織粉末移至預(yù)冷的化pendorf(Ep)管中，加1ml冷TRIzol，反復(fù)吹打， 混勻，冰上放置lOmin，1200化pm，4°C離屯、lOmin。將上清轉(zhuǎn)移至新的化管中，加200y1預(yù) 冷的酪氯仿（酪；氯仿=1 ;5,體積比），劇烈振蕩混勻30sec，1200化pm，4°C離屯、lOmin。取 上清，重復(fù)加入200y1酪氯仿振蕩后離屯、。取上清，加等體積冷異丙醇，-20°C放置15min， 12000巧m，室溫離屯、lOmin。小屯、吸去上清液，將離屯、管倒置，使液體盡量流干。用1ml預(yù)冷 75%己醇，12000巧m，4°C離屯、5min洗漆RNA沉淀，棄上清，重復(fù)3次，室溫干燥。用30y1 滅菌DEPC水溶解RNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[009引S、cDNA的合成
[0094] W步驟二提取的組織總RNA為模板，Oligo(dT)18為引物，參照反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLVRT) 說明書進行cDNA第一條鏈的合成。
[009引反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下；011肖0(扣)181.0^1;總3歴模板5.0^1;06口(：-&0 5. 0y1。70°C水浴中 5min，放置冰上 5min，依次加入；RNasin1. 0y1 ;5XM-MLVRTbuffer 5. 0y1 ;dNTPs5. 0y1;DTT5. 0y1 ;M-MLVRT1. 0y1。42°C7長浴 2h，70°C7長浴 15min，取 1y1產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳上觀察片段大小。
[0096] 四、克隆scFv文庫引物的設(shè)計
[0097] 引物的準確性和高效性是克隆可變區(qū)基因的關(guān)鍵，本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)GenBank 雞抗體框架區(qū)序列，設(shè)計PCR擴增引物用于輕鏈和重鏈可變區(qū)的擴增，并在重鏈可變區(qū)基 因上下游分別加入化ndIII、化eI酶切位點，輕鏈可變區(qū)基因上下游分別加入BamHI、 化0I酶切位點，引物由TaKaRa公司合成。
[0098] 用于擴增重鏈可變區(qū)的引物對：
[009引 HF(重鏈上游）；
[0100] 5' -CCCAAGCTT-GGCCCAGCCGGCCGCCGTGACGTTGGACGAG-3'(下劃線部分依次為酶切 位點HindIII和SfiI的識別序列）；
[010U 皿（重鏈下游）:5' -CTAGCTAGCGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC-3'(下劃線部分為酶 切位點NheI的識別序列）。
[0102] 用于擴增輕鏈可變區(qū)的引物對：
[0103] LF(輕鏈上游）；5' -CGCGGATCCGCGCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC-3'(下劃線部分為 酶切位點BamHI的識別序列）；
[0104] LR(輕鏈下游）； ?！?5' -CCGCTCGAG-GGCCCCCGAGGCCTTMCCTAGGACGGTCAGGG-3'(下劃線部分依次為酶 切位點化0I和SfiI的識別序列）。
[0106] 五、抗體可變區(qū)的PCR擴增
[0107] W步驟S中合成的cDNA為模板，分別W步驟四設(shè)計合成的VH上下游引物和化上 下游引物進行梯度PCR擴增，確定最佳退火溫度。
[0108] PCR反應(yīng)（25y1 體系）如下；10XPCRbuffer2. 5y1;dNTPs2. 0y1 ;模板 1. 0y1 (lOng);上游引物 1. 0y1 (lOpmol/y1);下游引物 1. 0y1 (lOpmol/y1);Taq酶 0. 5yl;(1地2〇 17yl。
