ab')2片段或比Fabs更小的抗體片段)的形式，或甚至是具有與本發(fā)明的Fabs相同免疫學性質(zhì)的肽。例如，單鏈抗體可以根據(jù)Ladner等人的美國專利4,946,778中描述的方法來構建，通過引用合并在此。單鏈抗體包括通過柔性接頭連接的輕鏈和重鏈可變區(qū)。被稱為單結(jié)構域抗體的抗體片段甚至小于單鏈抗體，因為它由單獨分離的VH結(jié)構域組成。獲得具有與完整抗體至少部分相同結(jié)合能力的單結(jié)構域抗體的技術是現(xiàn)有技術中已知的。<列^口，Ward,等,在"BindingActivitiesofaRepertoireofSingleImmunoglobulinVariableDomainsSecretedfrom五scAen'aco//，"Nature341:644-646，描述了獲得抗體重鏈的可變區(qū)(VH單結(jié)構域抗體)的篩選方法，所述抗體重鏈的可變區(qū)具有對目標表位的足夠的親和力從而它將以分離的形式結(jié)合所述表位。在以下的說明中，術語"抗獨特型抗體，，因而用于指所有上述的抗獨特型抗體實施方式，即，完整免疫球蛋白、Fab片段或其他抗體片段類型，單鏈抗體、單結(jié)構域抗體，等等。本發(fā)明的抗獨特型抗體可以以游離形式或以載體結(jié)合的形式產(chǎn)生和使用。載體是能夠與抗體結(jié)合并使得它有免疫原性或提高它的免疫原性的任何分子。載體的非限制性的實例有蛋白質(zhì)例如KLH(釘形貝血藍蛋白)、麻仁球蛋白、甲狀腺球蛋白、白蛋白，例如，牛血清白蛋白(BSA)或人類血清白蛋白(HSA)、紅血球，例如綿陽紅血球(SRBC)、破傷風變性毒素、霍亂變性毒素、聚氨基酸例如聚(D-賴氨基酸D-谷氨酸)等等。為了促進抗獨特型與載體的結(jié)合，抗獨特型C-末端或N-末端可以被修飾，例如，通過插入其他的氨基酸殘基，例如，能夠形成二硫鍵的一個或更多個半胱氨酸殘基。由于將在實驗小節(jié)中詳細顯示的它們的性質(zhì)，本發(fā)明的抗獨特型抗體特別適合于在治療和/或診斷應用中，特別是在用于HIV感染或與之相關的疾病的預防或治療性處理的藥物的制備中，以及在用于檢測生物學樣品中抗HIVgpl20抗體的檢測方法中使用。如前所述，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的兩種具體抗獨特型Fabs、分別稱為PI和P2的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸和核苷酸序列。如在實驗小節(jié)詳細描述的，PI和P2Fabs已經(jīng)通過分子生物學技術從稱為Mabl和Mab2的兩個雜交瘤開始而獲得，所述雜交瘤能夠產(chǎn)生抗獨特型單克隆抗體，所述單克隆抗體能夠抑制gpl20和RBlFabs之間的免疫學結(jié)合。用于產(chǎn)生本發(fā)明的PI和P2Fabs的確切步驟在實驗小節(jié)中詳細公開了。一般地，編碼Mabl雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因的mRNA被克隆到本身已知，稱為RBCaf的表達載體中，由此獲得的重組構建體被轉(zhuǎn)染到已經(jīng)變?yōu)楦惺軕B(tài)的大腸桿菌(￡\co/0菌林XLlBlue細胞中。相同的步驟用于Mab2雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。從每個單克隆抗體獲得約40個重組細菌克隆。然后根據(jù)它們產(chǎn)生能結(jié)合純化的RBlFabs的小鼠Fabs的能力來選擇重組細菌克隆。這樣選擇了兩個克隆，每個克隆一個，分別稱為Pomonal(Pl)和Pomona2(P2)。獲得了小鼠Pl和P2Fabs的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸和核苷酸序列。這些序列在標題為"序列表"的小節(jié)中報告了。小鼠Pl和P2Fabs結(jié)果是有益地積極的，不僅對于它們抑制gpl20-RBlFab結(jié)合的能力、以及對于它們在小鼠以外的動物模型，例如兔子中刺激特異性抗gpl20免疫反應的能力。本專利申請的實驗小節(jié)中描述的免疫實驗顯示了這些Fabs能夠引發(fā)快速和強烈的特異性抗gpl20免疫反應，在高血清稀釋(1:1600)中也是明顯的。還可能的是驗證在兔子中響應于本發(fā)明的Pl和P2Fabs的免疫所引發(fā)的抗gpl20抗體展現(xiàn)了高度HIV中和活性。獲得的數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的P1和P2分子在疫苗應用中特別有用，特別是用于HIV感染或與之相關的疾病的預防和治療性處理的疫苗應用。