專利名稱：抗體人源化的方法以及由此獲得的人源化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)確定和比較三維結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行抗體人源化的方法，由此獲得的人源化抗體及其在體內(nèi)治療和診斷中的用途。
背景技術(shù)：
在人類中動(dòng)物來(lái)源的單克隆抗體的治療性和診斷性應(yīng)用具有基本禁忌征候，特別是對(duì)于必需重復(fù)給藥的治療方案。具體地，鼠單克隆抗體具有相對(duì)短的半衰期，并且當(dāng)用于人類時(shí)，缺乏一些免疫球蛋白的基本功能特性，如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
另外，如果注射入患者體內(nèi)的話，非人源的單克隆抗體包含免疫原性氨基酸序列。許多研究顯示在注射外源抗體后，受試者產(chǎn)生針對(duì)抗體本身的相當(dāng)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)(稱為HAMA-人抗鼠抗體-反應(yīng))，形成免疫復(fù)合物，藥物動(dòng)力學(xué)改變，產(chǎn)生變應(yīng)性反應(yīng)等，完全消除了它的治療性用途。而且，考慮到在小鼠或在其它哺乳動(dòng)物中為了不同病狀的治療而開發(fā)出來(lái)的不同單克隆抗體(因而對(duì)于人具有抗原性)的生長(zhǎng)數(shù)目，由于交叉反應(yīng)性，也是為了不相關(guān)療法而進(jìn)行的治療可以是無(wú)效的或者甚至是危險(xiǎn)的。盡管所謂嵌合性抗體(可變的鼠區(qū)域連接到人源的恒定區(qū))的生產(chǎn)已經(jīng)產(chǎn)生了一些陽(yáng)性結(jié)果，但仍然余留著顯著的免疫原性問(wèn)題。
在人類治療性應(yīng)用領(lǐng)域人源化抗體相對(duì)于動(dòng)物源的抗體具有至少三種潛在的優(yōu)點(diǎn)。第一，人源的效應(yīng)區(qū)，能夠更好地與人免疫系統(tǒng)的其它部分相互作用，通過(guò)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性，或細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性更加有效地破壞靶細(xì)胞。而且，人免疫系統(tǒng)并不將人源化抗體的構(gòu)架或恒定區(qū)(C)識(shí)別為外源性的，因此相對(duì)于針對(duì)鼠抗體(完全是外來(lái)的)的抗體反應(yīng)和相對(duì)于由嵌合性抗體(部分外來(lái)的)誘導(dǎo)的反應(yīng)，針對(duì)人源化抗體的抗體反應(yīng)得以最小化。
已經(jīng)報(bào)道了注射入人體內(nèi)的鼠抗體比正?？贵w具有短得多的半衰期(Shaw等，1987)。人源化的抗體與天然人抗體具有非常相似的半衰期，這樣就允許更少次數(shù)的給藥和更低的劑量。
人源化作用的基本原理為改變抗原識(shí)別，即CDR結(jié)構(gòu)域，在人免疫球蛋白的環(huán)境中的特異性(“CDR移植”，Winter和Milstein)。已經(jīng)報(bào)道了人源化抗體的幾個(gè)例子，其是為了試圖解決免疫原性的問(wèn)題而生產(chǎn)的(Maeda等，1991；Singer等，1993；Tempest等，1994；Kettleborough等，1991；Hsiao等，1994；Baca等，1997；Leger等，1997；Ellis等，1995；Sato等，1994；Jones等，1986；Benhar等，1994；Sha and Xiang，1994；Shearman等，1991；Rosok等，1996；Gussow&Seemann，1991；Couto等，1994；Kashmiri等，1995；Baker等，1994；Riechmann等，1988；Gorman等，1991；Verhoeyen等，1988；Foote&Winter，1992；Lewis&Crowe，1991；Co等，1991；Co等，1991；Verhoeyen等，1991；Eigenbrot等，1994；Hamilton等，1997；Tempest等，1995；Verhoeyen等，1993；Cook等，1996；Poul等，1995；Co等，1992；Graziano等，1995；Presta等，1993；Hakimi等，1993；Roguska等，1996；Adair等，1994；Sato等，1993；Tempest等，1991；Sato等，1996；Kolbinger等，1993；Zhu和Carter，1995；Sims等，1993；Routledge等，1991；Roguska等，1994；Queen等，1989；Carter等，1992)。
由動(dòng)物(一般是鼠)到人源化的抗體的轉(zhuǎn)錄必需在相反的需求之間妥協(xié)，其解決方法根據(jù)情況而改變。為了使免疫原性最小化，免疫球蛋白將保持盡可能多的可接受的人序列。在任何情況下，為了保持最初的結(jié)合特性，免疫球蛋白構(gòu)架在可接受的人序列中應(yīng)當(dāng)包含足夠數(shù)目的突變以保證CDR區(qū)的構(gòu)象盡可能與供體鼠免疫球蛋白的CDR區(qū)的構(gòu)象相似。作為這些對(duì)立考慮的結(jié)果，相對(duì)于相應(yīng)的鼠抗體對(duì)于許多人源化抗體已經(jīng)報(bào)道了結(jié)合親和性的顯著喪失(Jones等，1986；Shearman等，1991；Kettleborough，1991；German等，1991；Riechmann等，1988)。
當(dāng)前，生產(chǎn)人源化免疫球蛋白的最普遍的方法是基于使用適合的基因組、合成序列，以及cDNA(Reichmann等，1988)。
專利申請(qǐng)EP 592106公開了由嚙齒動(dòng)物進(jìn)行抗體人源化的方法。該方法是基于暴露于待人源化抗體的三維結(jié)構(gòu)的表面上的氨基酸殘基的鑒定，基于對(duì)應(yīng)人抗體相同位置上氨基酸殘基的鑒定，和基于用在人抗體中鑒定的殘基替代嚙齒動(dòng)物抗體序列中鑒定的殘基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的作者建立了以一致性基于結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的途徑，獲得在人體中基本上無(wú)免疫原性的優(yōu)化的人源化形式免疫球蛋白的方法，所述結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)是通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得的，其來(lái)自結(jié)晶學(xué)研究。本發(fā)明的方法允許以適合于治療性制劑并且適合于其它醫(yī)學(xué)和診斷應(yīng)用的形式獲得抗體。
本發(fā)明涉及一種充分建立在結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)上的進(jìn)行人源化第一設(shè)計(jì)階段(通常更易出現(xiàn)誤差)的方法。人源化免疫球蛋白具有在輕鏈和重鏈之間的兩對(duì)異源二聚體，其中至少一條鏈具有一種或多種動(dòng)物來(lái)源的CDRs，功能性結(jié)合到人來(lái)源的構(gòu)架區(qū)片段上。例如，將動(dòng)物來(lái)源的CDRs，與也是動(dòng)物來(lái)源的天然相關(guān)聯(lián)的氨基酸殘基一起，導(dǎo)入人來(lái)源的構(gòu)架區(qū)，以產(chǎn)生能夠結(jié)合各自抗原的人源化免疫球蛋白，其具有與動(dòng)物來(lái)源的原始免疫球蛋白相當(dāng)?shù)挠H和力。
本發(fā)明的方法導(dǎo)致獲得適于治療性和診斷性應(yīng)用的人源化抗體。具體地，獲得了人源化的免疫球蛋白，其源自能夠分別以高度特異性結(jié)合TrkA和NGF的抗TrkA抗體(專利EP 1181318)和抗NGF抗體，壓制配體和接納體之間的相互作用。這些分子可用于治療依賴于NGF/TrkA的腫瘤，慢性疼痛和炎性形式，并且可用于診斷目的，用于體內(nèi)成像，例如，對(duì)TrkA陽(yáng)性腫瘤進(jìn)行成像，或?qū)浊澳X進(jìn)行成像作為阿爾茨海默氏病的早期標(biāo)記。具體地，人源化的抗TrkA抗體在尿道和骨盆區(qū)的炎性形式中發(fā)現(xiàn)有特異性的治療性和診斷性應(yīng)用。具體地，人源化的抗NGF抗體在由HIV病毒誘導(dǎo)的病狀中發(fā)現(xiàn)有特異性的治療性和診斷性應(yīng)用，以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞，如HIV感染的NGF依賴性巨噬細(xì)胞的凋亡。
所以，本發(fā)明的目的是提供已知序列的動(dòng)物抗體的VH和VL可變區(qū)的人源化的方法，包括以下步驟a)如果不是現(xiàn)有的話，獲得動(dòng)物抗體的VH和VL區(qū)的結(jié)晶學(xué)結(jié)構(gòu)；
b)基于和所述動(dòng)物抗體構(gòu)架一級(jí)序列最高水平的同源性和同一性，預(yù)選一系列0-n個(gè)人來(lái)源或人源化抗體的可能的構(gòu)架接納體，以不小于3的分辨率對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性測(cè)定；c)分別進(jìn)行動(dòng)物抗體的VH和VL可變區(qū)與b)中獲得的VH和VL區(qū)之間的結(jié)構(gòu)比較，并且計(jì)算每次比較的RMS，以鑒定具有較小RMS的人來(lái)源的VH區(qū)和VL區(qū)；d)將所述動(dòng)物抗體的CDR區(qū)的序列插入于c)中鑒定的人序列中的合適位置；e)如果必要的話，將c)中鑒定的人VH區(qū)和VL區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基逆向突變。
優(yōu)選地，以重組DNA技術(shù)進(jìn)行抗體的修飾。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述動(dòng)物抗體是抗NGF抗體，優(yōu)選地它是αD11抗體，并且人源化序列基本上具有下列序列VHHumαD11 VH，EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTNNNVNWVRQAPGKGLEWVGGVWAGGATDYNSALKSRFTISRDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSSSTLYAMDAWGQGTLVTVSS，(SEQ ID No.17)和VLHumαD11 Vk，DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNALAWYQQKPGKAPKLLIYNTDTLHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQHYFHYPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID No.18).
