本發(fā)明涉及生物免疫技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種全人源抗CD47的全分子IgG抗體，還涉及該全分子IgG抗體的DNA分子、表達載體、宿主細胞和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

巨噬細胞通過吞噬作用從血液中清除病原體和受損或是衰老細胞。細胞表面的CD47可以與巨噬細胞上的信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)相互作用，進而抑制吞噬正常的細胞。CD47是一個廣泛的跨膜糖蛋白表達，含有一個免疫蛋白樣結(jié)構(gòu)域和5個跨膜區(qū),它們構(gòu)成了SIRPα的配體,通過NH2端的可變區(qū)樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合SIRPα。SIRPα主要表達在髓細胞,包括巨噬細胞、粒細胞、髓系樹突狀細胞,肥大細胞,以及它們的前體,包括造血干細胞。SIRPα能夠通過巨噬細胞抑制宿主細胞吞噬作用,SIRPα通過與表達在宿主靶細胞上的CD47結(jié)合形成一個抑制信號，SHP-1可以起負性調(diào)節(jié)的作用。與CD47抑制正常細胞吞噬功能的作用相一致的研究表明,它是在造血干細胞及其母細胞遷移之前的階段暫時性調(diào)節(jié),這些細胞上CD47的水平?jīng)Q定了吞噬的能力?？傊瓹D47是抑制性受體SIRPα的胞外配體，二者結(jié)合通過產(chǎn)生抑制性信號降低巨噬細胞的吞噬活性，從而產(chǎn)生腫瘤的免疫逃逸.

目前國內(nèi)抗CD47的單抗制備技術(shù)大多是鼠源，或者進行基因工程改造后進行表達，但是表達量不高或是制備繁瑣。本專利采用較為先進的基因工程抗體表達系統(tǒng)，并在表達條件上進行了優(yōu)化，獲得了高特異性和CD47結(jié)合的抗體，細胞實驗證明在抗體存在時可以促進巨噬細胞對血液腫瘤細胞的吞噬作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種全人源抗CD47的全分子IgG抗體。

本發(fā)明的目的又在于提供一種編碼上述全人源抗CD47的全分子IgG抗體的DNA分子。

本發(fā)明的目的又在于提供一種含有能編碼上述全人源抗CD47的全分子IgG抗體的DNA分子表達載體。

本發(fā)明的目的又在于提供一種被上述的表達載體所轉(zhuǎn)化的宿主細胞。

本發(fā)明的目的還在于提供上述全人源抗CD47的全分子IgG抗體的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗研究，包括全人源Fab噬菌體抗體庫的篩選，抗CD47特異性抗體的純化，抗CD47全分子抗體IgG的制備、表達及純化，抗CD47全分子抗體IgG的特性分析，最終獲得了一種全人源抗CD47的全分子IgG抗體，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，

(1)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；

且(2)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。

優(yōu)選地，所述的輕鏈可變區(qū)的三個抗原互補區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重鏈可變區(qū)的三個抗原互補區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

本發(fā)明還提出的一種全人源抗CD47的全分子IgG抗體，包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)，所述的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO.11所示，所述的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO.12所示。

本發(fā)明還提出的一種DNA分子，其編碼上述全分子IgG抗體的重鏈或/和輕鏈。

優(yōu)選地，其編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQID NO.1所示，編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提出的一種表達載體，包含有上述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相連的表達調(diào)控序列。

本發(fā)明還提出的一種宿主細胞，被上述的表達載體轉(zhuǎn)化。

優(yōu)選地，該宿主細胞可以是被上述的表達載體轉(zhuǎn)化的293Freestyle細胞。

本發(fā)明還提出的上述全分子IgG抗體在制備與CD47相關(guān)的腫瘤的診斷試劑或治療藥物中的用途。

本發(fā)明通過噬菌體抗體庫技術(shù)篩選到了對CD47具有高度親和力的人源Fab抗體，并獲取了賦予所述抗體優(yōu)異特性的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列，并將所述抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)與含有抗體恒定區(qū)的表達載體連接，最終獲得了具有特異的抗原結(jié)合性和在器官移植動物水平具有較好的抗排異反應(yīng)。

