技術(shù)特征：

1.一種抗豬鏈球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由位于氨基端的Omp16_26‐168肽和位于羧基端的Sao_28‐318肽組成，Sao_28‐318肽是Sao蛋白分子中暴露于豬鏈球菌細(xì)胞外的具有免疫原性且在不同菌種及亞型間高度保守的氨基酸片段，Omp16_26‐168肽是Omp16分子中暴露于布魯氏菌細(xì)胞外的具有TLR4激活活性、且不含Lipobox的氨基酸片段，Omp16_26‐168肽和Sao_28‐318肽直接或通過連接肽相連。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Sao_28‐318肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，Omp16_26‐168肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列中Omp16_26‐168肽和Sao_28‐318肽之間的連接肽的氨基酸序列為GSGGGSGGGGSGS。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Sao_28‐318肽核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，Omp16_26‐168肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列中Omp16_26‐168肽和Sao_28‐318肽之間的連接肽的核苷酸序列為GGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTAGC。

7.編碼權(quán)利要求1‐6任一項所述的融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

8.權(quán)利要求1‐6任一項所述的融合蛋白的制備方法，包括用權(quán)利要求7所述的基因序列克隆至原核細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，并純化該融合蛋白。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

一、引物的設(shè)計合成

根據(jù)所述的融合蛋白的基因序列設(shè)計PCR擴(kuò)增引物

上游引物P1

5’-CGCCCATGGCGGCGTCAAAGAAGAACCT-3’

下游引物P2

5’-CGCCTCGAGCTCTTCATTAGCTATTTGC-3’

二、PCR擴(kuò)增目的片段、純化

1)建立PCR反應(yīng)體系：

在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃30Sec，55℃30s，72℃1min進(jìn)行35個循環(huán)；72℃7min；

2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段大小一致，在凝膠成像系統(tǒng)下，用滅菌的手術(shù)刀切下目的片段瓊脂塊；

3)PCR產(chǎn)物回收純化

用DNA凝膠回收試劑盒回收和純化DNA；

三、回收純化后的PCR產(chǎn)物與pET‐28a(+)載體的雙酶切及連接轉(zhuǎn)化

1)回收純化后的PCR產(chǎn)物與pET‐28a(+)載體的雙酶切

將回收純化好的片段及原核表達(dá)載體pET‐28a(+)用NcoI和XhoI雙酶切，37℃酶切2h，用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的片段，

酶切體系如下：

2)目的片段與表達(dá)載體的連接

酶切后根據(jù)回收的產(chǎn)物量，計算出應(yīng)加入的相應(yīng)體積，于4℃連接過夜，

具體的連接體系如下：

3)化學(xué)轉(zhuǎn)化

將10μl連接產(chǎn)物加入到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，冰浴30min，42℃水浴鍋中90s，再次冰浴3min，加入800μl預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，溫和震蕩復(fù)蘇1h，5000rpm離心3min，棄去900μl上清，余液重懸菌體后，取200uL涂布于含0.1％硫酸卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12‐16h；

4)鑒定陽性克隆

挑取單克隆，37℃100ug/mL卡那霉素陽性LB液體培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)增殖12h，集菌；使用試劑盒提取質(zhì)粒，提取好的重組質(zhì)粒用NcoI和XhoI雙酶切，37℃酶切2h，雙酶切后用0.1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，

酶切鑒定體系如下：

四、目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

1)誘導(dǎo)表達(dá)

將酶切鑒定好的重組質(zhì)粒以熱激法方式轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)中，接種于5mL含有100ug/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜震蕩培養(yǎng)，取200uL菌液接種至新鮮配制的10mL含有100ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃200rpm恒溫培養(yǎng)3‐4h OD₆₀₀≈0.6后，加入IPTG溶液，使其終濃度為1mmol/L，繼續(xù)37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)6h；

2)上樣和純化

將誘導(dǎo)表達(dá)好的菌液用50mL的離心管，12000rpm離心2min收集菌體，加入30mL Binding buffer重懸菌體，于超聲破碎儀破碎細(xì)胞，功率400W，工作8s，間隔10s，50次，至菌液變清亮；12000rpm離心10min后，上清用0.45μm微孔濾膜過濾至干凈的50mL離心管中，進(jìn)行鎳柱親和層析，最終用5mL washing buffer洗脫，蛋白分裝凍存于‐80℃?zhèn)溆谩?/p>

10.權(quán)利要求1‐6任一項所述的融合蛋白在制備抗豬鏈球菌病且具有自身免疫活性的疫苗中的應(yīng)用。