本發(fā)明的抗體引發(fā)強烈的抗病毒免疫反應(不使用病毒)的能力在與人類系統(tǒng)發(fā)育很遠的動物模型，例如兔子中被證實，不僅在該觀察結(jié)果的基礎上預測了這些性質(zhì)，而且還通過來自用本發(fā)明的抗獨特型單克隆抗體免疫的兔子的血清的中和活性評估分析實驗性地證實了它們。利用人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系進行的這些中和實驗的結(jié)果在以下的實驗小節(jié)中說明了。因而，包含免疫學有效量的至少一種本發(fā)明的抗獨特型抗體(優(yōu)選的Pl或P2分子)以及藥學上可接受的載體和/或稀釋劑的免疫原性組合物也被包括在本發(fā)明的范圍中。免疫學有效量的至少一種本發(fā)明的抗獨特型抗體是能夠在所施用的動物宿主，包括人類中誘導抗gpl20免疫反應的量。任選地，所述免疫原性組合物可以進一步包括一種或更多種佐劑。佐劑是具有對免疫系統(tǒng)的非特異性刺激活性的化合物。佐劑的非限制性實例有完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、維生素E、非離子嵌段聚合物、胞壁酰肽、免疫刺激復合物、皂苷、礦物油、蔬菜油、Carbopol、熱不穩(wěn)定大腸桿菌毒素(LT)、霍亂毒素(CT)、氫氧化鋁、磷酸鋁或氧化鋁，等等。用于本發(fā)明的免疫原性組合物的有用的藥學上可接受的載體或16稀釋劑的其他非限制性實例包括穩(wěn)定劑，例如SPGA，碳水化合物(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)，蛋白質(zhì)例如白蛋白或酪蛋白，含蛋白質(zhì)的試劑，例如牛血清或脫脂奶，以及緩沖液(例如，磷酸緩沖液)。如在以下實驗小節(jié)將詳細描述的，已經(jīng)確認的是，通過使動物經(jīng)歷特定的免疫方案，可用本發(fā)明的抗獨特型分子免疫測試動物(例如，兔子)實現(xiàn)的結(jié)果可以被進一步改進(對于抗gpl20免疫反應強度來說，參見附圖3),所述免疫方案計劃本發(fā)明的抗獨特型抗體(優(yōu)選的P1或P2)以及gpl20抗原或其他天然存在的或人工的抗原的同時、獨立或序貫的施用。因而，包含本發(fā)明的抗獨特型抗體，優(yōu)選的P1或P2，以及HIVgp120抗原或其他天然存在的或人工的抗原作為用于在針對HIV的治療或預防性免疫方案中同時、獨立或序貫施用的組合制品的試劑盒也被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。最后，考慮到它們與抗HIVgpl20抗體特異性反應的已證實的能力，本發(fā)明的抗獨特型抗體，優(yōu)選的P1和P2，可以用作體外方法中的診斷試劑，用于^r測生物學樣品中的抗gpl20抗體和/或抗體亞群，例如，來自動物、包括人類的血清、血漿、血液或任何其他適合的生物學材料的樣品，所述人類例如感染的或懷疑被HIV感染的患者。實驗小節(jié)從HIV病毒中和血清獲得人類IgGs從臨床特征在于疾病的緩慢進展的HIV陽性患者(長期不進展者)的血清純化了人類IgGs。通過根據(jù)在長期不進展者的定義中最嚴格的臨床病毒學標準來選擇這些患者。所有選定的患者實際上用以下參數(shù)來表征-HIV血清陽性至少8年；-CD4+T淋巴細胞水平超過600個細胞/pl至少5年(這是用于評估所選受試者的免疫學狀態(tài)的極其重要的參數(shù)，不僅是在研究之時，還在研究之前的長期時間期間)；-沒有HIV相關臨床病征至少5年(這是隨著時間的過去的感染控制的極其重要的指征)。通過根據(jù)這些參數(shù)，可能的是隨著時間的過去獲得(根據(jù)所提出的標準的嚴格性具有明顯的難度)血清樣品，其具有令人驚訝的廣泛中和活性，并因而對于研究的繼續(xù)是最理想的。此外，不是所有的選定患者的血清樣品可被用作多克隆制品模板來獲得抗獨特型僅僅能夠顯著地抑制寬范圍的HIV分離林組的血清被選擇用于研究的繼續(xù)。來自這些患者的血清等分量被評估它們的HIV-1中和能力。簡要地，對于病毒中和，參考的嗜淋巴細胞病毒毒林(HIV-1IIIB)(AdvancedBiotechnologiesInc.-ABI)首先通過Karber的方法(OxfordUniversityPress,VirusCulture—APracticalApproach,ed.A.J.Cann,p.84)在HTLV畫l轉(zhuǎn)化的人類細胞系(C8166—ECACC弁88051601)上，對每個病毒稀釋度(范圍1:IO到I:16000)使用6個副本來滴定，從而獲得表示為TCID5G(即，能夠在50°/。的感染細胞中測定細胞病變效果的劑量)的病毒滴度。在中和測試中，因而lOOTCIDso與所選血清的分步稀釋物預先孵育，評估后者抑制C8166細胞被病毒感染的能力。為此，在預孵育后3、7和IO天采集培養(yǎng)物上清液以測量病毒p24(VidasHIVDuoUltra,Biomerieux)。選擇具有更高中和活性的血清，組合所有的等分量。從血清純化IgGs通過免疫親和層析來進行。