本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種抗豬鏈球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬鏈球菌(Streptococcussuis)是主要的豬致病菌之一，其血清型多達35種，從臨床病豬中分離到的鏈球菌中，2型最常見，也是致病力最強的血清型。豬鏈球菌病臨床上主要表現(xiàn)為腦膜炎、淋巴結(jié)膿腫、關(guān)節(jié)炎、化膿性肺炎及敗血癥，在某些特定誘因作用下，發(fā)病豬群死亡率可達到80％。近年來由于商業(yè)豬場中飼養(yǎng)密度不斷增高，豬鏈球菌病呈上升趨勢，常繼發(fā)于某些病毒性疫病或與一些細菌性疾病混合感染，不僅給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失，也嚴重影響著人類公共衛(wèi)生。一直以來人們認為豬鏈球菌是主要的豬致病菌之一，對人的感染僅限于與豬或其產(chǎn)品密切接觸者。然而，近幾年在亞洲國家的幾次流行使人們認識到，豬鏈球菌也是威脅人類生命和健康的主要致病菌之一。隨著耐藥菌株的大量出現(xiàn)和抗生素療效漸失，疫苗免疫接種成為預(yù)防豬鏈球菌病最佳選擇。但目前豬場使用的滅活疫苗或減毒活疫苗并沒有可靠的預(yù)防效果，且由于豬鏈球菌2型血清型復雜，大多數(shù)疫苗在不同血清型之間無交叉保護作用。豬鏈球菌感染不僅造成養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟損失，也嚴重威脅人類健康。目前豬場使用的滅活疫苗或減毒活疫苗并沒有可靠的預(yù)防效果，大多數(shù)在不同血清型之間無交叉保護作用，且安全性差。近年雖涌現(xiàn)出大量潛在的亞單位疫苗，但缺少理想適用的免疫佐劑，因此開發(fā)出高安全性，對多種豬鏈球菌亞型具有交叉保護作用，且具有自身免疫佐劑作用的亞單位疫苗，具有廣闊的市場前景。豬鏈球菌膜蛋白(Sao)大部分暴露于細菌細胞外，易被特異性抗體所識別和結(jié)合。Sao是一個高度保守的膜蛋白，幾乎分布于豬鏈球菌的所有血清型，該蛋白C‐端部分為含有重復序列的可變區(qū)，不同亞型或菌種所含的重復序列不同，但N‐端肽(Sao28‐318)高度保守，其氨基酸組成在35個亞型中完全一致，因此由其誘導產(chǎn)生的抗體對幾乎所有的血清性具有交叉保護作用；但我們用小鼠和豬感染模型評價Sao的保護作用時發(fā)現(xiàn)，Sao免疫所產(chǎn)生的保護作用并不與其所誘導的抗體滴度成正比，而更多的與免疫反應(yīng)類型有關(guān)，如當用QuilA作為免疫佐劑將Sao誘導的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐訲h1反應(yīng)為主時，Sao的保護作用明顯優(yōu)于用Emulsigen作為佐劑時(Th2反應(yīng)為主)的保護作用。這一現(xiàn)象促使我們思考如何在實際應(yīng)用中使Sao能夠誘導機體產(chǎn)生以細胞反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)。最近研究發(fā)現(xiàn)，一種布氏桿菌的外膜脂蛋白(Omp16)，除了具有免疫原性外，還能激活TLR4受體并誘導Th1為主的免疫反應(yīng)，單獨用Omp16免疫即能有效保護動物免受布氏菌的感染。體外實驗發(fā)現(xiàn)，重組Omp1626‐168蛋白能夠引起TLR4依賴的DC表面分子和其分泌的細胞因子改變，Omp1626‐1688激活的DC在與T細胞的聯(lián)合培養(yǎng)中誘導T細胞向Th1反應(yīng)分化。因此，利用生物工程技術(shù)，制備包括Omp1626‐168和Sao28‐318的融合蛋白，從而開發(fā)出具有自身免疫佐劑作用的抗豬鏈球菌感染亞單位疫苗成為可能。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種作為豬鏈球菌病疫苗且具有自身佐劑作用的融合蛋白及其制備和應(yīng)用。利用本發(fā)明的融合蛋白制備的疫苗，可以誘導很強的針對豬鏈球菌的體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答，并能誘導免疫反應(yīng)向Th1偏移，表現(xiàn)出比傳統(tǒng)抗原蛋白更好的有效性和安全性。