在備選的實(shí)施方案中，所述動(dòng)物抗體是抗TrkA抗體，優(yōu)選地它是αMNAC13抗體，并且人源化序列基本上具有下列序列VHHumMNAC13VH，EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWARQAPGKGLEWVAYISKGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDSAVYYCARGAMFGNDFFFPMDRWGQGTLVTVSSA，(SEQ ID No.37)和VLHum MNAC13Vk，DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCHQWSSYPWTFGGGTKVEIK
(SEQ ID No.38)。
本發(fā)明的人源化免疫球蛋白(或保持結(jié)合活性的衍生片段和可以被衍生的其它化合物)能夠通過(guò)已知的重組DNA技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。作為所述人源化免疫球蛋白的隨后使用的功能，可以利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行它們的表達(dá)，優(yōu)選無(wú)限增殖化的真核細(xì)胞(如骨髓瘤或雜交瘤細(xì)胞)，還優(yōu)選原核宿主、昆蟲或植物細(xì)胞。還可以通過(guò)合成獲得得到的人源化免疫球蛋白序列的編碼多核苷酸。
本發(fā)明的人源化免疫球蛋白能夠單獨(dú)或與其它治療劑組合使用。在用作抗腫瘤劑的情況下，化療劑將是優(yōu)選的，其可以根據(jù)藥理學(xué)應(yīng)用(如蒽環(huán)霉素、紫杉醇、順鉑、吉西他濱、非甾類和皮質(zhì)甾類抗炎物，或免疫抑制劑)而變化，以及組合所有目前應(yīng)用于每種具體病狀的治療中的藥物。人源化免疫球蛋白或它們的復(fù)合物能夠以藥理學(xué)上可接受的劑量形式進(jìn)行制備，其根據(jù)給藥類型而變化。
定義在兩種多核苷酸或多肽(分別是人源化免疫球蛋白的編碼DNA序列或人源化免疫球蛋白的氨基酸序列或其部分)的語(yǔ)境中術(shù)語(yǔ)“基本上相同的”指兩種或多種序列，當(dāng)以最大一致性進(jìn)行比較和比對(duì)時(shí)，其在核苷酸或氨基酸殘基上具有最小80％(優(yōu)選90-95％或更多)的同一性。一般，“基本上的同一性”在至少50個(gè)殘基長(zhǎng)的區(qū)域中變化，更加優(yōu)選在至少100個(gè)殘基的區(qū)域上核實(shí)，或者，在最佳的條件中，在超過(guò)150個(gè)殘基或在完整序列上核實(shí)。如下所述，利用Kabat編號(hào)方案，任何兩種序列的抗體都只能以一種方式進(jìn)行比對(duì)。因此，抗體的同一性百分比具有唯一的和明確的含意。成熟免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的氨基酸被稱為Hx和Lx，x為根據(jù)Kabat編號(hào)方案指定氨基酸位置的號(hào)碼，Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda MD，1987，1991)。Kabat測(cè)定了每個(gè)亞組的抗體的氨基酸序列列表以及每個(gè)亞組的每個(gè)位置上最常見的氨基酸列表以便生成共有序列。Kabat利用一種方法將一個(gè)編號(hào)指定給列表中每個(gè)序列的每個(gè)氨基酸并且這種指定每個(gè)殘基的編號(hào)的方法已經(jīng)成為本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法。Kabat方案可以延伸到不存在于他的研究中的其它抗體，基于保守的氨基酸，將目標(biāo)抗體與Kabat鑒定的共有序列之一進(jìn)行比對(duì)。Kabat編號(hào)方案的使用允許輕易地鑒定不同抗體中等同位置上的氨基酸。例如，在人來(lái)源抗體的L10位置上的氨基酸占有在鼠來(lái)源的抗體的L10位置上的氨基酸的等同位置。
眾所周知抗體的基本結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每個(gè)四聚體都由兩對(duì)相同的多肽鏈構(gòu)成，每對(duì)由一條輕鏈(25KDa)和由一條重鏈(50-75KDa)組成。每條鏈的氨基末端區(qū)包括大約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)，其參與抗體識(shí)別。每條鏈的羧基末端區(qū)包含介導(dǎo)效應(yīng)功能的恒定區(qū)。每對(duì)輕鏈和重鏈的可變區(qū)形成抗體的結(jié)合位點(diǎn)。所以，完整的抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、ε，并且它們將抗體的同種型分別定義為IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。在輕鏈和重鏈之內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過(guò)大約12個(gè)或更多氨基酸的″J″區(qū)連接，而只有重鏈包括大約10個(gè)氨基酸的″D″區(qū)(Paul，1993)。
每對(duì)輕鏈和重鏈的可變區(qū)形成抗體的結(jié)合位點(diǎn)。它們的特征是由稱作構(gòu)架(FR)的相對(duì)保守區(qū)域構(gòu)成的相同常規(guī)結(jié)構(gòu)，所述構(gòu)架是由三種稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)連接的(Kabat等，1987；Chothia和Lesk，1987)。通過(guò)構(gòu)架區(qū)對(duì)每對(duì)的兩條鏈的CDRs進(jìn)行比對(duì)，獲得結(jié)合特異性表位的功能。由氨基末端區(qū)起始朝向羧基末端區(qū)，輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域都包含F(xiàn)R和CDR區(qū)的交替更迭FR，CDR，F(xiàn)R，CDR，F(xiàn)R，CDR，F(xiàn)R；因此，重鏈和輕鏈的特征都是三個(gè)CDRs，分別為CDRH1，CDRH2，CDRH3和CDRL1，CDRL2，CDRL3。根據(jù)Kabat(1987和1991)和/或Chothia&Lesk(1987)，Chothia等(1989)的定義將氨基酸指定到每一區(qū)域。
優(yōu)選地，由于保守性氨基酸取代，例示的人源化免疫球蛋白的類似物與原始的免疫球蛋白不同。為了將氨基酸取代分為保守性的或非保守性的，可以將氨基酸進(jìn)行如下分組I組(疏水性側(cè)鏈)M，A，V，L，I；
II組(中性親水性側(cè)鏈)C，S，T，N，Q；III組(酸性側(cè)鏈)D，E；IV組(堿性側(cè)鏈)K，R；V組(影響主鏈定向的殘基)G，P；VI組(芳香族側(cè)鏈)F，Y，W。
保守性氨基酸取代涉及在相同類別的氨基酸之間的取代，而非保守性氨基酸取代則必需是在不同類別成員之間的交換。
術(shù)語(yǔ)“表位”包括能夠以特異性方式結(jié)合免疫球蛋白的每一種蛋白決定簇。一般，表位是由多組大分子的化學(xué)活性表面形成的，所述大分子如氨基酸或糖的側(cè)鏈，并且它們一般具有特異性的化學(xué)-物理和構(gòu)象特性。
術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”指這樣的蛋白質(zhì)，其由一種或多種多肽組成，所述多肽由免疫球蛋白的基因編碼。除了四聚體抗體形式之外，免疫球蛋白能夠以多種形式存在例如，它們包括片段Fv，F(xiàn)ab和F(ab′)以及雙功能雜合抗體(Lanzavecchia等，1987)和單鏈Fv片段(Hood等，1984；Harlow和Lane，1988；Hunkapiller和Hood，1986)。
嵌合性抗體是這樣的抗體，其輕鏈和重鏈基因由屬于不同特種的免疫球蛋白基因區(qū)起始進(jìn)行改造。例如，單克隆小鼠抗體基因的可變區(qū)段(V)可以連接到人來(lái)源抗體的恒定區(qū)段(C)上。所以，治療性的嵌合性抗體是一種雜合蛋白質(zhì)，其由識(shí)別源自小鼠抗體的抗原的結(jié)構(gòu)域V和源自人抗體的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域C組成(盡管可以利用哺乳動(dòng)物物種的其它組合)。
術(shù)語(yǔ)“構(gòu)架”指根據(jù)Kabat的定義，在物種內(nèi)不同免疫球蛋白之間相對(duì)保守的免疫球蛋白的輕鏈和重鏈的可變區(qū)的那些部分(不屬于CDRs)。因此，人構(gòu)架是與天然發(fā)現(xiàn)于人抗體中的構(gòu)架基本上相同(至少85％或更多相同)的構(gòu)架區(qū)。
術(shù)語(yǔ)“人源化免疫球蛋白”指這樣的免疫球蛋白，其包含人構(gòu)架和至少一個(gè)源自非人抗體的CDR，并且其中存在的每個(gè)恒定區(qū)都與人免疫球蛋白區(qū)域基本上相同(至少85％，優(yōu)選至少90-95％相同)。因此，除了CDR之外人源化免疫球蛋白的所有部分都與天然人免疫球蛋白的一種或多種序列的對(duì)應(yīng)區(qū)域基本上相同。例如，由小鼠的可變區(qū)和人來(lái)源的恒定區(qū)構(gòu)成的嵌合性抗體并不包括在人源化免疫球蛋白之中。
發(fā)明詳述所述方法是基于對(duì)體內(nèi)治療性和診斷性目標(biāo)抗體的人源化的高分辨率結(jié)構(gòu)比較。另外，提供人源化的免疫球蛋白，其能夠特異性地針對(duì)各自的抗原(即NGF神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其TrkA接納體)反應(yīng)。人源化的免疫球蛋白具有人來(lái)源的構(gòu)架并且它們具有一個(gè)或多個(gè)源自每種原始免疫球蛋白(即，αD11，一種大鼠免疫球蛋白，特異地針對(duì)NGF和MNAC13反應(yīng)，所述MNAC13為特異性地識(shí)別TrkA的鼠免疫球蛋白)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)。所以，本發(fā)明的免疫球蛋白，其可以輕易地進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，不僅在NGF/TrkA依賴性腫瘤形式的治療中，而且在慢性疼痛和炎性形式的治療中發(fā)現(xiàn)有治療性應(yīng)用。而且，對(duì)于接納體的特異性人源化免疫球蛋白具有另外的診斷性應(yīng)用，以便對(duì)于TrkA陽(yáng)性腫瘤和對(duì)于基底前腦的細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)成像(作為阿爾茨海默氏病的早期標(biāo)記)。
本發(fā)明利用編碼能夠結(jié)合在NGF上和在TrkA上的目標(biāo)表位的輕鏈和/或重鏈CDR區(qū)的DNA重組片段，正如在單克隆抗體αD11和MNAC13(分別是大鼠和小鼠的)中的情形一樣。將這些區(qū)域的編碼DNA片段連接到編碼人來(lái)源的合適構(gòu)架區(qū)的DNA片段上。編碼包含單克隆抗體MNAC13和αD11的輕鏈和重鏈CDRs的多肽鏈的DNA序列分別包括于圖7A，7B和8A，8B中。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并和非關(guān)鍵氨基酸的取代，DNA序列可以輕易地進(jìn)行修飾。而且，DNA片段一般包括額外的表達(dá)控制序列，其可操作性地結(jié)合到人源化免疫球蛋白的編碼序列上并且包含異源或天然關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子的區(qū)域。優(yōu)選地，所述表達(dá)控制序列是載體中具有真核啟動(dòng)子的系統(tǒng)，所述載體能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞，但也能夠使用原核控制序列。一旦將所述載體并入合適的宿主中，就將宿主維持在適合的條件下以確保高水平的表達(dá)。隨后分別以二聚體、完整抗體的形式或者以免疫球蛋白的其它形式對(duì)輕鏈和重鏈進(jìn)行進(jìn)一步純化。