本發(fā)明提供了一種具有高特異性、良好親和力的抗CD47的全分子全人源單克隆抗體。CD47骨髓來源的血液疾病細胞中廣泛表達,而在正常組織中不表達，因此本發(fā)明的抗CD47抗體可應(yīng)用于有關(guān)CD47陽性的腫瘤的診斷、治療中。本發(fā)明以CD47為靶分子，在噬菌體抗體庫技術(shù)的基礎(chǔ)上制備出全分子人源抗體。對制備的人源抗CD47抗體做功能鑒定，顯示該抗體能夠與CD47特異性結(jié)合，體外細胞實驗證實抗體能夠促進巨噬細胞對CD47陽性的血液腫瘤細胞的吞噬作用。

與國內(nèi)現(xiàn)有的抗CD47鼠源單抗相比，本發(fā)明制備的是全人源IgG抗體，而且實驗證明有很好的特異性及能夠明顯增強吞噬細胞對CD47陽性血液腫瘤細胞的吞噬作用。

本發(fā)明人通過在抗CD47抗體存在時檢測骨髓來源的巨噬細胞對人早幼粒白血病細胞HL-60吞噬實驗，結(jié)果證明抗CD47抗體可以明顯增強巨噬細胞的吞噬作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1所得純化全人源抗CD47的全分子IgG抗體的SDS-PAGE檢測結(jié)果；其中1為蛋白分子量標準品，2為抗CD47抗體，3為抗TLR4抗體，4為細胞培養(yǎng)上清，5為流穿；可見使用Pro.A柱純化抗CD47抗體純度高。

圖2為本發(fā)明實施例1所得抗CD47抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測結(jié)果，可見抗CD47抗體與CD47蛋白的結(jié)合能力較強。

圖3為本發(fā)明實施例1所得抗CD47抗體與CD47的免疫印跡鑒定結(jié)果；其中1為抗CD47抗體與CD47陽性的人早幼粒白血病細胞HL-60；2為抗CD47抗體與CD47陰性的大鼠骨髓瘤細胞YB2/0；可見抗體與CD47蛋白有特異性結(jié)合能力。

圖4為本發(fā)明實施例1所得抗CD47抗體的親和力檢測結(jié)果，KD值為3.362×10^-10M。

圖5為本發(fā)明實施例1所得抗CD47抗體促進巨噬細胞吞噬作用的實驗結(jié)果對比圖。實驗結(jié)果顯示抗CD47抗體可以使80％吞噬細胞發(fā)揮吞噬作用。

具體實施方式

下面，通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。

實施例1全人源抗CD47的全分子IgG抗體的制備

1)用CD47抗原在人源Fab噬菌體庫中經(jīng)過六輪“吸附-洗脫-擴增”的富集篩選，獲得抗CD47的Fab抗體，然后通過PCR擴增測序獲得Fab抗體的可變區(qū)序列。

2)根據(jù)已獲得的抗體的重輕鏈可變區(qū)序列，設(shè)計引物。

3)擴增抗CD47抗體重鏈、輕鏈。

以上述制備的人源Fab模板，分別以上述涉及的重鏈和輕鏈的上下游引物擴增全分子人源抗體重鏈、輕鏈基因。

(1)PCR

反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件如下：

(2)2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外下觀察目的條帶，切膠回收。

(3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。

4)雙酶切IgG表達質(zhì)粒

IgG表達質(zhì)粒pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk(購自Invivogen公司)包含IgG1型人源的重鏈和輕鏈(Lambda)恒定區(qū)堿基編碼序列。

(1)pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk模板載體的雙酶切

反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件為：37℃酶切過夜。

(2)1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外下切膠回收。

(3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。

5)Infusion PCR重組表達質(zhì)粒

反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件為：50℃孵育15min。

取5μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，鋪于相應(yīng)抗性的平板上，次日挑克隆送測序。將測序結(jié)果正確的克隆保存菌種并擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。

6)抗CD47抗體的表達

(1)取50μg重組后的重鏈質(zhì)粒于1mL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，取50μg的輕鏈質(zhì)粒于1mL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，取200μL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，將上述三種混合液室溫靜置5min；