本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：一種抗豬鏈球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白，所述融合蛋白由位于氨基端的Omp1626‐168肽和位于羧基端的Sao28‐318肽組成，Sao28‐318肽是Sao蛋白分子中暴露于豬鏈球菌細胞外的具有免疫原性且在不同菌種及亞型間高度保守的氨基酸片段，Omp1626‐168肽是Omp16分子中暴露于布魯氏菌細胞外的具有TLR4激活活性、且不含Lipobox(弱毒或完全無毒)的氨基酸片段，Omp1626‐168肽和Sao28‐318肽直接或通過連接肽相連。所述的Sao28‐318肽氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，Omp1626‐168肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。所述融合蛋白的氨基酸序列中Omp1626‐168肽和Sao28‐318肽之間的連接肽的氨基酸序列為GSGGGSGGGGSGS。所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。所述的Sao28‐318肽核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，Omp1626‐168肽的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。所述融合蛋白的氨基酸序列中Omp1626‐168肽和Sao28‐318肽之間的連接肽的核苷酸序列為GGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTAGC。編碼所述的融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。所述的融合蛋白的制備方法，包括用上述的基因序列克隆至原核細胞中進行異源表達，并純化該融合蛋白。具體包括以下步驟：1、引物的設(shè)計合成根據(jù)所述的融合蛋白的基因序列設(shè)計PCR擴增引物上游引物P15’-CGCCCATGGCGGCGTCAAAGAAGAACCT-3’下游引物P25’-CGCCTCGAGCTCTTCATTAGCTATTTGC-3’2、PCR擴增目的片段、純化1)建立PCR反應(yīng)體系：模板2μl2.5mMdNTPs4μl上游引物1μl下游引物1μlExTaq0.5μl10×ExTaqbuffer5μlddH2O36.5μl在PCR熱循環(huán)儀上進行以下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃30Sec，55℃30s，72℃1min進行35個循環(huán)；72℃7min；2)PCR擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果與預(yù)期擴增產(chǎn)物目的片段大小一致，在凝膠成像系統(tǒng)下，用滅菌的手術(shù)刀切下目的片段瓊脂塊；3)PCR產(chǎn)物回收純化用DNA凝膠回收試劑盒回收和純化DNA；3、回收純化后的PCR產(chǎn)物與pET‐28a(+)載體的雙酶切及連接轉(zhuǎn)化1)回收純化后的PCR產(chǎn)物與pET‐28a(+)載體的雙酶切將回收純化好的片段及原核表達載體pET‐28a(+)用NcoI和XhoI雙酶切，37℃酶切2h，用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的片段，酶切體系如下：2)目的片段與表達載體的連接酶切后根據(jù)回收的產(chǎn)物量，計算出應(yīng)加入的相應(yīng)體積，于4℃連接過夜，3)化學轉(zhuǎn)化將10μl連接產(chǎn)物加入到E.coliDH5α感受態(tài)細胞，輕輕混勻，冰浴30min，42℃水浴鍋中90s，再次冰浴3min，加入800μl預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，溫和震蕩復蘇1h，5000rpm離心3min，棄去900μl上清，余液重懸菌體后，取200uL涂布于含0.1％硫酸卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12‐16h；4)鑒定陽性克隆挑取單克隆，37℃100ug/mL卡那霉素陽性LB液體培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)增殖12h，集菌；使用試劑盒提取質(zhì)粒，提取好的重組質(zhì)粒用NcoI和XhoI雙酶切，