[0109] 混勻后進行PCR擴增。循環(huán)參數(shù)為；95°C預(yù)變性5min，95°C變性Imin，梯度退火 溫度為 45°C~60°C(45. 0°C、46. 0°C、47. 5°C、49. 0°C、50. 5°C、52. 0°C、53. 5°C、55. 0°C、 56. 5°C、57. 4°C、58. 9°C、60. 0°C)，退火lmin，72°C延伸lmin，30 個循環(huán)后，72°C延伸lOmin。 另設(shè)陰性對照，其中不加模板，其余成分相同，用滅菌去離子水補齊至相同體積。
[0110] 擴增結(jié)束后，取1y1產(chǎn)物于1 %瓊脂糖凝膠電泳上觀察片段大小和亮度，選擇最 適的退火溫度（重鏈和輕鏈都是55. 0°C)進行抗體可變區(qū)的擴增（反應(yīng)體積為250y1)。PCR反應(yīng)（250yl體系）如下；10XPCRbuffer25yl;dNTPs20yl;模板lOyl(lOng); 上游引物 10y1 (lOpmol/y1);下游引物 10y1 (lOpmol/y1);Taq酶 5y1 ;d地2〇 170y1。 [01U] PCR產(chǎn)物利用普通瓊脂糖凝膠DM回收試劑盒進行純化。其中，VH約37化p，化約 315bp〇
[0112] 六、大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化
[0113] 挑取凍存的大腸桿菌D冊a菌液，于LB固體平板培養(yǎng)基表面劃線，37°C培養(yǎng)過 夜。次日挑取中等大小單一菌落，接種于10mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C、120rpm振蕩培養(yǎng)約 lOh。用接種環(huán)沾取菌液接入10mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C、120巧m振蕩培養(yǎng)約lOh。將上 述已活化的菌種W1/1000的比例接入200mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C、120巧m振蕩培養(yǎng)，當 ODe。。達到0. 35~0. 4之間時，收集菌液至50ml離屯、管中，4°C、3000巧m，離屯、lOmin。棄上 清，加入40~50ml預(yù)冷去離子水重懸菌體，4°C、300化pm，離屯、lOmin，重復(fù)操作一次。棄上 清，加入40~50ml預(yù)冷10% (體積分數(shù)）甘油重懸菌體，4°C、300化pm，離屯、lOmin，重復(fù) 操作一次。吸盡上清，加入少量新鮮預(yù)冷10% (體積分數(shù)）甘油將菌體重懸后分裝，每管 100y1、-80°C凍存?zhèn)溆?。此步驟中用到的所有S角瓶都用濃酸浸泡過，一方面保證絕對干 凈無菌，又可W去除S角瓶內(nèi)壁吸附的離子。
[0114] 每管感受態(tài)細胞加入5ngPUC19標準質(zhì)粒，3kV、25yF、200Q條件下進行電轉(zhuǎn)，加 入400y1LB培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)比，涂布平板，37°C培養(yǎng)12~16h，次日觀察電轉(zhuǎn)化結(jié)果 并計算轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示；轉(zhuǎn)化效率為1. 4X1〇9。
[0115]pTchl-1-scFv文庫的構(gòu)建
[0116]pTchl-1載體為本發(fā)明的發(fā)明人自主設(shè)計的載體（序列12)，其linker序列為雞 的CH1的前15個氨基酸，用于連接著VH和化，CH1前端有化ndIII、化eI酶切位點，后端 有BamHI、化0I酶切位點，便于VH片段和化片段插入。
[0117] 雞的重鏈恒定區(qū)CH1的前15個氨基酸的編碼序列：
[0118] 5，-gcgagccccacatcgcccccccgattgtaccctctatccgcctgt-3,（序列 7 的第 373-417 位）
[0119] 雞的重鏈恒定區(qū)CH1的前15個氨基酸的序列為序列表中序列6的第125-139位。
[0120] 取步驟五獲得的VH膠回收產(chǎn)物與pTchl-1載體進行化ndIII、化eI雙酶切，37°C 水浴化，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將上述酶切產(chǎn)物進行膠回收。將VH及pTchl酶切 片段利用T化igase進行連接。將2y1上述連接產(chǎn)物加入到步驟六制備的大腸桿菌D冊a 感受態(tài)細胞中，進行電轉(zhuǎn)化構(gòu)建VH抗體庫。