(2)然后將兩個質(zhì)?；旌弦夯旌暇鶆蚝螅a加500μL的Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻后直接加入轉(zhuǎn)染試劑293Fectin的混合液，混合均勻后靜置20min。期間處理293F細胞，將293F細胞離心后用293F Expression Medium重懸，然后計數(shù)以及用臺盼藍計算細胞活力比，吸取1×10⁸個細胞于培養(yǎng)瓶中，用293F Expression Medium定容為94mL；

(3)20min結(jié)束后將6mL的DNA、293Fectin的復(fù)合物加入準備好的293F細胞中；

(4)將細胞放在搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件8％CO2，120rmp，37℃，6天后收集細胞上清。

7)抗CD47抗體的純化

將收集的細胞上清用0.22μm的濾膜過濾，同時將平衡液和洗脫液過濾膜。用AKATA純化儀按照Protein A純化的標準步驟純化，以1mL/min的速度上樣，以1.5mL/min的速度洗脫。

結(jié)果成功表達并純化抗CD47抗體。將純化抗CD47抗體進行SDS-PAGE檢測，其結(jié)果如圖1所示。由圖1可知純化的抗體純度很高，且用Pro.A柱純化效果較好。

實施例2抗CD47抗體的功能活性鑒定

1)酶聯(lián)免疫法

用包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)CD47蛋白至2μg/mL包被ELISA96孔板，每孔加入100μL，4℃過夜；PBST(PBS含0.5％Tween20)5％脫脂牛奶-洗滌緩沖液封閉，37℃孵育2h；PBST洗滌5次后，每個孔中加入100μLPA21抗體(2μg/mL起始濃度，14個濃度梯度稀釋)37℃2h；以1：4000稀釋的羊抗人二抗100μL/孔加入到孔內(nèi)，37℃孵育1h；過氧化物酶底物顯色液100μL/孔，室溫下10分鐘后用2M硫酸中止反應(yīng)，上機檢測比色采用雙波長450nm/690nm。

結(jié)果如圖2示所示，由圖2可知：抗CD47抗體能與CD47蛋白起抗原抗體反應(yīng)。

2)Western blot

以不表達CD47蛋白的大鼠骨髓瘤細胞YB2/0為陰性對照，分別將高表達CD47的早幼粒細胞HL-60和不表達CD47蛋白的大鼠骨髓瘤細胞YB2/0進行10％SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，將此膜與2μg/mL PA21抗體室溫孵育1h，1：4000稀釋HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司)和ECL發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司)曝光于凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

結(jié)果如圖3所示：抗CD47抗體與HL-60表達的CD47蛋白有特異性結(jié)合。

3)親和力檢測

根據(jù)CD47的等電點以及按照BiacoreX100control soft的protocol優(yōu)化偶聯(lián)條件，斜率優(yōu)化選擇醋酸鈉作為偶聯(lián)稀釋緩沖液。用此緩沖液稀釋CD47樣品稀釋至25μg/mL后偶聯(lián)到CM5芯片上。預(yù)設(shè)偶聯(lián)水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀釋CD47樣品，稀釋一系列濃度至0nM、5nM、10nM 20nM、40nM、80nM。設(shè)置進樣時間為180s，解離時間10min，再生緩沖液用50mMpH2.2Gly-HCl。按照BiacoreX100control soft的protocol進行上機測試。

親和力檢測結(jié)果如圖4所示，KD值為3.362×10^-10M。

4)抗CD47抗體促進巨噬細胞吞噬作用的實驗

分別將CD47陽性的人早幼粒白血病細胞HL-60和CD47陰性的大鼠骨髓瘤細胞YB2/0用CFSE標記后與小鼠骨髓來源的巨噬細胞以4：1的比例共培養(yǎng)(培養(yǎng)基中含有10μg/mL的抗CD47抗體，同時對照組含有對照抗體)，2h后用熒光顯微鏡觀察計數(shù)每100個吞噬細胞中發(fā)生吞噬作用的細胞數(shù)，實驗重復(fù)三次。

結(jié)果見圖5所示：在抗CD47抗體存在時，巨噬細胞對HL-60細胞的吞噬作用明顯增強，吞噬細胞百分比達到80％，余組未見明顯的吞噬作用。

上述文中M為mol/L的含義。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。