一種利用細菌表面展示系統(tǒng)篩選單鏈抗體的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，設及一種利用細菌表面展示系統(tǒng)篩選單鏈抗體的方 法。
【背景技術】
[0002] 細菌展示技術又稱W細胞內(nèi)膜為基礎的細胞間質(zhì)表達技術（anchored periplasmaexpressiontechnology，APEx)。該技術特點是利用細胞間質(zhì)膜脂蛋白的信號 膚NlpAleader將目的蛋白運送到細菌間質(zhì)腔，而NlpAleader在蛋白質(zhì)跨膜運輸過程中 被逐步降解，剩下的6個氨基酸（CDQSS巧與細胞內(nèi)膜外側(cè)的磯脂層形成脂巧鍵，從而將與 其融合的抗體片段展示于細菌內(nèi)膜外側(cè)。當細菌外膜被溶菌酶消化后成原生質(zhì)球，解育液 中的抗原可進入細菌間質(zhì)與錯定在細胞內(nèi)膜外側(cè)的抗體片段結合，然后將其與巧光標記的 抗體進行共解育，陽性克隆可被流式細胞儀高通量的檢測分離。
[0003]pelBleader為果膠酶基因前導膚，可W引導與其融合的蛋白質(zhì)進入細菌間質(zhì)，并 且在進入間質(zhì)后也被降解完全。其融合的蛋白質(zhì)在間質(zhì)腔中和牟定的具有結合能力的抗體 片段結合。
[0004] 細菌展示技術在篩選抗體方面具有很多優(yōu)勢如；（1)高富集比；（2)高陽性率；（3) 由于反應在溶液狀態(tài)下進行，可克服常規(guī)生物淘洗過程中由于篩選配基固定化而導致的 "親和效應"。應用流式細胞術（FCM)進行篩選可W真正的做到實時監(jiān)測同步跟進，非常直觀 的追蹤抗原表位的甄別情況。此外，該技術相對簡便易行，只要經(jīng)過相應的酶切位點就可W 直接將抗體片段插入到展示載體中，并且經(jīng)過細菌電轉(zhuǎn)化可獲得庫容量高達1〇9~10W的 抗體庫，滿足了抗體篩選對庫容量要求。
[0005] 全世界范圍內(nèi)，只有美國Texas大學于2007年在美國科學院院報上報道了展示 F油抗體庫的展示技術APEx2-hybrid，所利用的宿主菌為E.coliDH10B，但是迄今為止尚 無文獻驗證該方法的可行性和實用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的是提供一種獲得特異于祀標抗原的目標單鏈抗體的編碼基因 的方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的獲得特異于祀標抗原的目標單鏈抗體的編碼基因的方法，具體可 包括如下步驟：
[0008]A)按照包括如下步驟的方法構建由不同待檢測單鏈抗體編碼基因組成的基因編 碼庫：
[0009] (al)根據(jù)已知的抗體框架區(qū)序列，設計并合成用于擴增抗體重鏈可變區(qū)的簡并引 物對1，W及用于擴增抗體輕鏈可變區(qū)的簡并引物對2 ;
[0010] 所述已知的抗體框架區(qū)序列為源自于攜帶所述祀標抗原的微生物的宿主的抗體 框架區(qū)序列；如所述祀標抗原為能夠感染人的己肝病毒的某一蛋白，則所述已知的抗體框 架區(qū)序列為人的抗體框架區(qū)序列；
[0011] (a。采用所述簡并引物1和所述簡并引物對2從初始樣本中分別擴增得到抗體重 鏈可變區(qū)集合和抗體輕鏈可變區(qū)集合；
[0012] 所述初始樣本中含有由不同種抗所述祀標抗原的抗體組成的抗體庫；
[0013] 所述初始樣本可為如下a)或b):
[0014] a)健康個體的組織樣本（如血液等），所述健康個體為免疫了含有所述祀標抗原 或其編碼核酸的疫苗后，激起免疫反應產(chǎn)生相應抗體的健康個體；
[0015] b)患病個體的組織樣品（如血液等），所述患病個體為因攜帶所述祀標抗原的致 病微生物（如病毒、細菌或真菌等）感染所引起的患病個體，且經(jīng)證實已激起免疫反應并產(chǎn) 生抗體。
[0016] 所述抗體重鏈可變區(qū)集合為由不同重鏈可變區(qū)組成的集合；所述輕鏈可變區(qū)集合 為由不同輕鏈可變區(qū)組成的集合；