37℃酶切2h，雙酶切后用0.1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶切鑒定體系如下：10×KBuffer2μlNcoI1μlXhoI1μlddH2O6μlTemplate10μl10×KBuffer2μlNcoI1μl4、目的蛋白誘導表達1)誘導表達將酶切鑒定好的重組質(zhì)粒以熱激法方式轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)中，接種于5mL含有100ug/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中()，37℃過夜震蕩培養(yǎng)，取200uL菌液接種至新鮮配制的10mL含有100ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃200rpm恒溫培養(yǎng)3‐4hOD600≈0.6后，加入IPTG溶液，使其終濃度為1mmol/L，繼續(xù)37℃培養(yǎng)，誘導表達6h；2)上樣和純化將誘導表達好的菌液用50mL的離心管，12000rpm離心2min收集菌體，加入30mLBindingbuffer重懸菌體，于超聲破碎儀破碎細胞，功率400W，工作8s，間隔10s，50次，至菌液變清亮；12000rpm離心10min后，上清用0.45μm微孔濾膜過濾至干凈的50mL離心管中，進行鎳柱親和層析，最終用5mLwashingbuffer洗脫，蛋白分裝凍存于‐80℃?zhèn)溆?。上述的融合蛋白在制備抗豬鏈球菌病且具有自身免疫活性的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明所述豬鏈球菌膜蛋白包括但不限于Sao28‐318，所述布魯氏菌外膜蛋白包括但不限于Omp1626‐168本發(fā)明通過長期而廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，Sao是一個高度保守的膜蛋白，幾乎分布于豬鏈球菌的所有血清型，其N‐端肽(Sao28‐318)高度保守，其氨基酸組成在35個亞型中完全一致，因此由其誘導產(chǎn)生的抗體對幾乎所有的血清性具有交叉保護作用。Sao在豬鏈球菌表面豐度高，且在體內(nèi)感染過程中仍有高表達，使其容易成為特異性免疫的攻擊目標。實驗表明，機體清除像豬鏈球菌這種帶有表面粘多糖的細菌主要靠以Th1反應(yīng)為主的細胞免疫反應(yīng)。布氏桿菌的外膜脂蛋白(Omp16)，能激活TLR4受體并誘導Th1為主的免疫反應(yīng)，單獨用Omp16免疫也能有效保護動物免受布氏菌的感染。故本發(fā)明以Sao的保守區(qū)域為N‐端，設(shè)計新穎的融合蛋白，以解決當前豬鏈球菌病防治難，并提供一種能保護豬鏈球菌感染，并具有自身免疫佐劑作用的新型疫苗。附圖說明圖1為Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318PCR擴增結(jié)果圖；圖中M為DNAMarker，1為Sao28‐318基因目的片段，2為Omp1626‐168/Sao28‐318PCR基因目的片段；圖2為Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果圖；圖中M：DNAMarker，1：pET‐28a(+)‐Sao28‐318雙酶切鑒定，2、pET‐28a(+)‐Omp1626‐168/Sao28‐318雙酶切鑒定；圖3為Sao28‐318和Omp1626‐168/Sao28‐318純化蛋白檢測圖圖中M:蛋白分子量標準，1：Sao28‐318蛋白，2：Omp1626‐168/Sao28‐318蛋白具體實施方式通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。下列實施例中未注明的具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如：J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南等書中所述的條件，或遵照制造廠商所建議的條件?！緦嵤├?】Sao28‐318和Omp1626‐168/Sao28‐318重組蛋白的構(gòu)建1.