本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種單鏈抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當今，抗體的應(yīng)用越來越廣泛，包括檢測相關(guān)抗原表達、阻斷相應(yīng)抗原、術(shù)中成像、生產(chǎn)靶向藥物等。工業(yè)上抗體的生產(chǎn)主要依靠純化分泌相應(yīng)抗體的雜交瘤細胞的上清液，但由于相應(yīng)抗體的雜交瘤細胞并不容易獲取，所以這種方法很難推廣。利用基因工程手段，使細胞表達相應(yīng)抗體的重鏈和輕鏈，經(jīng)細胞自行組裝分泌后，純化上清液的提取方法，相對容易推廣，但因涉及重鏈和輕鏈兩條氨基酸鏈的表達和組裝，效率較低，程序繁瑣。另一方面，隨著抗體在體內(nèi)應(yīng)用的增多，如何在保持其功能和穩(wěn)定性的前提下，使其作用更加高效，成為目前的研究熱點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種EGFR單鏈抗體及其應(yīng)用，不僅保持了抗體的功能和穩(wěn)定性，同時，簡化了制備程序和抗體結(jié)構(gòu)，提高了抗體的效能。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
一種EGFR單鏈抗體，其氨基酸序列如SEQIDNo.9所示，堿基序列如SEQIDNo.10所示。
上述EGFR單鏈抗體主要用于醫(yī)療和生物技術(shù)領(lǐng)域，主要用途如下：1、可作為偶聯(lián)示蹤劑用于術(shù)中腫瘤成像；2、作為靶向藥物用于靶向治療；3、作為所結(jié)合靶點的中和性抗體，實現(xiàn)抑制所結(jié)合靶點的功能；4、用于檢測EGFR抗原的表達。
本發(fā)明研發(fā)過程的資金來源為國家國際科技合作專項No.2014DFA31630、黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)No.GA15C108、哈爾濱醫(yī)科大學研究生創(chuàng)新科研項目No.YJSCX2015-20HYD。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
1、提高了抗體生產(chǎn)效率，使單鏈的簡化結(jié)構(gòu)發(fā)揮雙鏈抗體功能；
2、減小了抗體體積，使其易于在體內(nèi)擴散和滲透；
3、保留了抗體的ADCC和CDC功能及抗體的親和性和穩(wěn)定性；
4、保留了抗體通過結(jié)合蛋白A、G、L的純化方式；
5、本發(fā)明以連接EGFR的可變區(qū)序列做成了EGFR抗體，使用短肽將抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)直接相連，前端連接IFNγ分泌信號肽，后端通過IgG1鉸鏈片段與IgG1CH2CH3區(qū)域相連，該結(jié)構(gòu)首次通過IFNγ分泌信號肽引導抗體的分泌，首次提出這種抗體的連接方式。
附圖說明
圖1為EGFR單鏈抗體的連接形式。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍中。
具體實施方式一：本實施方式提供了一種連接EGFR的可變區(qū)序列做成的EGFR抗體，使用短肽將抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)直接相連，前端連接IFNγ分泌信號肽，后端通過IgG1鉸鏈片段與IgG1CH2CH3區(qū)域相連(圖1)，氨基酸序列如SEQIDNo.9所示，堿基序列如SEQIDNo.10所示，其制備方法如下：
(1)將SEQIDNo.10所示堿基序列連接到表達載體(可以是慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、睡美人載體或者瞬時表達載體)；
(2)將哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化上述載體(可用到的細胞包括骨髓瘤細胞，CHO細胞，猴COS細胞，人胚胎腎HEK293細胞等)；
(3)收集細胞培養(yǎng)液上清；
(4)使用蛋白A、G或L對上清液中的抗體進行親和純化；
(5)洗脫單鏈抗體。
本實施方式中，IFNγ分泌信號肽部分用于引導合成的抗體分泌到細胞結(jié)構(gòu)外，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，堿基序列如SEQIDNo.2所示；抗體可變區(qū)可以使這種單鏈抗體發(fā)揮相應(yīng)完整抗體的作用；IgG1鉸鏈片段用于保證單鏈抗體的功能和穩(wěn)定性，其氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，堿基序列如SEQIDNo.4所示；CH2區(qū)和CH3區(qū)用于穩(wěn)定抗體結(jié)構(gòu)，同時便于抗體的純化，CH2區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，堿基序列如SEQIDNo.6所示；CH3區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示，堿基序列如SEQIDNo.8所示。
具體實施方式二：本實施方式提供了一種EGFR單鏈抗體的應(yīng)用，其可以作為偶聯(lián)示蹤劑用于術(shù)中腫瘤成像，具體方法如下：
1、將洗脫的抗體濃縮到10mg/ml的50mM磷酸鉀溶液，pH＝8.5；
2、將IRDye 800CW NHS ester(LI-COR)與單鏈抗體以分子比例2.3：1，于20℃暗室偶聯(lián)2小時；
3、洗脫未偶聯(lián)的染料；
4、調(diào)節(jié)溶質(zhì)為pH＝7的PBS，抗體終濃度為2mg/ml；
5、靜脈注射，熒光顯微鏡觀察腫瘤顯影情況。
具體實施方式三：本實施方式提供了一種EGFR單鏈抗體的應(yīng)用，其可以用于偶聯(lián)藥物做藥物的靶向治療，也可以作為所結(jié)合靶點的中和性抗體，實現(xiàn)抑制所結(jié)合靶點的功能。
具體實施方式四：本實施方式提供了一種EGFR單鏈抗體的應(yīng)用，其可以用于檢測EGFR抗原的表達，該單鏈抗體可用于免疫組化，Western blot等蛋白的定量及定性方法，做為一抗檢測EGFR的表達，該單鏈抗體可偶聯(lián)熒光分子，生物素或被已標記的靶向人IgG1Fc片段的二抗結(jié)合而用于鑒定EGFR的表達。
<110>林志國
<120>一種EGFR單鏈抗體及其應(yīng)用
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