可以通過(guò)公知的方法由多種人細(xì)胞分離人恒定區(qū)的編碼DNA序列，但是優(yōu)選由無(wú)限增殖化的B細(xì)胞起始。本發(fā)明的免疫球蛋白中的CDRs類似地源自分別能夠結(jié)合NGF和TrkA的單克隆抗體αD11和MNAC13以及分別在大鼠和小鼠中的產(chǎn)物。適于表達(dá)和分泌免疫球蛋白的宿主細(xì)胞可以獲自許多來(lái)源，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(細(xì)胞系和雜交瘤的目錄，第五版(1985)Rockville，Maryland，USA)。優(yōu)選地，并入人源化抗體中的CDRs具有對(duì)應(yīng)于αD11和MNAC13的CDRs序列的序列并且能夠包括編碼抗體自身對(duì)應(yīng)氨基酸序列的簡(jiǎn)并核苷酸序列。
一般，人源化設(shè)計(jì)程序是循環(huán)的和反復(fù)的，它包括鼠抗體氨基酸序列的分析；相應(yīng)Fv區(qū)的模型構(gòu)建；人抗體接納體構(gòu)架氨基酸序列的分析和選擇；選定構(gòu)架中推定的逆向突變的鑒定；人源化抗體的設(shè)計(jì)和實(shí)際構(gòu)建；通過(guò)體外和/或體內(nèi)測(cè)定的方式證實(shí)保持的親和性以及結(jié)合的特異性。
如果這些活性被人構(gòu)架消極地影響，將必需改變接納體人抗體的構(gòu)架的選擇，或引入補(bǔ)償性的突變。
即使人構(gòu)架的選擇被視為該循環(huán)的最關(guān)鍵階段，至今尚未建立起通用的規(guī)則。這依賴于這樣的事實(shí)，即各種選擇的優(yōu)點(diǎn)(相對(duì)于在患者中的免疫原性而言)尚未從臨床觀點(diǎn)進(jìn)行精確研究。所以，為了進(jìn)行正確的構(gòu)架選擇，僅有一系列方法是可用的，其必須結(jié)合先前獲得的結(jié)果。
具體地，可能使用固定的構(gòu)架(通常重鏈為NEW而輕鏈為REI，因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)是長(zhǎng)期以來(lái)可用的)。另一種方法提供構(gòu)架的用途，所述構(gòu)架被發(fā)現(xiàn)在序列上與待人源化的抗體最具同源性。有許多數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)檢索同源性人抗體除了供體和接納體序列之間較高的同一性百分比之外，所述選擇一般考慮CDRs的長(zhǎng)度，標(biāo)準(zhǔn)殘基水平上的同一性和界面水平上殘基的同一性。對(duì)于這兩種方法之間的比較，見Graziano等(1995)。
另外，根據(jù)第二種方法的變形，可以由兩種不同的人抗體選擇輕鏈和重鏈，所述兩種不同的人抗體特征為較高的序列同源性。這一方法由Riechmann等(1988)和由Shearman等(1991)提出。在這點(diǎn)上，通常，相對(duì)于源自不同抗體的輕鏈和重鏈，源自相同抗體的輕鏈和重鏈具有較高的正確關(guān)聯(lián)，形成功能性結(jié)合位點(diǎn)的可能性，盡管這兩條鏈之間的界面非常保守的事實(shí)可以同樣確保正確的相互作用。對(duì)于這兩種方法之間的比較，見Roguska等(1996和1996)。
將所述方法限定于源自特定人抗體的構(gòu)架必須承擔(dān)招致軀體突變的危險(xiǎn)，其產(chǎn)生免疫原性的表位，即使所述構(gòu)架是人來(lái)源的。一種備選的方法是使用基于人共有序列的構(gòu)架，其中已經(jīng)消除特應(yīng)性軀體突變。所述兩種方法已經(jīng)進(jìn)行了比較在一個(gè)案例中，沒(méi)有注意到結(jié)合親和力的差異(Kolbinger等，1993)，相反在另一個(gè)案例中所述結(jié)合證明優(yōu)于個(gè)別構(gòu)架的情況(Sato等，1994)。
無(wú)論如何，共有序列自身是人造的，所以，即使它們沒(méi)有特應(yīng)性殘基，它們也能產(chǎn)生免疫原性的非天然基元。備選的方法(Rosok等，1996)是使用在V-BASE數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集的種系人序列。
具有人來(lái)源的構(gòu)架的可變區(qū)的鼠CDR區(qū)的非天然毗連能夠帶來(lái)天然不表現(xiàn)的構(gòu)象限制，其決定了結(jié)合親和性的喪失，除非它們被特定氨基酸殘基的取代所校正。通過(guò)計(jì)算機(jī)建模部分地確定待取代的氨基酸殘基的選擇。硬件和軟件可用于產(chǎn)生免疫球蛋白分子的三維圖像。通常，由已經(jīng)解析了的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或鏈的結(jié)晶學(xué)結(jié)構(gòu)起始來(lái)產(chǎn)生分子模型?；诎被嵯嗨菩詫⒋５逆溑c已解析的三維結(jié)構(gòu)的鏈或結(jié)構(gòu)域相比較，并且將顯示最高序列相似性的鏈或結(jié)構(gòu)域選作分子模型構(gòu)建中的起始點(diǎn)。不過(guò)，抗體結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)并不總是準(zhǔn)確的。具體地，第三個(gè)CDR區(qū)難以建模并且它總是代表抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中的不確定點(diǎn)(Chothia等，1987)。為此原因，通常人源化抗體，作為第一近似值，比起始的單克隆抗體具有小得多的對(duì)抗原的結(jié)合親和性和/或特異性。在以不能完全合理化的反復(fù)試驗(yàn)方法重建起始抗體特性的嘗試中，這需要許多連續(xù)循環(huán)的點(diǎn)突變。
考慮到可用人和人源化抗體的不斷增長(zhǎng)的高分辨率X射線結(jié)構(gòu)數(shù)目，意圖是避免不確定性和不明確性，所述不確定性和不明確性源自計(jì)算機(jī)建模的使用，通過(guò)X射線結(jié)晶學(xué)的方式獲得本發(fā)明的兩種抗體的Fab片段的高分辨率結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。為此目的，兩種抗體都由雜交瘤進(jìn)行純化，以木瓜蛋白酶(一種在重鏈的CH1和CH2結(jié)構(gòu)域之間連接的水平上剪切的蛋白酶)進(jìn)行蛋白酶解處理，其生成Fab片段。作為另外純化的結(jié)果，兩種Fab片段都得以結(jié)晶并且來(lái)自兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(低和高分辨率)，有可能以分子置換法解析所述結(jié)構(gòu)并且隨后精化它們。
由本發(fā)明提出的基于實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的方法，在接納體人抗體的構(gòu)架的選擇的關(guān)鍵階段，以及對(duì)于在兩種中和抗體人源化過(guò)程之中選定構(gòu)架的推定逆向突變的鑒定，都提供了更加堅(jiān)實(shí)和合理得多的起點(diǎn)。
在已報(bào)道的各種能夠指導(dǎo)人抗體構(gòu)架選擇的標(biāo)準(zhǔn)中，所用的是鼠和人來(lái)源抗體在一級(jí)序列上同一性的程度，以基于結(jié)構(gòu)比對(duì)的分析擴(kuò)展和完善其結(jié)果。與原始標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)聯(lián)的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的比較分析保證了精確得多的比較并且因此保證了更大的可能性，即得到的人源化抗體能夠保持原始鼠抗體的親和性和特異性的特性。因此，在同一性程度和同源性水平方面，采用的策略都結(jié)合了源自氨基酸序列分析和比較的信息，比較各自的三維結(jié)構(gòu)。
具體地，源自一級(jí)結(jié)構(gòu)最佳比對(duì)的信息具有雙重作用。第一，這種分析允許減少待比較的可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)目，將其自身限制于特征為高度同源性和同一性的那些。在這些通過(guò)一級(jí)結(jié)構(gòu)水平上的最佳比對(duì)表征的并且其結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)已知的序列中，進(jìn)行進(jìn)一步的選擇，只集中在具有高分辨率或者具有與我們所獲得的結(jié)構(gòu)相當(dāng)?shù)姆直媛?即，不超過(guò)2.5)的經(jīng)解析的結(jié)構(gòu)上。這種方法保證了精確得多的三級(jí)結(jié)構(gòu)的比對(duì)以及顯著得多的結(jié)構(gòu)差異的評(píng)估，所述差異以RMS表示(均方根偏差均方偏差的平方根；Carugo和Pongor，2001和2003)。低分辨率數(shù)據(jù)對(duì)于每個(gè)個(gè)別原子在空間上的實(shí)際相對(duì)位置提供了相當(dāng)指示性的，并且是肯定不太精確的信息。
為了評(píng)定人來(lái)源或改造過(guò)的每種個(gè)別結(jié)構(gòu)的重疊程度，計(jì)算構(gòu)成各個(gè)氨基酸骨架的α碳原子之間的RMS，不考慮具有超過(guò)2的RMS的原子對(duì)。由這種分析，獲得一種信息，因此其必須不僅考慮結(jié)構(gòu)之間的差異(由RMS的值表示)，還要考慮在計(jì)算每個(gè)RMS中實(shí)際采用的α碳原子的百分比。
將這些三級(jí)結(jié)構(gòu)水平相似性數(shù)據(jù)與一級(jí)序列在同一性和同源性上的比較性分析相關(guān)聯(lián)。
因此推論人源化最佳構(gòu)架的選擇為一個(gè)三變量的問(wèn)題，因而當(dāng)將同源性水平和同一性程度兩者與結(jié)構(gòu)比對(duì)相關(guān)聯(lián)時(shí)，其能夠在空間上表現(xiàn)出來(lái)。隨后進(jìn)行這種類型的分析，還將兩種類型的比對(duì)中的目標(biāo)區(qū)域歸并為各自構(gòu)架的區(qū)域。
通過(guò)將所考慮的抗體在三個(gè)分析的變量(分別是，RMS的值，據(jù)其計(jì)算RMS的原子的百分比和在一級(jí)結(jié)構(gòu)之間的相似性指數(shù)，即，整體同一性，整體同源性，構(gòu)架水平上的同一性，在構(gòu)架水平上的同源性的百分比)的空間中的分布與如果是人來(lái)源的話每種抗體將會(huì)占據(jù)的在三個(gè)變量的空間中的最佳位置相比較，有可能清楚地鑒定人來(lái)源抗體，所述抗體在一級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)水平上最接近這個(gè)理想的位置。為了使這一結(jié)果合理化，在四種分析的每一種中都對(duì)與假定的最佳位置的偏差進(jìn)行計(jì)算以獲得所考慮的人源化或人來(lái)源抗體的每一位置。
在這種選擇方法的基礎(chǔ)上，有可能在進(jìn)行CDR移植以進(jìn)行給定抗體的人源化的隨后過(guò)程中選擇接納體構(gòu)架。通常，必需使以鼠來(lái)源的殘基進(jìn)行人來(lái)源的氨基酸殘基的取代最小化，因?yàn)槭髿埢囊朐黾涌贵w在人患者體內(nèi)誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)的危險(xiǎn)。另一方面，互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)包含具有與抗原相互作用的更大可能性的殘基并且為此原因它們必須保持在人源化抗體中。使用根據(jù)Kabat的序列或使用根據(jù)Chothia的結(jié)構(gòu)對(duì)它們進(jìn)行定義。利用第二種系統(tǒng)定義它們的優(yōu)點(diǎn)是通常CDRs較短并且因此人源化抗體由異種片段的更小部分構(gòu)成。在任何情況下都已證明一般按照Kabat的定義有可能顯著地減少人源化所需的循環(huán)數(shù)。一旦定義了CDRs，就必需鑒定它們所屬的標(biāo)準(zhǔn)類別(由Chothia和Lesk所定義的)并且隨后在人源化抗體中保持標(biāo)準(zhǔn)殘基。
還必需分析介導(dǎo)可變結(jié)構(gòu)域的輕鏈和重鏈之間相互作用的殘基(表1)，在人源化抗體中保持任何獨(dú)特的殘基(Singer等，1993；Daugherty