簡短地，中和血清的庫用3倍體積的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水NaC18mg/ml;KCl0.2mg/ml;Na2HP041.44mg/ml;KH2P040.24mg/ml)稀釋，過濾通過0.45過濾器(MilliporeCorporation;Bedford,MA)。濾液然后通過含有蛋白G的瓊脂糖柱(GammabindSepharose,GEHealthcareLifeSciences,UK)。在用10倍體積PBS對柱洗滌一次之后，用IO倍體積的0.1M檸檬酸、pH3洗脫結(jié)合的IgG成分，迅速用堿性溶液(1.5MTris-Base)中和。獲得的各種級分然后在分光光度計中讀取(O.D.280nm)以評估獲得的IgG的數(shù)量?？笻IVgpl20抗體的純化針對HIVgpl20糖蛋白的抗體通過已經(jīng)描述的4支術(Hariharan等，1993)的修改版來純化。簡要地，700pg重組型IIIBgpl20糖蛋白(ImmunoDiagnosticsInc.，Woburn,MA)通過共1"介結(jié)合與CNBr活化的Sepharose4B(CNBr-activatedSepharoseTM4B,GEHealthcareLifeSciences,UK)偶聯(lián)。溶于4ml的偶聯(lián)緩沖液(lOOmMNaHC03;500mMNaCl;用HC1調(diào)節(jié)到pH8.2)中的前述數(shù)量的抗原添加到4ml50%再生的樹脂上，之前用lmMHCl洗滌。混合物在4。C進行旋轉(zhuǎn)混合過夜，用過量的偶聯(lián)緩沖液洗去過量的未結(jié)合的抗原。樹脂然后轉(zhuǎn)移到10ml注射器中并用十倍體積的10mMTris、pH7.5洗滌。然后將IO倍體積的100mM甘氨酸(pH2.5)施加到柱上，隨后是10倍體積的10mMTris(pH8.8)和l(M咅體積的100mM三乙胺(pH11.2),最后，柱用lOmMTris(pH7.5)洗滌直到pH值達到7.5。1:3稀釋到10mMTris(pH7.5)中的患者的抗體在4。C緩慢通過含樹脂的柱7次。然后用10倍體積的10mMTris(pH7.5)洗滌柱子，最后用100mM甘氨酸(pH2.5)洗脫抗體，并立即中和。通過ELISA分析級分的針對gpl20的反應性。特別地，用重懸浮在25mlPBS中的lOOng的抗原包被每個孔，隨后平板在4'C孵育過夜。類似地，用對照抗原牛血清白蛋白(BSA-#A7030-Sigma,St.Louis,MO)包被一些孔。未結(jié)合到平板的過量的抗原然后通過用蒸餾水的一系列洗滌來除去。平板用PBS/1。/。BSA封閉，在37。C孵育1小時。然后添加所描述的每個純化的級分的分步稀釋物(從l:IOO到1:6400)，容許與抗原在37。C孵育2小時。在用PBS/0.05%Tween20的一輪10次洗滌之后，針對人類IgGs的Fc部分的、40pl的在PBS/1%BSA中1:700稀釋的辣根過氧化酶結(jié)合的山羊多克隆抗體溶液(Sigma,St.Louis,MO)添加到每個孔中。在37。C孵育1小時之后，進行用PBS-Tween的另一個10次洗滌。然后向孔添加酶底物(OPD-o-苯二胺-Sigma)，通過在450nmO.D.讀取的分光光度計檢測信號，與BSA值小心地比較gpl20值。含有抗gpl20抗體的級分組合到單個制品中，通過超濾來濃縮。通過分析純化的抗體與抗原的反應性來證明沒有污染抗體，針對所述抗原的抗體在制備之前存在于患者的血清中(單純性皰滲病毒和風療病毒抗原)。為此，用兩種病毒(ATCC#VR-733;ATCC#VR-553)感染Vero細胞(ATCC#CCL-81)。在37。C孵育6天后，收集感染的細胞(和未感染的Vero細胞作為陰性對照)。細胞團然后重懸浮到250jal的裂解緩沖液(50mMTris-HClpH8,150mMNaCl;0.02。/c)疊氮化鈉；0.5%Triton-X)中，在冰上孵育20分鐘，在4°C12000g離心2分鐘。然后通過利用商業(yè)上可獲得的試劑盒(BCATM蛋白測定試劑盒-Pierce,Rockford,Illinois)計算上清液中的蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)早先對gpl20描述的方案，300ng的蛋白質(zhì)提取物然后用于包被ELISA平^反孔。Fab片段的產(chǎn)生來自純化的抗gpl20IgGs的Fab片段通過利用PierceImmunoPureFab制備試劑盒(Pierce,Rockford,IL)根據(jù)廠家提供的說明來產(chǎn)生。通過這個實驗獲得的人類Fabs(稱為RBlFabs)用于免疫小鼠和用于下文進一步描述的某些ELISA分析。小鼠抗獨特型單克隆抗體(mAbs)的產(chǎn)生雌性4-6周齡BALB/c小鼠(CharlesRiverCorporate,Wilmington,MA)通過一周一次腹膜內(nèi)注射0.5ml含約50純化的人類Fabs(RBlFabs)的PBS與等體積的不完全弗氏佐劑(Gibco)重復三次來免疫。