[0017] 所述簡并引物對1和所述簡并引物對2均既可為一個引物對，也可為多個引物 對。當為多個引物對時，采用所述簡并引物對1中的每個引物對分別對所述初始樣本進行 擴增，擴增所得片段的集合即為所述抗體重鏈可變區(qū)集合；采用所述簡并引物對2中的每 個引物對分別對所述初始樣本進行擴增，擴增所得片段的集合即為所述抗體輕鏈可變區(qū)集 合。
[0018] (a3)將所述抗體重鏈可變區(qū)集合中的不同重鏈可變區(qū)和所述抗體輕鏈可變區(qū)集 合中的不同輕鏈可變區(qū)通過重鏈恒定區(qū)CH1進行隨機連接，獲得由不同待檢測單鏈抗體編 碼基因組成的基因編碼庫；
[0019] 所述重鏈恒定區(qū)CH1為源自于攜帶所述祀標抗原的微生物的宿主的重鏈恒定區(qū) CH1的前15個氨基酸；如所述祀標抗原為能夠感染人的己肝病毒的某一蛋白，則所述重鏈 恒定區(qū)CH1為人的重鏈恒定區(qū)CH1的前15個氨基酸；
[0020] 在本發(fā)明中，所述抗體重鏈可變區(qū)連接于所述重鏈恒定區(qū)CH1的上游；所述抗體 輕鏈可變區(qū)連接于所述重鏈恒定區(qū)CH1的下游。
[0021] B)按照包括如下步驟的方法獲得特異于所述祀標抗原的所述目標單鏈抗體的基 因編碼序列：
[0022] 化1)將所述基因編碼庫中的各待檢測單鏈抗體編碼基因分別與祀標抗原-標簽 蛋白融合基因共同構建于同一表達載體，并使所述待檢測單鏈抗體編碼基因融合于信號膚 1的編碼基因的下游，使所述祀標抗原-標簽蛋白融合基因融合于信號膚2的編碼基因的下 游，獲得重組表達載體庫；所述重組表達載體庫中各載體上均含有所述祀標抗原-標簽蛋 白融合基因和任一種所述待檢測單鏈抗體編碼基因；
[0023] 所述祀標抗原-標簽蛋白融合基因為由所述祀標抗原的編碼基因和所述標簽蛋 白的編碼基因融合而成的融合基因；
[0024] 所述信號膚1為具有如下功能的信號膚；將與其融合的目的蛋白展示于細菌內(nèi)膜 外側(cè)（即將所述與其融合的目的蛋白運送到細菌間質(zhì)腔，并定位于細菌內(nèi)膜外側(cè)）；
[0025] 所述信號膚2為具有如下功能的信號膚；將與其融合的目的蛋白運送到細菌間質(zhì) 腔后自身完全降解，所述目的蛋白游離于所述細菌間質(zhì)腔內(nèi)；
[0026] 所述信號膚1不具有所述信號膚2的W上功能；且所述信號膚2也不具有所述信 號膚1的w上功能。
[0027] 化2)將所述重組表達載體庫中的各重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主細菌，得到重組細菌 庫；所述重組細菌庫中各重組細菌中均含有任一種所述重組表達載體（即在所述重組細菌 庫中，每個所述重組細菌中均只含有一種所述重組表達載體，該一種重組表達載體可為所 述重組表達載體庫中的任一種所述重組表達載體）；
[0028] 化3)培養(yǎng)所述重組細菌庫，誘導所述重組表達載體進行表達，由所述待檢測單 鏈抗體編碼基因編碼所得的待檢測單鏈抗體被展示于所述細菌內(nèi)膜外側(cè)，由所述祀標抗 原-標簽蛋白融合基因編碼所得的祀標抗原-標簽融合蛋白游離于所述細菌間質(zhì)腔內(nèi)；
[0029] 化4)去除所述重組細菌庫中各重組細菌的外膜（如用溶菌酶處理），得到原生質(zhì) 球庫；所述原生質(zhì)球庫中每個原生質(zhì)球上均展示有任一種所述待檢測單鏈抗體，游離于所 述原生質(zhì)球外的所述祀標抗原-標簽融合蛋白能夠被所述待檢測單鏈抗體中的特異性單 鏈抗體所捕獲，形成抗原抗體復合物（而所述原生質(zhì)球表面的非特異性單鏈抗體則不能捕 獲所述祀標抗原）；
[0030] 化5)將所述原生質(zhì)球庫與經(jīng)巧光標記的抗所述標簽蛋白的抗體共同解育，只有表 面形成了所述抗原抗體復合物的原生質(zhì)球能夠被標記上所述巧光，從所述原生質(zhì)球庫中獲 得表面被標記上了所述巧光的原生質(zhì)球（如采用流式細胞儀對所述原生質(zhì)球庫進行流式 分選），記為巧光-原生質(zhì)球；所述巧光-原生質(zhì)球的表面展示的所述待檢測單鏈抗體即為 所述目標單鏈抗體；