等；1991；De Martino等，1991)。
另外，基于氨基酸對(duì)于CDRs的構(gòu)象和/或?qū)τ谂c抗原的相互作用的可能影響來(lái)選擇要保持的其它氨基酸。當(dāng)氨基酸在動(dòng)物來(lái)源的構(gòu)架和人來(lái)源的等同接納體構(gòu)架之間有所不同時(shí)，所述接納體構(gòu)架的氨基酸應(yīng)當(dāng)被等同的鼠殘基取代，如果有理由預(yù)期所述氨基酸與抗原具有直接非共價(jià)接觸，或者鄰近CDR區(qū)，或者在任何情況下都與CDR區(qū)相互作用(它位于距離CDR區(qū)4-6)的話。
表1介導(dǎo)可變結(jié)構(gòu)域的輕鏈和重鏈之間相互作用的殘基輕可變鏈L重可變鏈H

具體地，進(jìn)一步的分析涉及限定所謂Vernier區(qū)的其它殘基，所述Vernier區(qū)是穩(wěn)定CDRs結(jié)構(gòu)的區(qū)域；重要的是保持此區(qū)的特性。
候選進(jìn)行突變的其它殘基是接納體構(gòu)架的氨基酸，其對(duì)于人免疫球蛋白在該位置上是獨(dú)特的。這些殘基能夠用源自更典型的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸進(jìn)行取代，或者當(dāng)所述氨基酸對(duì)于人免疫球蛋白在那些特定位置上為典型的時(shí)候，能夠?qū)⒃醋怨w構(gòu)架等同位置的殘基導(dǎo)入接納體構(gòu)架中。
另外，再次在人免疫球蛋白共有序列的基礎(chǔ)上，將突變導(dǎo)入人源化形式中，其插入在人體內(nèi)保守的殘基而非獨(dú)特殘基，所述獨(dú)特殘基存在于供體和接納體構(gòu)架中。
隨后對(duì)各對(duì)晶體學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，首先進(jìn)行動(dòng)物來(lái)源的CDRs在人構(gòu)架中的移植。隨后，引入上述的所有突變和逆向突變。隨后在合成的免疫球蛋白中裝配修飾的結(jié)構(gòu)。利用力場(chǎng)通過(guò)使機(jī)械能最小化(在扭角和結(jié)合角以及距離方面)精化得到的模型。
對(duì)于所有其它區(qū)域而言，與上面討論的特異性氨基酸取代不同，人源化免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)通常是與其所源自的人抗體的構(gòu)架區(qū)基本上相同的。在任何情況下在這些通過(guò)移植獲得的改造蛋白質(zhì)中，由于許多氨基酸取代、缺失或插入，末端或中間，以及其它改變，構(gòu)架區(qū)可以相對(duì)于天然序列在一級(jí)結(jié)構(gòu)水平上變化。自然地，構(gòu)架區(qū)中的大多數(shù)殘基給抗體的特異性或親和性帶來(lái)非常小的或者甚至是不存在的貢獻(xiàn)。所以，在構(gòu)架殘基中的許多個(gè)別保守性取代能夠被容忍而在得到的人源化免疫球蛋白中沒(méi)有可感知的特異性或親和性的變化。然而，通常這些取代是不希望有的。有可能以多種廣泛采用的技術(shù)，如位點(diǎn)特異性誘變(Gillman&Smith，1979；Roberts等，1987)來(lái)獲得核苷酸序列的修飾。
或者，可以生產(chǎn)只包含一部分抗體一級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽片段，所述片段保留免疫球蛋白的一種或多種特有活性(例如，結(jié)合活性)。這些多肽片段能夠通過(guò)起始自完整抗體的蛋白酶解消化或者通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變將終止密碼子插入在具有重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼DNA序列的載體中的所需位置(特別是在CH1區(qū)之后以產(chǎn)生Fab片段或在鉸鏈區(qū)之后以產(chǎn)生(Fab′)2片段)的方式進(jìn)行生產(chǎn)。通過(guò)使用接頭連接重鏈和輕鏈的可變區(qū)可以獲得scFv形式的抗體(Huston等，1988；Bird等，1988)。Fv或Fab片段能夠在大腸桿菌(Buchner和Rudolph，1991；Skerra等，1991)中或者也能夠在真核細(xì)胞，優(yōu)選來(lái)源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)?？紤]到像許多其它基因一樣，免疫球蛋白超家族的基因包含截然不同的功能區(qū)，每個(gè)功能區(qū)的特征為一種或多種特異性生物學(xué)活性，所述基因可以融合到源自其它基因(例如酶)的功能區(qū)上以產(chǎn)生提供了新特性的融合蛋白(例如免疫毒素)。
人源化免疫球蛋白序列在細(xì)菌中的表達(dá)能夠被用來(lái)選擇特征為較高親和性的人源化免疫球蛋白，誘變CDR區(qū)并且產(chǎn)生用于噬菌體展示的噬菌體文庫(kù)。利用這些文庫(kù)，有可能在人源化免疫球蛋白的CDRs水平上尋找變異體中進(jìn)行篩選，所述人源化免疫球蛋白具有對(duì)于抗原較高的親和性和/或結(jié)合特異性。已經(jīng)詳細(xì)報(bào)道了獲得具有免疫球蛋白可變區(qū)序列的噬菌體展示文庫(kù)的方法(Cesareni，1992；Swimmer等，1992；Gram等，1992；Clackson等，1991；Scott&Smith，1990；Garrard等，1991)。隨后將由此其CDRs得以改建的得自人源化免疫球蛋白變異體的序列在宿主中進(jìn)行表達(dá)，所述宿主適于確保其高水平表達(dá)。
如上所述，DNA序列在可操作性地結(jié)合(即以這種確保其功能性的方式定位)到表達(dá)控制序列上后在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。這些載體一般能夠在宿主生物中作為游離體或者作為染色體DNA的整合部分進(jìn)行復(fù)制。一般，所述表達(dá)載體包含可選的標(biāo)記以允許鑒定已經(jīng)用目標(biāo)DNA序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
為了以scFv重組形式或者以Fab形式生產(chǎn)本發(fā)明的人源化免疫球蛋白，優(yōu)選原核系統(tǒng)。大腸桿菌是對(duì)于克隆本發(fā)明的DNA序列特別有用的原核宿主之一。而且，現(xiàn)有大量的經(jīng)充分表征的啟動(dòng)子，例如lac或trp操縱子或β-內(nèi)酰胺酶或λ噬菌體。一般，這些啟動(dòng)子控制表達(dá)并且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以便正確啟動(dòng)并完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。通過(guò)與聚乙二醇(PEG)綴合有可能提高在原核系統(tǒng)中生產(chǎn)的本發(fā)明的人源化免疫球蛋白的半衰期。
其它單細(xì)胞生物，如酵母，可以用于表達(dá)。選擇的宿主是酵母屬(Saccharomyces)，利用提供了表達(dá)控制、復(fù)制終止和起點(diǎn)序列的合適載體。
昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的人源化免疫球蛋白，一般使用以穩(wěn)定方式轉(zhuǎn)染的S2果蠅細(xì)胞或具有基于桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)的Spodoptera frugiperda的細(xì)胞(Putlitz等，1990)。
植物和植物細(xì)胞培養(yǎng)物可以用于本發(fā)明的人源化免疫球蛋白的表達(dá)(Larrick&Fry，1991；Benvenuto等，1991；Durin等，1990；Hiatt等，1989)。
不過(guò)，在所有這些情況下都不可能獲得確保在激活人免疫系統(tǒng)中的效應(yīng)子功能所必需的糖基化的正確類型。為此目的，有可能利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的組織培養(yǎng)物來(lái)以IgG1的完整形式表達(dá)本發(fā)明的多肽，IgG1已經(jīng)證明在多種免疫球蛋白之中對(duì)于免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)是最有效的同種型(Winnacker，1987)。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，考慮到所述同種型決定抗體的裂解潛能，一般IgG1同種型被用于治療目的(因?yàn)樗T導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的和由補(bǔ)體系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫反應(yīng))，而IgG4被用于診斷應(yīng)用(Riechmann等，1988)。具體地，考慮到為了分泌完整免疫球蛋白而開發(fā)的大量宿主細(xì)胞系，其中有CHO細(xì)胞系，幾種COS細(xì)胞系，HeLa細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞系(NS0，SP/2，YB/0和P3X63.Ag8.653)，轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞或雜交瘤，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些細(xì)胞的表達(dá)載體可以包括表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子(Queen等，1986)，和核糖體結(jié)合、RNA剪切和多聚腺苷酸化所需的序列，以及轉(zhuǎn)錄終止序列。選擇的表達(dá)控制序列是源自免疫球蛋白基因和源自病毒，如SV40，腺病毒，牛乳頭狀瘤病毒，巨細(xì)胞病毒等等的序列。一般，表達(dá)載體包括可選擇的標(biāo)記，如對(duì)新霉素的抗性。
對(duì)于人源化抗體的表達(dá)，優(yōu)選用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。例如，HUDREG-55細(xì)胞系能夠易于生長(zhǎng)在來(lái)自Sigma(St.Louis，Mo.)的無(wú)血清和無(wú)蛋白的雜交瘤培養(yǎng)基Cat.No.S-2897中。
編碼本發(fā)明的人源化免疫球蛋白的基因能夠用來(lái)生成非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其一般在可獲取的體液如奶或血清中表達(dá)目標(biāo)人源化免疫球蛋白。這些轉(zhuǎn)基因包含可操作性地結(jié)合到啟動(dòng)子上的編碼人源化免疫球蛋白的多核苷酸序列，通常具有增強(qiáng)子序列，如嚙齒類免疫球蛋白的增強(qiáng)子序列或酪蛋白基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(Buhler等，1990；Meade等，1990)。使用同源重組構(gòu)建體可以將所述轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞或胚胎中。所用的非人動(dòng)物中有小鼠，大鼠，綿羊，牛和山羊(WO91/08216)。
一旦它們作為完整的抗體，單個(gè)輕鏈和重鏈，或以其它方式進(jìn)行表達(dá)就可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，如硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析，它們的二聚體、對(duì)本發(fā)明的免疫球蛋白進(jìn)行純化(Scopes，1982)。對(duì)于藥物學(xué)應(yīng)用，基本上純的免疫球蛋白是必需的，最小同質(zhì)性為90和95％之間，但是優(yōu)選在98和99％之間或者甚至更高。一旦部分純化或純化至所需同質(zhì)性，就可以將蛋白質(zhì)用于治療性用途(也是以體外(extra-body)的方式)，診斷性用途(成像進(jìn)行腫瘤或阿爾茨海默氏病的診斷)或開發(fā)和進(jìn)行生物化學(xué)測(cè)定，免疫熒光染色等等(一般見，Lefkovits和Pernis，1979和1981)。