這3次施用之后是另外3次一周一次地、通過腹膜內(nèi)途徑、但沒有不完全佐劑的施用。在開始方案之前，以及在這種免疫進度之后，抽取血液，通過ELISA評估每個動物的對來自HIV血清陰性患者的血清的純化的IgGs的Fabs的抗體反應。簡要地，通過用300ng的Fabs包被反應孔，如對先前的ELISAs所描述的進行分析。然后從每個動物的免疫前的血清和免疫方案后抽取的血清制備分步稀釋物(從1:100到1:6400)。然后通過針對小鼠抗體的Fc部分的山羊抗體的多克隆制品(Sigma,St.Louis，MO)檢測結(jié)合于不同制品的小鼠抗體。在滿意的反應的情況下(免疫血清l:1600稀釋物的0.D.450超過用免疫前血清獲得的值至少>1.5),然后在處死動物用于融合之前3天進行最后的抗原接種。小鼠單克隆抗體的產(chǎn)生小鼠單克隆抗體的產(chǎn)生通過利用具有新的修改的已描述的方法(R.Burioni,doctoralthesis,1993)來進行。簡要地，來自小鼠NS-1骨髓瘤細胞系(ECACC#85011427)的細胞用作融合伴倡。細胞以及來自它們的雜交瘤在補充有20%完全失活的胎牛血清(Flow)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。兩種培養(yǎng)基用于融合。第一種，稱為融合培養(yǎng)基，用5ml的EMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)、0.75ml的二甲亞石風和4.75ml的PEG1540來制備。另外，用375.5ml的RPMI-1640培養(yǎng)基、100ml的完全滅活的胎牛血清、13,5ml的7%石友酸氬鈉和5ml的100xHAT溶液(Ipoxantine1.36mg/ml，胸腺嘧啶核苷0.388mg/ml,氨基喋呤-不存在于HT培養(yǎng)基中-0.019mg/ml)制備HAT和HT選擇培養(yǎng)基。青霉素(100mIU/ml)、鏈霉素(100pg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM終濃度)和兩性霉素B(100|ag/ml)也添加到培養(yǎng)基中。免疫進度計劃的最后的接種之后三天，通過頸部脫臼殺死小鼠，在無菌條件下取出它們的脾臟。洗滌脾臟，利用注射器針頭將它們解離成小塊。脾細胞然后從連接的纖維隔壁上分離，容許后者在相同無菌罩子下在試管中沉淀數(shù)分鐘。脾細胞重懸浮在EMEM培養(yǎng)基中，通過離心(1500rpm10，)來洗滌，重懸浮在補充有青霉素和鏈霉素的EMEM培養(yǎng)基中。同時，NS-1骨髓瘤細胞在培養(yǎng)物中生長2天，從約500,000個細胞的初始接種物開始。細胞然后通過離心(1500rpm10，)在EMEM培養(yǎng)基中洗滌，再次懸浮在補充有青霉素和鏈霉素的EMEM中。兩種細胞團(一種由脾細胞組成，另一種是通過培養(yǎng)獲得的骨髓瘤細胞)最后重懸浮在10ml的EMEM培養(yǎng)基中，組合到單個試管中，在1500rpm離心10，，獲得的團粒由脾細胞和骨髓瘤細胞系組成。立即地，在1分鐘內(nèi)，細胞輕輕地重懸浮在1ml的融合培養(yǎng)基中，在接下來的3分鐘內(nèi)向其中添加5ml的EMEM培養(yǎng)基。在隨后的3分鐘內(nèi)，添加7ml含有20%完全抑制的胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基。細胞進行離心(1200rpm15，)，團粒重懸浮到10ml的HAT培養(yǎng)基中，然后稀釋到200ml的相同培養(yǎng)基中。在含有5%(302的受控空氣室中在36.5。C孵育1小時之后，細胞懸浮物分配到10個96孔微量滴定平板(NUNC)中，200(xl每個孔，在上述相同的房間中孵育。在隨后數(shù)天觀察含有來自融合物的細胞的平板，來評估雜交瘤的可能的生長。在生長的情況下，通過ELISA評估細胞培養(yǎng)物上清液的抗體的存在。然后通過限制性稀釋克隆雜交瘤，擴增并部分維持在液氮中。通過ELISA(在所述方案之后)展現(xiàn)了針對來自HIV血清陰性患者的血清的Fab制品的反應性的克隆被立即丟棄。帔證明對獲自血清陰性患者的血清的制品陰性的克隆，分析它們對從血清陽性患者純化21的抗gpl20IgG制品的反應性。通過使用其Fab片段作為抗原對于這種反應性為陽性的克隆在ELISA中分析，并用于小鼠免疫(RB1Fabs)。能夠與后一制品(RB1Fabs)反應的小鼠單克隆抗體通過利用MontagePROSEP-A柱(Fisher)根據(jù)廠家的指導來純化。最后，純化和濃縮的抗體，通過修改已經(jīng)描述的小鼠抗體方法(Bugli等，J.Virol.2001),也就是說，通過使用特異性針對小鼠Fab的保守區(qū)域的、過氧化酶結(jié)合的山羊多克隆抗體(Sigma,St.Louis,MO),在抑制ELISA實驗中評估它們抑制來自患者血清的抗gpl20純化Fabs(RBlFabs)與抗原本身(gpl20)結(jié)合的能力。