引物的設(shè)計合成根據(jù)GenBank上已公布的sao28‐318(GenBankGeneID:61969363)、omp1626‐168(GenBankGeneID:333601408)基因序列，經(jīng)過拼接，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成獲得如下序列Omp1626‐168/Sao28‐318，設(shè)計合成兩對引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，引物的序列如下：1)sao28‐318基因PCR擴增引物上游引物P15’-CGCCCATGGCGTCGGCACAAGAAGTAA-3’下游引物P25’-CGCCTCGAGCTCTTCATTAGCTATTTGC-3’2)Omp1626‐168/Sao28‐318基因PCR擴增引物上游引物P15’-CGCCCATGGCGGCGTCAAAGAAGAACCT-3’下游引物P25’-CGCCTCGAGCTCTTCATTAGCTATTTGC-3’2.PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴增目的片段、純化1)建立PCR反應(yīng)體系：模板(Template)2μl2.5mMdNTPs4μl上游引物(F)1μl下游引物(R)1μlExTaq0.5μl10×ExTaqbuffer5μlddH2O36.5μl用移液器將上述組分混勻，在PCR熱循環(huán)儀上進行以下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃30Sec，55℃30s，72℃1min進行35個循環(huán)；72℃7min。2)PCR擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果與預(yù)期擴增產(chǎn)物目的片段大小一致，如圖1所示。在凝膠成像系統(tǒng)下，用滅菌的手術(shù)刀切下目的片段瓊脂塊。3)PCR產(chǎn)物回收純化將PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳后，于紫外燈下切取含有目的片段的凝膠，用DNA凝膠回收試劑盒(DNAGelExtractionKit)回收和純化DNA，具體過程按照說明書進行。3.PCR產(chǎn)物與pET‐28a(+)載體的雙酶切及連接轉(zhuǎn)化1)PCR產(chǎn)物與pET‐28a(+)載體的雙酶切將上述回收好的片段及原核表達載體pET‐28a(+)用NcoI和XhoI雙酶切，37℃酶切2h，用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的片段。酶切體系如下：2)目的片段與表達載體的連接酶切后根據(jù)回收的產(chǎn)物量，計算出應(yīng)加入的相應(yīng)體積，于4℃連接過夜。3)化學轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物(10μl)加入到E.coliDH5α感受態(tài)細胞(天根生化科技有限公司)，輕輕混勻，冰浴30min，42℃水浴鍋中90s，再次冰浴3min，加入800μl預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，溫和震蕩復蘇1h，5000rpm離心3min，棄去900μl上清，余液重懸菌體后，取200uL涂布于含0.1％硫酸卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12‐16h。4)鑒定陽性克隆挑取單克隆，37℃卡那霉素陽性LB液體培養(yǎng)基(100ug/mL)搖菌培養(yǎng)增殖12h，集菌。使用OMEGA試劑盒提取質(zhì)粒，提取好的重組質(zhì)粒用NcoI和XhoI雙酶切，37℃酶切2h，雙酶切后用0.1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖2)酶切鑒定體系如下：10×KBuffer2μlNcoI1μlXhoI1μlddH2O6μlTemplate10μl10×KBuffer2μlNcoI1μl4.目的蛋白誘導表達1)誘導表達將酶切鑒定好的重組質(zhì)粒以熱激法方式轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)中，接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中(卡那霉素100ug/mL)，37℃過夜震蕩培養(yǎng)，取200uL菌液接種至10mL新鮮配制的卡那霉素陽性(卡那霉素100ug/mL)LB培養(yǎng)基中，于37℃200rpm恒溫培養(yǎng)3‐4hOD600≈0.6后，加入IPTG溶液，使其終濃度為1mmol/L，繼續(xù)37℃培養(yǎng)，誘導表達6h，收集菌體，超聲裂解，過Ni柱純化，將純化好的蛋白進行SDS‐PAGE電泳，結(jié)果得到符合目的蛋白大小的純化蛋白，詳見圖3；2)上樣和純化將誘導表達好的菌液用50mL的離心管，12000rpm離心2min收集菌體，加入30mLBindingbuffer重懸菌體，于超聲破碎儀破碎細胞(400W，工作8s，間隔10s，50次)至菌液變清亮。