本發(fā)明的藥物應(yīng)用涉及人源化免疫球蛋白MNAC13以免疫毒素形式消除表達(dá)TrkA的細(xì)胞的用途(在胰腺和前列腺腫瘤的情況下)。所述免疫毒素的特征是兩種組分并且特別適于在體外和體內(nèi)殺傷特定細(xì)胞。一般對(duì)于細(xì)胞致死的細(xì)胞毒性劑的一種組分被吸收或者如果它與細(xì)胞表面相互作用的話。第二種組分提供將毒性劑引導(dǎo)至特定靶細(xì)胞類型上的手段，所述特定靶細(xì)胞類型如表達(dá)TrkA接納體表位的細(xì)胞。通過(guò)任何一種現(xiàn)有的大量化學(xué)方法將這兩種組分相互進(jìn)行化學(xué)結(jié)合。例如，當(dāng)細(xì)胞毒性劑是蛋白質(zhì)而第二種組分是完整的免疫球蛋白時(shí)，所述連接可以通過(guò)交叉結(jié)合和異雙功能劑(SPDP，碳化二亞胺，戊二醛)進(jìn)行介導(dǎo)?；蛘?，所述兩種組分可以進(jìn)行遺傳結(jié)合(Chaudhary等，1989)。Thorpe等(1982)報(bào)道了各種免疫毒素的生產(chǎn)。
大量的細(xì)胞毒性劑適于作為免疫毒素應(yīng)用。細(xì)胞毒性劑可以包括放射性核素如碘131或其它碘的同位素，釔90，錸188和鉍212或其它發(fā)射α粒子的同位素，大量化療藥物如長(zhǎng)春地辛，氨甲蝶呤，阿霉素和順鉑；以及細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)，如抑制核糖體的蛋白質(zhì)(如美洲商陸抗病毒蛋白，假單胞菌外毒素和白喉毒素，蓖麻毒素A和植物來(lái)源的棒麥角素(clavin))或在細(xì)胞表面水平上具有活性的物質(zhì)(如諸如磷脂酶C的磷脂酶)-Baldwin和Byers編輯，1985；美國(guó)系列號(hào)07/290,968；Olsnes和Phil，1982。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是免疫毒素的細(xì)胞毒性區(qū)自身可以是免疫原性的并且因此限制了在慢性或長(zhǎng)期治療中融合蛋白的臨床有效性。避免毒素的免疫原性問(wèn)題的備選方案是將抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一種能夠與DNA相互作用的蛋白質(zhì)融合表達(dá)并且將包含毒素表達(dá)盒的表達(dá)載體結(jié)合到這種融合蛋白上。結(jié)合DNA的人蛋白魚精蛋白的多個(gè)正電荷能夠以穩(wěn)定的方式與DNA的負(fù)電荷相互作用，生成中性電荷抗體的融合伙伴，比所述毒素自身穩(wěn)定得多并且免疫原性更低。在通過(guò)接納體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)行抗體-質(zhì)粒復(fù)合物的內(nèi)在化后，所述毒素的表達(dá)引發(fā)細(xì)胞的死亡。
另外，可以通過(guò)將可誘導(dǎo)的或細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子插入毒素表達(dá)盒中來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)針對(duì)要消除的靶細(xì)胞的選擇性。這種方法的目的是使腫瘤細(xì)胞的選擇性消除最大化同時(shí)使毒副作用最小化(Chen等，1995)。
將免疫毒素引導(dǎo)至正確靶標(biāo)上的組分包括以完整免疫球蛋白形式或結(jié)合片段形式存在或作為Fab或Fv片段的本發(fā)明的MNAC13人源化免疫球蛋白。一般，免疫毒素中的抗體是人同種型IgM或IgG，但是也可以使用其它恒定區(qū)。
本發(fā)明的抗體和藥物組合物對(duì)于給藥特別有用，這種給藥是根據(jù)有效的方法在病理學(xué)中所涉及的組織水平上引導(dǎo)抗體。這包括(但不限于)腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、氣管內(nèi)、口服、腸、胃腸外、鼻內(nèi)或皮膚給藥。本發(fā)明的抗體一般能夠通過(guò)液體制劑的注射(腹膜內(nèi)或顱內(nèi)-一般在腦室中-或心包內(nèi)或囊內(nèi))進(jìn)行局部應(yīng)用或通過(guò)固體制劑(以丸劑、片劑、膠囊的形式)或液體制劑(以乳劑和溶液的形式)的攝取來(lái)給藥。用于胃腸外給藥的組合物一般包含溶于相容性溶液，優(yōu)選水溶液中的免疫球蛋白的溶液。在這些制劑中抗體的濃度可以從小于0.005％到15-20％變化并且它主要根據(jù)液體的體積、其粘度等，以及根據(jù)選定的特定給藥方式進(jìn)行選擇。
或者，能夠以固體形式制備抗體用于給藥?？贵w可以與不同的惰性或賦形物質(zhì)組合，后者可以包括配體如微晶纖維素、明膠或阿拉伯膠；受體如乳糖或淀粉；試劑如藻酸、Primogel或玉米淀粉；滑潤(rùn)劑如硬脂酸鎂，膠體二氧化硅；甜料如蔗糖或糖精；或香料，如薄荷和水楊酸甲酯。其它藥物給藥系統(tǒng)包括水凝膠、羥甲基纖維素、脂質(zhì)體、微膠囊、微型乳劑、微球等。在受疾病如腫瘤侵襲的組織中直接局部注射是一種優(yōu)選的本發(fā)明的抗體給藥的方法。
本發(fā)明的抗體可以進(jìn)行冷凍或凍干并且在重構(gòu)使用之前在合適的緩沖液中?？紤]到凍干和重構(gòu)能夠決定抗體活性的可變喪失(對(duì)于常規(guī)的免疫球蛋白而言，IgM類的抗體趨于比IgG類抗體具有更大的活性喪失)，必須校準(zhǔn)給藥水平以補(bǔ)償這一事實(shí)。
由于它們的高度阻斷能力，含有本發(fā)明抗體的組合物能夠給藥進(jìn)行預(yù)防和/或治療以阻止或減少與病理狀況或慢性疼痛相關(guān)聯(lián)的炎性成分，所說(shuō)的慢性疼痛尤其是慢性內(nèi)臟疼痛(與生理病癥，如痛經(jīng)、消化不良、胃腸道逆流、胰腺炎、內(nèi)臟痛或過(guò)敏性腸綜合征相關(guān)聯(lián)的)。
在預(yù)防性應(yīng)用中，將包含本發(fā)明抗體的組合物向尚未患有特定疾病的患者給藥以提高他們的抵抗力。
本發(fā)明的抗體還提供一種減小前列腺或胰腺腫瘤體積和預(yù)防進(jìn)一步腫瘤生長(zhǎng)或者降低腫瘤生長(zhǎng)速率的方法。這種效應(yīng)可以由本發(fā)明的人源化抗體所介導(dǎo)，因?yàn)樗鼈儗?duì)于抑制NGF和TrkA之間相互作用極為有效，所述相互作用是以自分泌或旁分泌的方式維持腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展所必需的。另外MNAC13的人源化形式與膜接納體相互作用并且因此也能夠用于瘤細(xì)胞的直接消除，因?yàn)樗鼈兡軌蚣せ钏拗鞯拿庖叻磻?yīng)(如果以IgG1的形式給藥的話)或輸送細(xì)胞毒性劑將它在癌實(shí)體的水平上進(jìn)行定位(如果以免疫毒素的形式給藥的話)。
它們?cè)谀[瘤部位的給藥優(yōu)選通過(guò)直接和定位注射入組織內(nèi)或腫瘤部位附近來(lái)進(jìn)行。對(duì)于全身性給藥，劑量從0.05mg/kg每天到500mg/kg每天變化，盡管優(yōu)選所述范圍的下部區(qū)中的劑量，因?yàn)樗鼈兏子诮o藥?？梢詫?duì)用量進(jìn)行校準(zhǔn)以便例如保證抗體在血漿中的特定水平(在大約5-30mg/ml的范圍內(nèi)，優(yōu)選在10-15mg/ml之間)并且維持這一水平持續(xù)一段給定的時(shí)間直到達(dá)到臨床效果。人源化抗體應(yīng)當(dāng)被消除得慢得多并且需要較低的劑量來(lái)維持血漿中的有效水平；而且，考慮到高親和性，與具有較低親和性的抗體相比給藥次數(shù)更少并且用量更小?；谀[瘤體積的減小或基于腫瘤生長(zhǎng)速率或者理想地基于癌的病理狀態(tài)的完全消失，在治療過(guò)程中可以確定每種抗體的治療有效劑量。測(cè)定或評(píng)估胰腺或前列腺腫瘤階段的有效方法是基于血液中前列腺特異性抗原(PSA)的測(cè)定，基于胰腺腫瘤存活時(shí)間的測(cè)定，基于兩種腫瘤情況下轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的延緩或抑制的測(cè)定。
對(duì)于在腫瘤部位水平上的直接注射，劑量依賴于不同的因素，包括腫瘤的類型、階段和體積，以及許多其它變量。根據(jù)腫瘤體積，一般的治療劑量可以從注射0.01mg/mm變化到10mg/mm，所述劑量能夠以必要的次數(shù)進(jìn)行給藥。另一種評(píng)估特定治療的有效性的方法是評(píng)估TrkA接納體的抑制，例如通過(guò)ELISA測(cè)定的方式測(cè)定其活性(Angeles等，1996)。
重要的是要強(qiáng)調(diào)TrkA不僅被視為治療性靶標(biāo)還被視為診斷性靶標(biāo)以進(jìn)行體內(nèi)成像，例如，進(jìn)行TrkA陽(yáng)性腫瘤的成像(作為陽(yáng)性或陰性標(biāo)記，根據(jù)腫瘤類型和起源)和對(duì)于基底前腦細(xì)胞的成像(作為阿爾茨海默氏病發(fā)生的早期標(biāo)記)。本發(fā)明的MNAC13人源化抗體還能夠發(fā)現(xiàn)有廣泛的體外應(yīng)用(ELISA，IRMA，RIA，免疫組織化學(xué))。
對(duì)于診斷目的，所述抗體可以是標(biāo)記的和未標(biāo)記的。未標(biāo)記的抗體可以與其它標(biāo)記的抗體(二抗)組合使用，所述其它標(biāo)記的抗體對(duì)于人源化的，或人抗體具有反應(yīng)性(例如針對(duì)人免疫球蛋白恒定區(qū)的特異性抗體)。或者，抗體能夠直接進(jìn)行標(biāo)記?？梢允褂枚喾N標(biāo)記，例如放射性核素、熒光團(tuán)、著色劑、酶、酶底物、酶因子、酶抑制劑、配體(特別是aptenic)等。許多類型的免疫學(xué)測(cè)定在該領(lǐng)域是可用的。
具體地，對(duì)于成像診斷應(yīng)用，如Goding(1986)和Paik等(1982)所述，抗體上綴合了可以檢測(cè)的試劑或以同位素的方式(利用碘、銦、锝的放射性同位素)或者以順磁性方式(順磁性原子或離子，如過(guò)渡元素，錒系元素和稀土元素；特別是，錳II，銅II和鈷II)進(jìn)行標(biāo)記。成像方法必需靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射(在淋巴引流區(qū)以鑒定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)并且它們?cè)诿庖唛W爍法中利用放射性核素發(fā)射的檢測(cè)器(如閃爍β計(jì)數(shù)器)；如果代之以利用順磁性標(biāo)記，則使用NMR(核磁共振)光譜計(jì)。


現(xiàn)在將參照下列附圖，在其非限制性實(shí)施方案中描述本發(fā)明。
圖1A)通過(guò)變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE 12％)和用考馬斯藍(lán)染色的方式進(jìn)行MNAC13抗體Fab片段的純化結(jié)果的分析(孔1用木瓜蛋白酶蛋白酶解消化的MNAC13抗體樣品；孔2結(jié)合到DEAE Sephacell離子交換樹脂上并用NaCl 250mM洗脫的級(jí)分；孔3分子量；孔4純化和濃縮的MNAC13抗體的Fab片段)；B)MNAC13抗體的Fab片段的典型晶體；C)用MNAC13抗體的Fab片段的晶體獲得的高分辨率衍射光譜；D)MNAC13抗體的Fab片段的重鏈和輕鏈的主鏈的扭角的Ramachandran圖。
圖2A)通過(guò)變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE 12％)和用考馬斯藍(lán)染色的方式進(jìn)行αD11抗體Fab片段的純化結(jié)果的分析(孔1用木瓜蛋白酶蛋白酶解消化的αD11抗體樣品；孔2純化和濃縮的αD11抗體的Fab片段；孔3分子量)；B)αD11抗體的Fab片段的典型晶體；C)用αD11抗體的Fab片段的晶體獲得的高分辨率衍射光譜；D)αD11抗體的Fab片段的重鏈和輕鏈的主鏈的扭角的Ramachandran圖。