與純化的人類Fabs(RBlFabs)反應的抗體克隆中的兩種被鑒定為也能夠抑制純化的Fabs(RBlFabs)和gpl20之間的結(jié)合。這些克隆^皮稱為Mabl和Mab2。對于從培養(yǎng)的細胞制備Fab片段，提取mRNA,編碼作為Fab的部分的輕鏈和重鏈部分的cDNAs通過所描述的方法來擴增(CSHpress,Phagedisplaymanual,ed.D.R.Burton，p.Al.lO)，這些cDNAs然后一起克隆到已經(jīng)描述的稱為RBCaf的表達載體中(Burioni等，J.Imm.Meth,1988)。簡要地，編碼每個Fab的重鏈的基因(擴增的DNA)用限制性酶IAo/和6^/(Roche)在37。C消化1.5小時，隨后連接到重鏈的載體的克隆位點，隨后用相同的酶消化。另外，輕鏈(擴增的DNA)用酶Sgc/和Z6a/(Roche)消化，然后克隆到類似消化的載體中。由此為2個克隆的每一個獲得的重組構建體然后用于根據(jù)利用0.2cm試管的標準化的方案電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlBlue菌林(通過在甘油中冷洗滌變?yōu)楦惺軕B(tài))(電壓2500V;電容25pF;電阻200Q)。通過克隆到RBCaf中獲得單克隆Fabs的ELISA評估用RBCaf構建體轉(zhuǎn)化的細菌克隆接種到分別含有50pg/ml和10|ag/ml的氨千西林和四環(huán)素的10mlSB培養(yǎng)基中，在37。C搖動生長直到O.D.600:1。接著，特定的誘導物(IPTG-異丙基(3-D-硫代半乳糖苷)以lmM的終濃度添加，培養(yǎng)物保持在30。C搖動過夜。細胞通過熱激來裂解(分別在-80。C和37。C的3輪凍-融)，然后離心以從含F(xiàn)ab的上清液分離細胞碎片。獲得的溶解的Fabs通過ELISA分析。96孔孩i量滴定平板(NUNC)用RB1純化的Fabs(300ng每孑L)和作為陰性對照抗原的BSA來包被，在4。C孵育過夜。在除去未結(jié)合的抗原之后，平板用PBS洗滌5次，用含3%白蛋白的PBS在37。C封閉非特異性結(jié)合位點l小時。在除去封閉溶液之后，添加如上述處理的并含有可溶Fabs的細胞培養(yǎng)上清液。這之后是37。C孵育2小時的步驟。用PBS/0.05%Tween20的一輪10次洗滌之后，添加針對小鼠Fabs的、40pi的在PBS/1%BSA中1:700稀釋的辣根過氧化酶結(jié)合的山羊免疫球蛋白(Sigma)的多克隆制品。在37。C孵育1小時以及進一步的IO次洗滌之后，向孔添加底物(OPD-o-苯二胺)。平板在暗處在室溫下孵育30分鐘。用1N硫酸終止反應，通過450nm讀取的分光光度計評估光密度。在克隆結(jié)束時，如剛才描述的對每個單克隆抗體分析了40個重組細菌克隆，對于它們的每一個，選擇能產(chǎn)生能夠結(jié)合純化的人類Fabs(RBlFabs)的小鼠Fabs的克隆。接下來，分析了這些選定克隆，稱為Pomonal和Pomona2(Pl和P2)的輕4連可變部分和重t連可變部分DNA序列。這些序列是在序列表小節(jié)中提供的那些。P1和P2Fabs的純化然后通過含G蛋白(2mg/ml)的瓊脂糖樹脂填充的柱，免疫親和地純化Pl和P2Fabs,所述柱上共價結(jié)合了山羊抗小鼠Fab抗體多克隆制品(PIERCE,Illinois)。簡要地，每個克隆的菌落接種到分別含有50pg/ml和10|ig/ml氨千西林和四環(huán)素的10ml的SB培養(yǎng)基中。在37。C生長過夜的培養(yǎng)物，繼代接種到具有補充有與先前相同濃度抗生素的500mlSB的燒瓶中。隨后用1mMIPTG誘導的細胞在30。C搖動過夜。培養(yǎng)物在5000rpm離心25分鐘，懸浮在PBS中的團粒被超聲化。隨后在18，000rpm離心25分鐘是除去細胞碎片所需的，過濾上清液，然后緩慢地通過先前描述的瓊脂糖柱。然后，樹脂用10倍體積的PBS洗滌，最終結(jié)合的Fabs用酸溶液(洗脫緩沖液-H20/HClpH2.2)洗脫，收集的級分用適當?shù)娜芤?TrislMpH9)中和。收集的級分通過超濾(Centricon,Millipore)來濃縮。純化的級分的純度通過在12%十二烷基硫酸鈉/聚丙埽酰胺凝膠(SDS-PAGE)上跑等分量來評估。最終，這種純化的Fabs的分步稀釋物通過先前描述的ELISA來分析。針對HCVE2糖蛋白的單克隆Fab制品(e8;e20;el37;e509;Burioni等，Hepatology,1998)被包括在每個平板中作為陰性對照。獲得的結(jié)果在附圖1中公開，其中報道了與單克隆P1和P2Fabs相關的平均光密度值(帶有它們的相對標準差)。所有報道的數(shù)據(jù)是通過在3個不同的時間進行的ELISA實驗產(chǎn)生的，其中每個稀釋度點重復雙份。