12000rpm離心10min后，上清用0.45μm微孔濾膜過濾至干凈的50mL離心管中，進行鎳柱親和層析，最終用5mLwashingbuffer洗脫，蛋白分裝凍存于‐80℃?zhèn)溆?。【實施?】融合蛋白的抗原性鑒定將上述制備所得的融合蛋白進行SDS‐PAGE后的凝膠用半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，37℃封閉1.5h，加入一抗(二免后采集的小鼠血清稀釋一定倍數(shù))于4℃封閉過夜。將膜用TBST洗滌后加入按1:2000稀釋的二抗羊抗小鼠(IgG‐HRP)，放置于搖床上室溫2h，洗去二抗后用化學發(fā)光底物檢測兩種一抗與融合蛋白的反應(yīng)情況。結(jié)果顯示，在目的蛋白大小的位置出現(xiàn)了相應(yīng)的條帶，表明融合蛋白能與小鼠血清發(fā)生特異反應(yīng)，有良好的免疫原性?！緦嵤├?】融合蛋白Omp1626‐168/Sao28‐318可以誘導較強的體液免疫應(yīng)答融合蛋白誘導的抗體水平檢測采用常規(guī)ELISA檢測免疫小鼠血清中抗Omp1626‐168/Sao28‐318特異性抗體水平。具體地，以人工合成并鑒定正確的Omp1626‐168/Sao28‐318包被96孔酶標板，4℃過夜；用PBST洗板3次，加入封閉液于37℃孵育2h；PBST用洗滌3次，以PBST緩沖液1∶100稀釋被檢血清，37℃孵育1.5h。3次洗板后，加入HPR標記的羊抗鼠IgG-HRP于37℃孵育1h；PBST洗板5次，TMB避光顯色，2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，用酶標儀讀取450nm的OD值，以確定血清抗體水平。結(jié)果顯示融合蛋白Omp1626‐168/Sao28‐318免疫組與Omp1626‐168/Sao28‐318+弗氏佐劑組一樣，可以誘導小鼠產(chǎn)生強烈的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，隨著免疫次數(shù)的增加血清中特異性抗體的水平隨之上升，相比較，Sao28‐318免疫組產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答顯著低于本發(fā)明所公布的融合蛋白Omp1626‐168/Sao28‐318。【實施例4】Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318融合蛋白腹腔免疫小鼠的蛋白疫苗效能的檢測研究2種亞單位疫苗腹腔接種小鼠所產(chǎn)生的免疫效果，驗證對比Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318o兩種蛋白免疫效能。本發(fā)明采用BALB/c小鼠為動物模型。將純化蛋白Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318進行乳化，并將二者分別與等體積的弗氏佐劑進行乳化，制備免疫原。取100只健康雌性BALB/c小白鼠、6周齡、體重16‐18g的SPF級BALB/c小鼠(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)隨機分成5組(對照組，Sao28‐318組，Sao28‐318+弗氏完全佐劑組，Omp1626‐168/Sao28‐318組，Omp1626‐168/Sao28‐318+弗氏完全佐劑組)，腹腔注射，蛋白免疫劑量為50μg/只(100ul)，對照組每只注射100ulPBS。一免后14天進行二免，二免的劑量與一免相同。二免后9天用豬鏈球2型以絕對致死量進行攻毒，攻毒后觀察小鼠死亡情況并記錄數(shù)據(jù)，記錄時間為10d。結(jié)果顯示，Sao28‐318組、sao+弗氏完全佐劑組、Omp1626‐168/Sao28‐318組、Omp1626‐168/Sao28‐318+弗氏完全佐劑組對攻毒菌株的免疫保護率分別為30％、40％、70％、80％。以上說明，Omp1626‐168/Sao28‐318具有對鏈球菌的免疫保護作用，并具有一定的自身佐劑作用。當前第1頁1 2 3