[012。 次日，收集所有菌落并提取質(zhì)粒，進行化0I、BamHI雙酶化同時用化0I、BamH I對步驟五獲得的化回收產(chǎn)物進行雙酶切。酶切后進行膠回收，連接并轉(zhuǎn)化步驟六制 備的大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞，涂布平板，37°C過夜培養(yǎng)。收集菌落并提取質(zhì)粒，即為 pTchl-1-scFv文庫。
[0122] 取構(gòu)建的pTchl-1-scFv文庫進行酶切鑒定和PCR鑒定。用HindIII、化eI和 化0I、BamHI對pTchl-1-scFv文庫進行雙酶切。取pTchl-1-scFv文庫質(zhì)粒為模板，分別 使用VH上游引物和化下游引物對VH-Linker-化進行PCR鑒定。
[012引結(jié)果顯示（圖1) ;VH和化已連接上，目的條帶大小為76化P左右。
[0124]八、將抗原連入地GD質(zhì)粒pelBleader下游[01巧]l、Flag-VP2融合基因的獲得
[0126] 設(shè)計克隆傳染性法氏囊病病毒（I抓V)VP2抗原的PCR引物，上游引物加入化eI 酶切位點，下游引物加入Flag序列（核巧酸序列為序列表中序列3所示，編碼序列表中序 列2所示的Flag蛋白）和BamHI酶切位點。
[0127] 傳染性法氏囊病病毒（I抓V)VP2抗原；氨基酸序列為序列表中序列4所示，其編碼 基因如序列表中序列5所不。
[012引 VP2-F;5' -GCTAGCATGACAAACCTGCAAGATC-3' (下劃線部分為MieI的識別序列，其 后的序列為序列表中序列5的第1-19位）；
[0129]VP2-R；
[0130] 5' -GGATCCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC-TGCTCCTGCAATCTTCAGGGGAGAGTTG-3' (下劃線部分為BamHI的識別序列，斜體部分為Flag序列，-后的序列為序列表中序列5的 第 1296-1323 位）。
[0131]WI抓野毒株法氏囊病料為模板，采用引物VP2-F和VP2-R進行PCR擴增。
[013引PCR反應(yīng)（25y1 體系）如下；10XPCRbuffer2. 5y1;dNTPs2. 0y1 ;模板 1. 0y1 (lOng);上游引物 1. 0y1 (lOpmol/y1);下游引物 1. 0y1 (lOpmol/y1);Taq酶 0. 5yl;(1地20 17yl。
[0133] 混勻后進行PCR擴增。循環(huán)參數(shù)為；95°C預(yù)變性5min，95°C變性Imin，梯度退火 溫度為40°C~65°C，退火lmin，72°C延伸lmin，30個循環(huán)后，72°C延伸lOmin。另設(shè)陰性對 照，其中不加模板，其余成分相同，用滅菌去離子水補齊至相同體積。
[0134] 擴增結(jié)束后，取1y1產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳上觀察片段大小和亮度，選擇最 適的退火溫度（62°C)進行VP2抗原基因的擴增，PCR產(chǎn)物利用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試 劑盒進行純化。
[01巧]2、地GD-Flag-VP2重組載體的構(gòu)建
[0136] 地GD載體為本發(fā)明的發(fā)明人自主設(shè)計載體（序列1)，該載體上pelBleader信號 膚編碼基因（序列1的第167-232位）下游有化eI、BamHI酶切位點，便于抗原片段插入。
[0137] 取步驟1獲得的VP2抗原基因膠回收產(chǎn)物與地GD載體進行化el、BamHI雙酶切， 37°C水浴化，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將上述酶切產(chǎn)物進行膠回收。將回收后的VP2 抗原基因及pBGD載體酶切片段利用T化igase進行連接。將2y1上述連接產(chǎn)物加入到步驟 六制備的大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞中，進行轉(zhuǎn)化，次日，挑取單克隆提取質(zhì)粒，進行化el、 BamHI雙酶切鑒定。
[01