這些數(shù)據(jù)顯示了Pl和P2Fabs針對FabRBl制品的高度反應性，此外，這些Fabs不能結(jié)合特征為對FabRBl的不同結(jié)合特異性的人類Fabs組。即使在最高濃度(30pg/ml)下，實際上，兩種小鼠Fabs不能以不同的結(jié)合特異性識別Fab制品；實際上，在所有的實驗中，產(chǎn)生的O.D.450值是0.5或更低，而對于用RB1制品檢測的值高于2.5。此外，兩種Fabs都被證明能夠甚至在實驗中使用的最低濃度(0.5fig/ml)下識別RB1制品。獲得的抗獨特型分子在動物模型中刺激特異性抗gp120反應的能力的評估如上文描述獲得的Pl和P2分子被用于免疫除小鼠外的動物模型，以評估它們刺激特異性抗HlV/gpl20反應的能力。特別的，使用了站,性4-5周齡新西蘭兔(AllevamentoBettinardi,Novara,Italy)，重量在2.3到2.5kg之間。動物(每組6只)分成三組-A組用抗P1獨特型Fab免疫的動物；-B組用抗P2獨特型Fab免疫的動物；-C組用沒有抗獨特型特征的對照Fab(J01)免疫的動物。在開始免疫方案前兩周，從每只動物的耳中動脈抽取最大達5ml的血液，以獲得免疫前的血清。200嗎每種抗原，重懸浮在最大500pl生理溶液和500(al佐劑溶液中，然后，在接種位點的適當?shù)南緶蕚渲?，在背部通過多次注射(最大10次)以三周的間隔施用。每種免疫親和純化的抗原的純度通過SDS-PAGE來評估。此外，在用佐劑乳化之前，每種抗原溶液首先通過0.2ixm濾器過濾。在第三次免疫后2周，從每只動物抽取最大5ml血液，以通過ELISA評估體液反應。使用與先前段落中公開的類似的方法，用50ng/孔的gpl20(HIVIIIB)包被ELISA平板，在4""C過夜。第二天，通過用生理溶液洗滌來除去未結(jié)合的抗原。然后用PBS/1%BSA溶液封閉每個孔的非特異性位點，在37。C將平板保持孵育1小時。然后將來自每只動物的免疫前和免疫后(在3次免疫后)的血清的分步稀釋物添加到孔中，在37。C孵育1.5小時。用PBS/0.05%Tween20溶液自動化地洗滌平板5次，然后用合適稀釋度的辣根過氧化酶結(jié)合的抗兔Ig多克隆(Pierce)檢測與抗原結(jié)合的抗體。在37。C孵育又一小時、隨后另外5次洗滌之后，如先前描述地讀取獲得的信號。獲得的結(jié)果在附圖2中公開，其中報告了屬于三個不同的免疫組的兔子中刺激的抗gpl20反應的平均值(和它們相應的標準差)。報道的數(shù)據(jù)與ELISA實-驗相關，所述ELISA實-瞼對于每個稀釋點在三個不同的時間一式兩份地重復。對于這個數(shù)據(jù)系列，證明的是兩種抗體都能夠在實驗動物中引發(fā)抗gpl20免疫反應，從而結(jié)論是在疫苗應用中是潛在有用的分子。還在高血清稀釋度(l:1600)下證明了反應，平均O.D.450nm提高在用Pl免疫的動物的情況下高于1,在P2的情況下約0.5。從用抗獨特型免疫的組獲得的數(shù)據(jù)、與用小鼠對照抗體(JO-l)免疫的組獲得的數(shù)據(jù)之間的比較，也容許驗證結(jié)果的統(tǒng)計學有效性。特別的，通過將未配對數(shù)據(jù)的非參數(shù)測試(Mann-Whitney測試)應用于研究，可能的是展現(xiàn)出，從3個動物組獲得的結(jié)果的分布不全是偶然的，由每種情況中低于0.05的p值所證明。此外，在最高血清稀釋度(1/800和1/1600)下顯著性提高，p值低于0.01。除了確認在最小數(shù)量的動物上進行的這個實驗的統(tǒng)計學有效性之外，后者的數(shù)椐證實了觀察到的現(xiàn)象的特異性。用單克隆抗獨特型抗體先前免疫的兔子的gpl20免疫在用Pl、P2和J01二次強化之后六周，分別屬于A、B和C組的兔子用gpl20免疫。重懸浮在500^1生理溶液和500[xl不完全弗氏佐劑(Gibco)中的200(xg抗原根據(jù)與先前描述的相同的方式來施用。在免疫后兩周，/人每只動物抽取約5ml血液以通過ELISA評估抗gpl20體液反應，利用與先前描述的類似的方法。數(shù)據(jù)通過對每個稀釋度點在三個不同的時間一式兩份重復的ELISA實驗來獲得。數(shù)據(jù)在附圖3中呈現(xiàn)，其中報告了屬于3個不同的免疫組的兔子中刺激的抗gpl20反應的平均值(帶有它們相應的標準差)，顯示了在首次免疫后3個兔子組響應gpl20，還指出了與用J01免疫的兔子組相比，在用Pl和P2免疫的兔子組中存在更大的反應。這些數(shù)據(jù)表明，與暴露于對照抗原的動物相比，暴露于Pl和P2的動物能夠產(chǎn)生25更有效的針對gpl20的免疫反應。來自用單克隆抗獨特型抗體免疫的兔子的血清的中和活性的評值通過利用U87.CD4細胞(CXCR4)(NIHAIDSieean^&i^age"http://Vogram)，一種在其表面表達CXCR4共同受體的人類粘附畫生長神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，進行中和實驗。