[0031] 化6)從所述巧光-原生質(zhì)球中提取質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)入所述宿主細菌，進行所述質(zhì)粒 的擴繁培養(yǎng)，從培養(yǎng)后的細菌中提取所述質(zhì)粒，保種；
[0032] 對所述質(zhì)粒測序后獲得所述目標單鏈抗體的基因編碼序列。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種獲得特異于祀標抗原的目標單鏈抗體的方法，是構建單鏈抗 體庫并從中篩選單鏈抗體的方法。
[0034] 該方法除了包括所述A)步驟和所述B)步驟，在所述B)步驟之后還包括如下步驟 C)；
[003引 C)根據(jù)步驟B)獲得的所述目標單鏈抗體的基因編碼序列，進行蛋白表達，獲得所 述目標單鏈抗體。
[0036] 在本發(fā)明中，所述信號膚1為NlpAleader信號膚；所述信號膚2為pelBleader 信號膚。
[0037] 所述NlpAleader信號膚的編碼基因的序列為序列表中序列1的第5258-5344位； 所述pelBleader信號膚的編碼基因的序列為序列表中序列1的第167-232位。
[0038] 在本發(fā)明中，所述宿主細菌為大腸桿菌；具體為大腸桿菌D冊a。
[0039] 在本發(fā)明中，所述標簽蛋白為Flag蛋白。所述Flag蛋白的氨基酸序列具體為序 列表中序列2所示。
[0040] 在本發(fā)明中，所述巧光的標記物為FITC。
[0041] 在本發(fā)明中，步驟化1)中，所述表達載體具體為地GD載體；所述地GD載體的序列 具體如序列表中序列1所示。
[0042] 在所述方法的步驟化5)中，所述"從所述原生質(zhì)球庫中獲得表面被標記上了所述 巧光的原生質(zhì)球"中，所述"獲得"的方法即可為單輪篩選，也可為多輪（如2-4輪）篩選； 當為多輪篩選時，自第2輪篩選起，每一輪篩選均從前一輪篩選所得的所述原生質(zhì)球中提 取質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)入所述宿主細菌，重復化3)-化5)的步驟。隨著篩選輪數(shù)的增加可W逐漸降 低經(jīng)所述巧光標記的抗所述標簽蛋白的抗體（如FITC標記的Flag抗體）的用量，該樣有 利于篩選到親和力更強的抗體。
[0043] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于獲得特異于祀標抗原的目標單鏈抗體或其 編碼基因的試劑盒。
[0044] 本發(fā)明所提供的用于獲得特異于祀標抗原的目標單鏈抗體或其編碼基因的試劑 盒，可包括表達載體、宿主細菌、經(jīng)巧光標記的抗標簽蛋白的抗體；
[0045] 所述表達載體含有編碼所述信號膚1和所述信號膚2的基因，用于共表達所述待 檢測單鏈抗體和所述祀標抗原-標簽融合蛋白（如所述地GD載體）；
[0046] 所述宿主細菌可為大腸桿菌；具體如大腸桿菌D冊a;
[0047] 所述經(jīng)巧光標記的抗標簽蛋白的抗體可為經(jīng)FITC標記的抗Flag蛋白的抗體。
[0048] 另外，所述試劑盒中還可含有記載有如上所述方法的可讀性載體，如說明書。
[0049] 所述試劑盒在獲得特異于祀標抗原的目標單鏈抗體或其編碼基因中的應用也屬 于本發(fā)明的保護范圍。
[0050] 在本發(fā)明中，所述祀標抗原為源自病原微生物（如病毒、細菌或真菌）的具有抗原 活性的物質(zhì)，如蛋白、多膚、多糖或小分子化合物和載體蛋白的偶聯(lián)物等。
[0051] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述祀標抗原具體為傳染性法氏囊病病毒（IBDV)的 VP2蛋白。所述VP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列4,所述VP2蛋白的編碼基因的序列 為序列表中序列5。所述重鏈恒定區(qū)CH1為雞的重鏈恒定區(qū)CH1的前15個氨基酸。所述雞 的重鏈恒定區(qū)CH1的氨基酸序列為序列表中序列6的第125-139位（對應的編碼基因序列 為序列表中序列7的第373-417位）。所述