圖3A)B)C)D)人源化的或人來(lái)源的抗體(利用它們的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)的PDB代碼命名的)根據(jù)三個(gè)分析的變量的分布；E)F)人源化的或人來(lái)源的抗體與MNAC13假定最佳值的偏差(考慮總體同一性和同源性的程度-用藍(lán)色-和構(gòu)架水平-用洋紅色-而進(jìn)行計(jì)算)；G)人源化的或人來(lái)源的抗體各個(gè)區(qū)域與MNAC13的Fv片段的結(jié)構(gòu)比對(duì)，根據(jù)與鼠抗體的同一性和同源性程度以及現(xiàn)有結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的解析程度選擇所述抗體；H)I)在H)中選定的人源化抗體1AD0(以紅色顯示)各個(gè)區(qū)域與MNAC13的Fv片段(以青色顯示)的結(jié)構(gòu)比對(duì)；在I)中CDR移植后得到的抗體模型(在構(gòu)架水平上以黃色顯示，在CDR水平上以白色顯示)與MNAC13的Fv片段的結(jié)構(gòu)比對(duì)；L)作為在選定構(gòu)架中推定的逆向突變的鑒定結(jié)果獲得的MNAC13人源化抗體的Fv片段的模型(人來(lái)源殘基以綠色顯示而鼠來(lái)源殘基以洋紅色顯示)。
圖4A)B)C)D)人源化的或人來(lái)源的抗體(利用它們的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)的PDB代碼命名的)根據(jù)三個(gè)分析的變量的分布；E)F)人源化的或人來(lái)源的抗體與αD11假定最佳值的偏差(考慮總體同一性和同源性的程度-用藍(lán)色-和構(gòu)架水平-用洋紅色-而進(jìn)行計(jì)算)；G)人源化的或人來(lái)源的抗體各個(gè)區(qū)域與αD11的Fv片段的結(jié)構(gòu)比對(duì)，根據(jù)與鼠抗體的同一性和同源性程度以及現(xiàn)有結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的解析程度選擇所述抗體；H)I)在H)中選定的人源化抗體1JPS(以紅色顯示)各個(gè)區(qū)域與αD11的Fv片段(以青色顯示)的結(jié)構(gòu)比對(duì)；在I)中CDR移植后得到的抗體模型(在構(gòu)架水平上以黃色顯示，在CDR水平上以白色顯示)與αD11的Fv片段的結(jié)構(gòu)比對(duì)；L)作為在選定構(gòu)架中推定的逆向突變的鑒定結(jié)果獲得的αD11人源化抗體的Fv片段的模型(人來(lái)源殘基以青色顯示而鼠來(lái)源殘基以紫色顯示)。
圖5分別為MNAC13(SEQ ID No.22，SEQ ID No.24)的，選擇進(jìn)行人源化的人源化抗體(1AD0；SEQ ID No.39，SEQ ID No.40)的，在1AD0構(gòu)架上CDR移植后MNAC13的人源化形式的以及所述逆向突變和突變(Hum MNAC13SEQ ID No.37，SEQ ID No.38)的重鏈(A)和輕鏈(B)的可變區(qū)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的比對(duì)。通過(guò)下劃線特征在MNAC13兩條鏈的人源化形式的序列中對(duì)CDRs突出顯示。
圖6分別為αD11(SEQ ID No.2，SEQ ID No.4)的，選擇進(jìn)行人源化的人源化抗體(1JPS；SEQ ID No.19，SEQ ID No.20)的，在1AD0構(gòu)架上CDR移植后αD11的人源化形式的以及所述逆向突變和突變(Hum αD11SEQ ID No.17，SEQ ID No.18)的重鏈(A)和輕鏈(B)的可變區(qū)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的比對(duì)。通過(guò)下劃線特征在αD11兩條鏈的人源化形式的序列中對(duì)CDRs突出顯示。
圖7A)MNAC13的鼠形式的輕鏈可變區(qū)的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.23)；B)MNAC13的鼠形式的重鏈可變區(qū)的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.21)；C)和E)繪制來(lái)通過(guò)重疊裝配PCR技術(shù)獲得MNAC13輕鏈可變區(qū)人源化形式的寡核苷酸序列(SEQ ID No.38)L1SSEQ ID No.31；L2ASSEQ ID No.32；L3SSEQ ID No.33；L4ASSEQID No.34；L5SSEQ ID No.35；L6ASSEQ ID No.36，與相應(yīng)的翻譯的氨基酸序列在一起顯示；D和F)繪制來(lái)通過(guò)重疊裝配PCR技術(shù)獲得MNAC13重鏈可變區(qū)人源化形式的寡核苷酸序列(SEQ ID No.37)H1SSEQ ID No.25；H2ASSEQ ID No.26；H3SSEQ ID No.27；H4ASSEQ ID No.28；H5SSEQ ID No.29；H6ASSEQ ID No.30，與相應(yīng)的翻譯的氨基酸序列在一起顯示。
圖8A)αD11的大鼠形式的輕鏈可變區(qū)的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.3)；B)αD11的大鼠形式的重鏈可變區(qū)的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.1)；C)和E)繪制來(lái)通過(guò)重疊裝配PCR技術(shù)獲得αD11輕鏈可變區(qū)人源化形式的寡核苷酸序列(SEQ ID No.18)L1SSEQID No.11；L2ASSEQ ID No.12；L3SSEQ ID No.13；L4ASSEQID No.14；L5SSEQ ID No.15；L6ASSEQ ID No.16，與相應(yīng)的翻譯的氨基酸序列在一起顯示；D和F)繪制來(lái)通過(guò)重疊裝配PCR技術(shù)獲得αD11重鏈可變區(qū)人源化形式的寡核苷酸序列(SEQ ID No.17)HISSEQ ID No.5；H2ASSEQ ID No.6；H3SSEQ ID No.7；H4ASSEQ ID No.8；H5SSEQ ID No.9；H6ASSEQ ID No.10，與相應(yīng)的翻譯的氨基酸序列在一起顯示。
圖9質(zhì)粒圖譜，所述質(zhì)粒用來(lái)克隆通過(guò)重疊裝配PCR獲得的兩種抗體的人源化可變區(qū)的序列。A)pVLexpress針對(duì)輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域，B)pVHexpress針對(duì)重鏈的可變結(jié)構(gòu)域，C)由在pVLexpress中克隆每種人源化抗體輕鏈的可變區(qū)而得到的質(zhì)粒，D)作為在pVHexpress中克隆每種人源化抗體重鏈的可變區(qū)的結(jié)果而獲得的備選構(gòu)建體1)為了以完整免疫球蛋白形式IgG1進(jìn)行表達(dá)，2)為了以Fab片段形式進(jìn)行表達(dá)，3)為了以免疫毒素形式進(jìn)行表達(dá)。
圖10通過(guò)ELISA測(cè)定法比較以嵌合形式和以人源化形式存在的MNAC13抗體的結(jié)合活性，其固定在以免疫粘附素形式存在的可塑性TrkA上進(jìn)行A)在隨后進(jìn)行濃縮的，被轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的上清液的系列稀釋液之間進(jìn)行比較；B)在通過(guò)G sepharose蛋白質(zhì)純化的轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的上清液的系列稀釋液之間進(jìn)行比較。
圖11通過(guò)ELISA測(cè)定法對(duì)以人源化形式存在的αD11抗體的結(jié)合活性的測(cè)定，其固定在可塑性NGF上進(jìn)行。
具體實(shí)施例方式
MNAC13和αD11單克隆抗體的Fab片段的X-射線結(jié)構(gòu)按照標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)獲得并純化兩種單克隆抗體。通過(guò)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，用29％硫酸銨沉淀來(lái)濃縮，隨后在PBS中進(jìn)行透析使MNAC13 IgG1和αD11 IgG2a免疫球蛋白在上清液中表達(dá)。使用Protein G Sepharose(Pharmacia)柱通過(guò)親和色譜法來(lái)純化兩種免疫球蛋白。
在使用Spectra-Por 12/14K膜(Spectrum)在4℃于磷酸鹽緩沖液10mM pH 7，EDTA 20mM中進(jìn)行透析后，每種樣品通過(guò)Centricon 50KDa超濾裝置(Amicon)來(lái)進(jìn)行濃縮，以13mM Cys進(jìn)行溫育，并用固定的木瓜蛋白酶(Pierce)(以1∶15的酶∶底物比例)在37℃處理5小時(shí)。純化各個(gè)Fab片段的方法是多樣化的，盡管其總是基于離子交換層析進(jìn)行的。
在MNAC13的情形中，在相對(duì)于Tris HCl 100mM pH 8.0進(jìn)行透析后，通過(guò)用相同緩沖液平衡的DEAE-Sephacel柱(Pharmacia)來(lái)去除Fc片段是可能的。在排除體積中收集FabMNAC13，同時(shí)用250mM NaCl洗脫Fc片段和未消化的IgG1的級(jí)分。通過(guò)在用Tris HCl 100mM pH 8.0，NaCl150mM平衡的Superdex G75(Pharmacia)柱上進(jìn)行凝膠過(guò)濾使Fab片段與未消化的IgG1分離。通過(guò)在12％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離隨后用考馬斯染色來(lái)控制級(jí)分的同質(zhì)性和純度(圖1A)。通過(guò)Lowry測(cè)定法(Bio-Rad)來(lái)測(cè)定純化的蛋白質(zhì)的濃度。從11個(gè)雜交瘤surnatant中，獲得多達(dá)3mg的MNAC13 Fab(其純度超過(guò)99％)是可能的。
關(guān)于αD11抗體Fab片段的純化，將用木瓜蛋白酶處理的樣品相對(duì)于10mM pH 7.8的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析通過(guò)用這種相同的緩沖液平衡的DEAE-Sephacel柱(Pharmacia)來(lái)去除Fc片段。在排除體積中收集αD11的Fab片段，同時(shí)用250mM pH 6.8的磷酸鹽緩沖液來(lái)洗脫Fc片段和未消化的IgG2a的級(jí)分。通過(guò)在用10mM pH 7.8的磷酸鹽緩沖液，NaCl 150mM平衡的Superdex G75柱(Pharmacia)上進(jìn)行凝膠過(guò)濾使Fab片段與未消化的IgG2a分離。通過(guò)在12％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離隨后用考馬斯染色來(lái)控制所述級(jí)分的同質(zhì)性和純度(圖2A)。通過(guò)Lowry測(cè)定法(Bio-Rad)來(lái)測(cè)定純化的蛋白質(zhì)的濃度。從11個(gè)雜交瘤surnatant中，獲得多達(dá)6mg的αD11 Fab(其純度超過(guò)99％)是可能的。
將在10mM Tris pH 8.0，50mM NaCl中純化的MNAC13抗體的Fab片段，和在10mM磷酸鈉pH 7.8和50mM NaCl中純化的αD11抗體的Fab片段通過(guò)Centricon 30KDa超濾裝置(Amicon)濃縮到5-10mg/ml。使用Crystal Screen I和II(Hampton Research-Laguna Niguel，CA，USA-)和篩選試劑盒(Jena BioSciences)，在因子組合方法(Jancarik&Kim，1991)后，于16℃按照懸滴方法進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。
將2μl的濃縮蛋白質(zhì)樣品的數(shù)滴加入等體積的包含沉淀劑的溶液中，并通過(guò)擴(kuò)散與在24孔Linbro平板的儲(chǔ)器(0.7ml)中的溶液進(jìn)行平衡。