具有丙酮酸鈉和L-谷氨酰胺(EuroClone)、補充有300jag/mlG418(GIBCO)、1(ag/ml嘌呤霉素(Sigma)和10%完全滅活的胎牛血清(EuroClone)的高葡萄糖DMEM，被用作培養(yǎng)基來維持細胞系。對每只動物評估了免疫前的血清的中和活性，以及在用抗獨特型分子(P1和P2)或用對照抗體(JOl)三次免疫后采集的血清的中和活性。一種屬于IIIB亞型的病毒BH8分離林(GenBank#《020")被用作HIV-1分離林。首先，前述細胞轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定平板(Costar)中，以使每孔具有約8xl()S個細胞。第二天，制備無菌的轉(zhuǎn)移平板(Costar)，在其中病毒與要測試的血清孵育。特別地，含有100TCIDs()的最終載荷的病毒的培養(yǎng)基以及每種血清的1/10最終稀釋物，在56。C完全抑制30分鐘之后，添加到每個孔中。來自HIV陽性患者的人類多克隆制品，已知其能夠中和所討論的HIV-1分離林，被用作實驗的陽性對照。另外，標準免疫球蛋白的制品用作陰性對照。每個單獨的點重復三份，在5%(302空氣中在37。C保持孵育在轉(zhuǎn)移平板中l(wèi)小時。此后，100[xl的含病毒和血清的溶液從轉(zhuǎn)移平板轉(zhuǎn)移到含有細胞的感染平板，再次在5。/。C02空氣中在37。C孵育過夜。此外，僅含有細胞和病毒(100TCID5Q)的用于感染的陽性對照，以及僅含有細胞的用于細胞生存力的對照，以及僅含有細胞和血清的用于毒性的對照，被插入來完成實驗，如所描述的進行處理。第二天，感染平板用無菌PBS洗滌兩次，將如前所述的相同培養(yǎng)基lOOjil添加到每個孔。這樣處理的細胞然后在5%C02空氣中在37°C保持6天。在所述六天的最后，用商業(yè)試劑盒(AbbottAXSYM)測量每孔上清液中產(chǎn)生的p24。對一式三份測試的每個血清計算獲得的p24值的平均值和變異系數(shù)，其然后與含有感染陽性對照的反應孔中一式五份測試獲得的值比較。這樣，可能評估每種血清的中和活性，表示為與對照相比在獲得的p24值方面降低的百分比。免疫前的血清沒有顯示中和活性，與在用小鼠抗體免疫后收集的血清獲得的數(shù)據(jù)相符。特別地，僅僅用抗獨特型分子免疫的動物的血清產(chǎn)生了p24測量值的降低。對于Pl組，實際上，6只動物中的3只展示了對所使用的HIV-1分離林的中和活性，百分比從最小31.5%到最大82.2%。對于用P2抗獨特型免疫的兩只兔子也獲得了類似的數(shù)據(jù)，中和值約30%。中和反應的程度和它在可觀數(shù)量的實驗動物中存在，使得可能推測這些分子在診斷、預防和治療性疫苗實踐中有益的用途。在所獲得的結(jié)果的特異性的確認中，重要的是注意到，除了前述的在免疫前的血清中不存在中和活性之外，用JO-l對照抗體免疫的動物的血清沒有顯示中和活性。每個動物獲得的結(jié)果在下表中總結(jié)。在用相同抗原(Pl或P2)免疫的動物的免疫性％中所見的變異性不是令人驚訝的這僅僅是由于每個獨立的動物對免疫的反應不同。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>動物編號1,14，3,8,9,12:用Pl免疫動物編號17，18，15,20,21，24:用P2免疫動物編號10，16，4，7,5,22:用JOl免疫參考文獻1.BugliF，等JVirol.2001Oct;75(20):9986-902.BurioniR.Doctoralthesis,19933.CarlosF.Barbas,等Phagedisplay.ColdSpringHarborLaboratoryPress;NewYork(p.Al.lO)4.HariharanK,等JVirol.1993Feb;67(2):953-605.BurioniR,等J.Imm.Methods217:195-199(1998)6.BurioniR.,等Hepatology28:810-814(1998)權利要求1.一種抗獨特型單克隆抗體，其具有以下免疫學性質(zhì)-它能夠與人類抗gp120抗體的獨特型特異性地反應，-它能夠抑制gp120抗原和人類抗gp120抗體之間的結(jié)合，以及-它能夠在它被施用于的動物，包括人類中引發(fā)中和抗gp120免疫反應，至少包含輕鏈的可變部分和重鏈的可變部分，特征在于所述輕鏈的可變部分具有SEQIDNO2所確定的氨基酸序列并且所述重鏈的可變部分具有SEQIDNO1所確定的氨基酸序列，或者特征在于所述輕鏈的可變部分具有SEQIDNO4所確定的氨基酸序列并且所述重鏈的可變部分具有SEQIDNO3所確定的氨基酸序列，或者具有以上定義的免疫學性質(zhì)的、所述抗獨特型單克隆抗體的片段或衍生物。2.