對(duì)于MNAC13抗體的Fab片段，將以等體積的蛋白質(zhì)和包含2M的硫酸銨的沉淀劑，5％v/v的異丙醇(Crystal Screen II，Reactant#5)，獲得的最有前景的初始結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化直到獲得在約1周內(nèi)生長(zhǎng)的晶體，其類似于在圖1B中所顯示的。
對(duì)于αD11抗體的Fab片段，使用等體積的蛋白質(zhì)和包含20％PEG4000，0.6M NaCl，100mM MES pH 6.5(試劑盒號(hào)4，溶液C2)獲得的最有前景的初始結(jié)果需要更長(zhǎng)的優(yōu)化過(guò)程，將沉淀劑的組成修改為PEG4000，0.6M NaCl，100mM BTP pH 5.5和在蛋白質(zhì)和沉淀劑溶液之間的比例(1.5∶1)直到獲得在約1周內(nèi)生長(zhǎng)的晶體，其與在圖2B中顯示的類似。
在兩種情形中，在ELETTRA同步加速器(Trieste，意大利)的XRD1衍射線上采集初始的一組低分辨率數(shù)據(jù)，接著，在ESRF同步加速器(Grenoble，法國(guó))的ID14-EH1衍射線上采集第二組更完全的較高分辨率的數(shù)據(jù)。在MNAC13抗體的Fab片段情形中，使用包含2.2M的硫酸銨，6％v/v的異丙醇和20％v/v的甘油作為低溫防護(hù)劑的溶液，用Oxford Cryosystems(Oxford，UK)的冷卻系統(tǒng)在液氮流下冷凍晶體。將每種蛋白的代表性高分辨率衍射光譜顯示于圖1B和圖2B中。
分別使用DENZO和SCALEPACK程序(Otwinowski&Minor，1997)對(duì)所有的4組X-射線衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，編入索引中，綜合并隨后進(jìn)行定標(biāo)，同時(shí)將CCP4(Collaborative Computational Project，第4期，1994)包用于數(shù)據(jù)處理。在下面的表中陳列了對(duì)MNAC13抗體的Fab片段的晶體的高和低分辨率數(shù)據(jù)的采集和處理的統(tǒng)計(jì)數(shù)值X-射線源ELETTRAESRF波長(zhǎng)()1.000 0.934檢測(cè)器 mar345 marCCD空間基團(tuán)P212121P212121晶胞的參數(shù)a() 52.78 52.73b() 67.53 67.55c() 111.51 111.43鑲嵌度(Mosaicity)(°) 0.40 0.47分辨率間隔() 12.0-2.50 17.0-1.80(2.59-2.50)(1.83-1.80)測(cè)量數(shù) 98688 414115以I≥0觀察的反射數(shù) 56918 227914以I≥0觀察的單一反射數(shù) 14203(1371)38392(1893)完全度(％) 99.5(99.3) 99.5(99.6)豐度4.0(4.0) 5.9(4.9)測(cè)量數(shù)據(jù)的<I/σ(I)> 9.4(4.7) 8.2(1.1)Rsym(％) 5.7(15.2) 6.3(39.8)類似地，下面的表總結(jié)了對(duì)于αD11抗體的Fab片段的晶體的高和低分辨率數(shù)據(jù)的采集和處理的統(tǒng)計(jì)數(shù)值
X-射線源ELETTRAESRF波長(zhǎng)()1.000 0.934檢測(cè)器 marCCD marCCD空間基團(tuán)P1 C2晶胞的參數(shù)a() 42.685 114.801b() 50.626 69.354c() 102.69764.104α(°) 81.977 90.β(°) 89.116 117.02.γ(°) 85.957 90鑲嵌度(Mosaicity)(°) 0.44 0.40分辨率間隔() 47.6-2.57 17.0-1.70(2.8-2.7) (1.75-1.70)測(cè)量數(shù) 124456 492594觀察的反射數(shù)I≥074241 399184觀察的單一反射數(shù)I≥023413(2162)47951(3198)完全度(％) 98.2(92.4) 97.2(78.4)豐度5.7 (5.2) 6.7(7.5)測(cè)量數(shù)據(jù)的<I/σ(I)> 29.6(6.7) 9.5(2.1)Rsym(％) 11.0(33.5) 5.8(27.8)其中在括號(hào)中的值指具有最高分辨率的殼層。
考慮到可獲得的Fab片段的結(jié)構(gòu)的高數(shù)目，確定兩種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的最方便的方法是分子置換。在對(duì)于同源結(jié)構(gòu)的在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Berman等，2000)中的研究中，選擇標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)先考慮在可比較的分辨率和最高水平的序列同一性之間的組合。在這些基礎(chǔ)上，分別地，選擇對(duì)于MNAC13∶1BM3以分辨率2.0分辨的并具有重鏈和輕鏈分別為70和88％的序列同一性的在Opg2 Fab免疫球蛋白的Fab片段和由其識(shí)別的肽之間的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(Kodandapani等1999)。
對(duì)于αD11∶1CIC以分辨率2.5分辨的并具有重鏈和輕鏈分別為82和82.65％的序列同一性的獨(dú)特型-抗獨(dú)特型Fab片段FabD1.3-FabE225的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(Bentley等1990)。
考慮到在可變區(qū)和恒定區(qū)之間由二元假對(duì)稱的軸形成的角的極端可變性分別使用恒定結(jié)構(gòu)域和可變結(jié)構(gòu)域，以各自的模型，通過(guò)使用AmoRe程序(Navaza，1994)的分子置換方法來(lái)獲得兩種結(jié)構(gòu)的確定。在下面的表中顯示，在用剛性體精化后在確定MNAC13的Fab片段的結(jié)構(gòu)中獲得的溶液

類似地，在下面的表中顯示在用空間基團(tuán)C2的剛性體精化后，在確定αD11的Fab片段的結(jié)構(gòu)中獲得的溶液

其中V＝可變結(jié)構(gòu)域C＝恒定結(jié)構(gòu)域αβγ＝Eurelian角(°)。
x，y，z＝平移(分?jǐn)?shù)的)。
Cf＝振幅的相關(guān)性(x100)。
Rf＝結(jié)晶學(xué)R因子(x100)。
Ci＝強(qiáng)度的相關(guān)性(x100)。
Cp切余Patterson函數(shù)的相關(guān)性(x100)。
通過(guò)循環(huán)方法來(lái)獲得兩種結(jié)構(gòu)的隨后的精化，所述循環(huán)方法包括兩個(gè)交替的階段使用計(jì)算機(jī)圖解“O”的人機(jī)對(duì)話軟件(Kleywegt和Jones，1994)來(lái)手工構(gòu)建該模型；使用CNS程序組，晶體學(xué)和NMR系統(tǒng)的自動(dòng)方法(Brunger等1998)來(lái)進(jìn)行位置精化和B各向同性熱因子的精化。在用剛性體精化的一些階段后的程序，預(yù)期不同的精化循環(huán)。一旦完成插入所有的突變和缺失來(lái)完善該模型，就進(jìn)行水分子和任何離子和配體的定位。最后，在立體化學(xué)方面，在盡可能使模型維持接近理想值的同時(shí)，對(duì)位置權(quán)wa和熱因子B的權(quán)r-權(quán)進(jìn)行優(yōu)化。將描述獲得的MNAC13抗體的Fab片段的模型質(zhì)量的統(tǒng)計(jì)數(shù)值和最終參數(shù)總結(jié)于下面的表中蛋白質(zhì)原子的數(shù)目 3244溶劑原子的數(shù)目 351硫酸根離子的數(shù)目 4Tris分子的數(shù)目 1異丙醇分子的數(shù)目 1分辨率間隔() 39-1.778最終R因子19.35％最終Rfree因子(根據(jù)10％的數(shù)據(jù)計(jì)算)23.22％Rms偏差結(jié)合距離() 0.008結(jié)合角(°) 1.456二面角(°) 27.29假角(°) 0.928平均各向同性熱因子(A2)完全蛋白質(zhì) 23.55輕鏈 24.14重鏈 22.99水分子 31.95離子(硫酸根) 55.94Tris 46.06異丙醇 32.60類似地，將描述獲得的αD11抗體的Fab片段的模型質(zhì)量的統(tǒng)計(jì)數(shù)值和最終參數(shù)總結(jié)于下面的表中蛋白質(zhì)原子的數(shù)目3229溶劑原子的數(shù)目 403氯化物離子的數(shù)目1分辨率間隔() 39-1.70最終R因子 19.54％最終Rfree因子(在10％的數(shù)據(jù)上計(jì)算) 24.22％Rms偏差結(jié)合距離()0.0096結(jié)合角(°) 1.6571二面角(°) 27.40假角(°)1.048平均各向同性熱因子(A2)完全蛋白質(zhì) 25.58輕鏈24.14重鏈22.99水分子 38.80離子(氯化物)20.58而且，用PROCHECK程序組(Laskowski等，1993)通過(guò)最終的幾何分析來(lái)檢查兩種模型，如在各個(gè)表和在各個(gè)Ramachandran圖(圖1D和2D)中所顯示的。
MNAC13和αD11單克隆抗體的Fab片段的X射線結(jié)構(gòu)在人來(lái)源的構(gòu)架的選擇中的應(yīng)用在人抗體構(gòu)架的選擇中，按照上述方法，其將在一級(jí)序列水平上的鼠和人來(lái)源的抗體之間的同一性的程度與多肽骨架的結(jié)構(gòu)相似性的程度相結(jié)合。
特別地，在通過(guò)在BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索的一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性和同一性兩者的最高水平的基礎(chǔ)上選擇人來(lái)源或人源化抗體的一系列可能的接納體構(gòu)架。在考慮抗體的完整可變區(qū)并縮小對(duì)構(gòu)架區(qū)的檢索的情況下，對(duì)于兩種封閉抗體進(jìn)行這種選擇。
在選定的抗體的每個(gè)組中，僅考慮可獲得具有高分辨率或具有與我們所獲得的結(jié)構(gòu)的分辨率相當(dāng)?shù)姆直媛?即，不大于2.5)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的抗體，在PDB(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù))中進(jìn)行檢索。接著，使用“疊加”軟件(Diederichs，1995)來(lái)對(duì)各個(gè)氨基酸骨架進(jìn)行疊加。
圖3G和4G顯示在待人源化的抗體的一級(jí)結(jié)構(gòu)的最佳比對(duì)和可獲得的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的高分辨率的基礎(chǔ)上選擇的，在Fv區(qū)域(分別為MNAC13和αD11的)和人源化或人來(lái)源的抗體的α碳原子骨架的三級(jí)結(jié)構(gòu)之間比對(duì)的結(jié)果。
為了評(píng)價(jià)人來(lái)源或改造的每個(gè)個(gè)體結(jié)構(gòu)的疊加的程度，關(guān)于MNAC13和αD11計(jì)算了構(gòu)成各自的氨基酸骨架的α碳原子之間的RMS，不考慮具有超過(guò)2的RMS的原子對(duì)。
用于人源化的最佳構(gòu)架的選擇為一個(gè)三變量的問(wèn)題，因而當(dāng)將同源性水平和同一性程度兩者與結(jié)構(gòu)比對(duì)相關(guān)聯(lián)時(shí)，其能夠在空間上表現(xiàn)出來(lái)。然后進(jìn)行這種類型的分析，還將在兩種類型的比對(duì)中的目標(biāo)區(qū)域歸并為各個(gè)構(gòu)架的區(qū)域。
如在圖3和4中所顯示，所考慮的抗體在三個(gè)分析的變量(分別為，RMS的值，據(jù)其計(jì)算RMS的原子的百分比和在一級(jí)結(jié)構(gòu)之間的相似性指數(shù)，即整體的相似性-A-的百分比，整體同源性-C-的百分比，在構(gòu)架水平上的同一性-B-的百分比，在構(gòu)架水平上的同源性-D-的百分比)的空間中的分布對(duì)于考慮的兩種情形而言都是相互關(guān)聯(lián)和一致的。