—種抗獨特型單克隆抗體，其具有以下免疫學性質(zhì)-它能夠與人類抗gpl20抗體的獨特型特異性地反應，-它能夠抑制gpl20抗原和人類抗gpl20抗體之間的結(jié)合，以及-它能夠在它被施用于的動物，包括人類中引發(fā)中和抗gpl20免疫反應，至少包含輕鏈的可變部分和重者連的可變部分，特征在于所述輕鏈的可變部分由SEQIDNO:6所確定的核酸序列編碼并且所述重鏈的可變部分由SEQIDNO:5所確定的核酸序列編碼，或者特征在于所述輕鏈的可變部分由SEQIDNO:8所確定的核酸序列編碼并且所述重鏈的可變部分由SEQIDNO:7所確定的核酸序列編碼。3.根據(jù)權利要求1或2的抗獨特型單克隆抗體，其是完整的免疫球蛋白。4.根據(jù)權利要求1或2的抗獨特型單克隆抗體，其是Fab片段。5.根據(jù)權利要求1或2的抗獨特型單克隆抗體，其是單鏈抗體。6.根據(jù)權利要求1到5的任一項的抗獨特型單克隆抗體，其結(jié)合到載體上。7.—種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的分離的氨基酸序列，或具有以下免疫學性質(zhì)的長度至少8個氨基酸的其片段-它能夠與人類抗gp120抗體的獨特型特異性地反應，匿它能夠抑制gpl20抗原和人類抗gpl20抗體之間的結(jié)合，以及-它能夠在它被施用于的動物，包括人類中引發(fā)中和抗gpl20免疫反應。8.—種選自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的分離的核酸序列。9.一種至少包含根據(jù)權利要求8的核酸序列的表達載體。10.根據(jù)權利要求9的表達載體，其包含SEQIDNO:6和5所確定的核酸序列，或SEQIDNO:7和8所確定的核酸序列。11.一種用根據(jù)權利要求9或10的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。12.—種免疫原性組合物，其包含免疫學有效量的、根據(jù)權利要求1到6的任一項的至少一種中和抗獨特型單克隆抗體，和藥學上可接受的載體和/或稀釋劑和/或佐劑。13.—種試劑盒，其包含根據(jù)權利要求1到6的任一項的抗獨特型單克隆抗體和HIVgpl20抗原，作為用于在針對HIV的治療性或預防性免疫方案中同時地、獨立地或序貫地施用的組合制品。14.根據(jù)權利要求1到6的任一項的抗獨特型單克隆抗體用于制備藥物的用途，所述藥物通過誘導針對HIV的中和免疫反應用于HIV感染或與之相關的疾病的治療性或預防性處理。15.根據(jù)權利要求1-6的任一項的抗獨特型單克隆抗體用作在來自動物受試者、包括人類的生物學樣品中檢測抗HIVgp120抗體或抗體亞群的體外方法中的試劑的用途。16.—種制備適合于HIV感染或與之相關的疾病的預防性或治療性處理的抗獨特型單克隆抗體組的方法，其包括步驟(i)提供人類抗gpl20多克隆抗體的制品，所述抗體是Fabs的形式，所述制品具有廣泛的HIV中和活性；(ii)利用前述步驟的抗gpl20Fabs作為模板，產(chǎn)生能夠與人類抗gp120抗體的獨特型特異性反應的抗獨特型單克隆抗體組；和(iii)在前一步驟中獲得的抗獨特型單克隆抗體組內(nèi)選擇能夠抑制gpl20和人類抗gpl20抗體之間的免疫學結(jié)合的抗獨特型單克隆抗體的亞纟且。17.根據(jù)權利要求16的方法，其中用作模板用于產(chǎn)生抗獨特型抗體的抗gpl20Fabs是來自純化的人類抗gpl20IgGs的Fabs。18.根據(jù)權利要求16或17的方法，其中步驟(ii)中產(chǎn)生的所述抗獨特型單克隆抗體是小鼠單克隆抗體。19.根據(jù)權利要求16到18任一項的方法，其中步驟(iii)中提及的所述人類抗gpl20抗體是先前用作模板的人類抗gpl20Fabs。20.—種抗獨特型單克隆抗體組，特征在于它由特異性針對人類抗gpl20抗體的獨特型的抗體組成，以及在于它們能夠抑制gpl20和人類抗gpl20抗體之間的結(jié)合。21.根據(jù)權利要求20的組，其中所述抗獨特型單克隆抗體是小鼠抗體。22.根據(jù)權利要求20或21的組，其中所述抗獨特型單克隆抗體是中和抗體。全文摘要描述了新的抗獨特型單克隆抗體，其能夠與人類抗gp120抗體的獨特型特異性地反應，能夠抑制gp120抗原和人類抗gp120抗體之間的結(jié)合，并且能夠在它們被施用于的動物宿主中引發(fā)中和抗gp120免疫反應。本發(fā)明的抗獨特型單克隆抗體可以根據(jù)它們的輕鏈和重鏈的可變部分的氨基酸序列來確定。此外，公開了獲得抗獨特型單克隆抗體組的方法，在產(chǎn)生前述抗獨特型單克隆抗體的重組DNA過程中可用的表達載體和轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以及這些抗體的治療性、預防性和診斷性用途。文檔編號C07K16/42GK101646691SQ200880003399公開日2010年2月10日申請日期2008年1月29日優(yōu)先權日2007年1月30日發(fā)明者M·克萊門蒂,R·巴里奧尼申請人:波莫納生物科技有限責任公司