另外，如果抗體是人來(lái)源的話，通過(guò)將這些分布與每種抗體將會(huì)占據(jù)的在三個(gè)變量的空間中的最佳位置相比，有可能清楚地鑒定人來(lái)源抗體，所述抗體在一級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)水平上最接近這個(gè)理想的位置。在兩種抗體的情況中，為了使這一結(jié)果合理化，在四種分析的每一種中都計(jì)算與假定的最佳位置的偏差以獲得所考慮的人源化或人來(lái)源抗體的每一位置(圖3E和3F針對(duì)MNAC13而圖4E和4F針對(duì)αD11)。在這種情況下，結(jié)果也是一致的并且證實(shí)了先前的跡象。
在這種選擇方法的基礎(chǔ)上，在隨后的CDR移植過(guò)程中選擇兩種不同的人源化抗體作為接納體構(gòu)架以進(jìn)行兩種抑制NGF/TrkA相互作用的抗體的人源化。具體地，圖3H和4H顯示兩種封閉抗體與各自選定的人源化抗體在Fv區(qū)水平上的結(jié)構(gòu)比對(duì)，即利用PDB，對(duì)于αD11利用1JPS密碼而對(duì)于MNAC13利用1AD0密碼。圖3I和4I比較了鼠抗體與CDR移植后相同抗體模型的相同區(qū)域。
一旦限定了CDRs，就對(duì)它們所屬的標(biāo)準(zhǔn)類別(由Chothia和Lesk所定義的)進(jìn)行鑒定并且隨后維持人源化抗體中的標(biāo)準(zhǔn)殘基對(duì)于每種抗體，在圖5和圖6中以下劃線的特征對(duì)它們進(jìn)行突出顯示。
關(guān)于隨后對(duì)要引入的逆向突變的分析，插入下列逆向突變以維持兩種結(jié)構(gòu)域之間的界面，所述逆向突變的引入是為了維持介導(dǎo)可變結(jié)構(gòu)域的輕鏈和重鏈之間相互作用的殘基對(duì)于MNAC13為L(zhǎng)46和H35，H37對(duì)于αD11為L(zhǎng)34，L46，L92和H35。
另外，為了維持Vernier區(qū)的特性，進(jìn)行下列逆向突變對(duì)于MNAC13為L(zhǎng)98對(duì)于αD11為H71(其在任何情況下都與人共有序列中表現(xiàn)的氨基酸殘基的取代相關(guān))。
隨后，根據(jù)與人免疫球蛋白主要共有序列的比較，進(jìn)行下列逆向突變對(duì)于MNAC13為L(zhǎng)1，L2，L13，L50，L73，L104和H24，H48，H49，H73，H76，H82B，H87，H90，H93對(duì)于αD11為L(zhǎng)56。
另外，再次在人免疫球蛋白共有序列的基礎(chǔ)上，將下列突變導(dǎo)入MNAC13的人源化形式中，所述突變插入在人體內(nèi)保守的殘基而非存在于供體和接納體構(gòu)架中的獨(dú)特殘基。
L42(L→Q)，L83(I→V)和H83(Q→R)，H89(I→V)。
為了同樣的理由，將下列突變引入αD11的人源化形式中。
H67(V→F)。
對(duì)各對(duì)晶體學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，首先進(jìn)行動(dòng)物來(lái)源的CDRs在人源化構(gòu)架中的移植。隨后，引入上述的所有突變和逆向突變。隨后在合成的免疫球蛋白中裝配修飾的結(jié)構(gòu)。利用力場(chǎng)通過(guò)使機(jī)械能最小化(在扭角和結(jié)合角以及距離方面)精化得到的模型。
MNAC13和αD11單克隆抗體的人源化在選擇構(gòu)架的供體人源化抗體以實(shí)現(xiàn)MNAC13的CDR移植后，設(shè)計(jì)各自的可變區(qū)，其將MNAC13的鼠CDRs與根據(jù)上面所述突變修飾的人源化抗體的構(gòu)架相組合。隨后對(duì)αD11進(jìn)行類似的操作?；旧希ㄟ^(guò)基于重疊裝配PCR方法的操作，利用大約80個(gè)堿基的寡核苷酸，可以獲得兩種人源化可變區(qū)，其更迭具有20個(gè)堿基長(zhǎng)的連續(xù)重疊的有義和反義鏈，這種更迭是以這樣的方式進(jìn)行的，即允許部分雙鏈分子作為雜交的結(jié)果而形成(圖7B和8B)。在通過(guò)Vent聚合酶填補(bǔ)中斷后，利用兩種短寡核苷酸作為引物對(duì)所述雙鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述短寡核苷酸具有雙鏈自身5’端的序列以及適于隨后定向克隆的限制性酶切位點(diǎn)(分別是，對(duì)于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的克隆為ApaLI/BgIII而對(duì)于重鏈可變結(jié)構(gòu)域的克隆為BssHII/BstEII)，這種克隆是在用各自的限制性酶進(jìn)行消化后，對(duì)于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域在pVLexpress質(zhì)粒中進(jìn)行的(圖9A)而對(duì)于重鏈可變結(jié)構(gòu)域是在pVHexpress質(zhì)粒中進(jìn)行的(圖9B)。這些載體允許以與克隆序列融合的方式分別表達(dá)人來(lái)源的恒定結(jié)構(gòu)域Cκ和CH1，CH2和CH3。所以利用這些載體，有可能在像上面所列的那些人細(xì)胞系中以IgG1分子的形式表達(dá)兩種抗體(圖9C和9D1)。
為了獲得Fab片段形式的兩種人源化抗體，單獨(dú)作用于克隆了重鏈的載體是足夠的。具體地，有可能用單獨(dú)的CH1結(jié)構(gòu)域取代完整的恒定部分，所述CH1結(jié)構(gòu)域是利用在末端具有限制性酶切位點(diǎn)以進(jìn)行SacII-XbaI定向克隆的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的(如圖9D2中所示)。
最后，為了獲得免疫毒素形式的MNAC13人源化抗體，有可能在恒定結(jié)構(gòu)域CH1的羧基末端表達(dá)堿性魚精蛋白，所述堿性魚精蛋白是利用在末端具有限制性酶切位點(diǎn)以進(jìn)行非定向Xba1克隆的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的(如圖9D3中所示)。
MNAC和αD11人源化抗體的表達(dá)和結(jié)合測(cè)定根據(jù)推薦的方案(Roche)通過(guò)FuGENE以1μg編碼每種人源化抗體的VH和VK的質(zhì)粒DNA(共2μg)共轉(zhuǎn)染250,000個(gè)COS細(xì)胞。利用所述構(gòu)建體獲得IgG1形式的人源化抗體。
與上述構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)染同時(shí)，對(duì)每種抗體共轉(zhuǎn)染相應(yīng)的嵌合形式，即在CMV pVH express中克隆的鼠MNAC13的VH以及在CMV pVKexpress中克隆的鼠MNAC13的VK；關(guān)于αD11，將大鼠VH與人來(lái)源的Cγ在pcDNA1中進(jìn)行融合克隆并且將大鼠VK與人來(lái)源的Cγ在pcDNA1中進(jìn)行融合克隆。
轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，收集含有由宿主細(xì)胞表達(dá)的免疫球蛋白的上清液，并利用Centriprep 50(Amicon)進(jìn)行濃縮。
通過(guò)ELISA測(cè)定法確證兩種人源化抗體識(shí)別各自配體的能力并且與各自的嵌合形式進(jìn)行比較。結(jié)果顯示于圖10和11中。
為了進(jìn)行可塑性的固定，以含有這兩種抗體各自配體(純化的重組免疫粘附素TrkA Camel和由下頜下腺純化的鼠NGF)的溶液將96孔Maxi吸附平板于4℃溫育過(guò)夜，所述溶液是在0.1M pH 9.6碳酸鈉緩沖液中濃度為10μg/ml。
在用含有3％奶的PBS(MPBS)于環(huán)境溫度下封閉一小時(shí)后，以連續(xù)稀釋(1∶2，1∶20；1∶200)將濃縮的上清液進(jìn)行溫育并且同時(shí)還與未轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的上清液(陰性對(duì)照)一起溫育。
在用一抗(其識(shí)別人來(lái)源的恒定Cγ區(qū))和用二抗(綴合了過(guò)氧化物酶的抗兔抗體)溫育后，有可能通過(guò)與TMB底物(TECNA)一起溫育的方式來(lái)檢測(cè)作為在450nm下的光密度(OD450)的結(jié)合活性。包括濃度為500ng/ml的各種單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。
圖10B顯示了類似ELISA測(cè)定的結(jié)果，所述ELISA測(cè)定是在通過(guò)親和色譜法純化表達(dá)的免疫球蛋白之后進(jìn)行的。
詳細(xì)地說(shuō)，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液，并且在通過(guò)離心去除細(xì)胞碎片后，將它們與100μl的Protein G Sepharose一起溫育并且在用PBS充分洗滌后，用1mM HCl洗脫每種蛋白質(zhì)，并且在洗脫后立即用1M TrispH 8.8中和pH。以Lowry測(cè)定法評(píng)估各自的濃度。
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權(quán)利要求
1.進(jìn)行已知序列的動(dòng)物抗體的VH和VL可變區(qū)的人源化的方法，包括以下步驟a)如果不是現(xiàn)有的話，獲得動(dòng)物抗體的VH和VL區(qū)的結(jié)晶學(xué)結(jié)構(gòu)；b)基于和所述動(dòng)物抗體構(gòu)架一級(jí)序列最高水平的同源性和同一性，預(yù)選一系列0-n個(gè)人來(lái)源或人源化抗體的可能的構(gòu)架接納體，以不小于3的分辨率對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性測(cè)定；c)分別進(jìn)行動(dòng)物抗體的VH和VL可變區(qū)與b)中獲得的VH和VL區(qū)之間的結(jié)構(gòu)比較，并且計(jì)算每次比較的RMS，以鑒定具有較小RMS的人來(lái)源的VH區(qū)和VL區(qū)；d)將所述動(dòng)物抗體的CDR區(qū)的序列插入于c)中鑒定的人序列中的合適位置；e)如果必要的話，將c)中鑒定的人VH區(qū)和VL區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基逆向突變。
2.如權(quán)利要求1中所要求的方法，其中以重組DNA技術(shù)進(jìn)行抗體的修飾。
3.如權(quán)利要求1中所要求的方法，其中所述動(dòng)物抗體是抗NGF抗體。
4.如權(quán)利要求2中所要求的方法，其中所述抗NGF抗體，優(yōu)選地它是αD11抗體，并且人源化序列基本上具有下列序列VHHumαD11VH(SEQ ID No.17)和VLHumαD11Vk(SEQ ID No.18)。
5.如權(quán)利要求1中所要求的方法，其中所述動(dòng)物抗體是抗TrkA抗體。
6.如權(quán)利要求4中所要求的方法，其中所述抗TrkA抗體是MNAC13抗體，并且人源化序列基本上具有下列序列VHHum MNAC13VH(SEQ IDNo.37)和VLHum MNAC13Vk(SEQ ID No.38)。
7.根據(jù)如在前任一個(gè)權(quán)利要求所要求的方法可以獲得的人源化動(dòng)物抗體。
8.根據(jù)如在前任一個(gè)權(quán)利要求所要求的方法可以獲得的抗NGF人源化動(dòng)物抗體。
9.根據(jù)如在權(quán)利要求5或6中所要求的方法可以獲得的抗TrkA人源化動(dòng)物抗體。
全文摘要
進(jìn)行已知序列的動(dòng)物抗體的VH和VL可變區(qū)的人源化的方法，根據(jù)該方法可以獲得的人源化動(dòng)物抗體，特別是抗NGF和抗TrkA人源化動(dòng)物抗體。
文檔編號(hào)G06F19/16GK1906212SQ200480040565
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月24日
發(fā)明者A·卡特尼奧, S·科瓦瑟斯扎克, D·拉姆巴 申請(qǐng)人:雷萊恩基因組股份公司, 阿萬(wàn)扎蒂－西薩國(guó)際高級(jí)學(xué)院