本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及融合蛋白hsa1-vβ1及其應用，尤其涉及融合蛋白hsa1-vβ1及其對金黃色葡萄球菌腸毒素b中毒休克的救治作用。
背景技術(shù)：
：金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxin，se)是由金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質(zhì)，因其主要作用于腸道，故稱為腸毒素。金黃色葡萄球菌腸毒素b(staphylococcalenterotoxinb，seb)是金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的多種外毒素中產(chǎn)量最高的一種，且其對熱穩(wěn)定，同時seb還具有產(chǎn)毒菌株容易獲得、制備工藝簡單、性質(zhì)穩(wěn)定，適合裝備彈頭，并通過生物戰(zhàn)劑氣溶膠形式釋放等特點，目前已經(jīng)成為美國公布裝備的八種“標準”生物戰(zhàn)劑之一，也是生物武器核查單上的失能性戰(zhàn)劑。seb還是引起日常食物中毒的常見毒素。t細胞抗原受體(tcellreceptor，tcr)主要是由α鏈和β鏈組成，seb激活t細胞需要seb與主要組織相容性復合體(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)ⅱ類分子形成復合體，然后與tcr的vβ鏈結(jié)合，導致帶有特異vβ亞型t細胞大量增殖。seb最早于1954年從一名患“急性非特異性腹瀉”兒童分離，是典型的超抗原(superantigen，sag)。所謂超抗原是一類不需要抗原提呈細胞(apc)處理而能夠直接與mhcⅱ類分子結(jié)合，導致帶有特異vβ節(jié)段t細胞大量增殖的抗原分子。超抗原對t細胞的激活不受mhcⅱ類分子的限制，且激活能力是普通抗原的2000-50000倍，因此只需極低濃度(1～10pg/ml)即可激活多克隆t細胞產(chǎn)生很強的免疫應答。seb能抗蛋白酶降解，在ph4～ph10均有活性，中毒劑量低，在0.0004μg/kg的劑量下即可使受試者失能達2周時間；對人的致吐劑量為0.4μg/kg，少量吸入就可導致嘔吐和腹瀉，13小時內(nèi)體溫升至41℃以上，引起人體的多器官、多系統(tǒng)的損傷，造成機體免疫功能失調(diào)，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓，嚴重的甚至引起致死性休克，具有很高的致殘率。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何對金黃色葡萄球菌腸毒素b引起的中毒休克進行救治。為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種融合蛋白。本發(fā)明所提供的融合蛋白，自n末端至c末端依次可包括n端元件和c端元件；所述n端元件的氨基酸序列可如序列表中序列2自n末端起第1至585位所示；所述c端元件的氨基酸序列可如序列表中序列2自n末端起第601至711位所示。所述融合蛋白中還可包括linker區(qū)段，所述linker區(qū)段位于所述n端元件和所述c端元件之間。所述linker區(qū)段的氨基酸序列如序列表中序列2自n末端起第586至600位所示。所述融合蛋白可為a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；a3)將a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有抑制細胞分泌炎癥因子和/或與金黃色葡萄球菌腸毒素結(jié)合和/或治療金黃色葡萄球菌腸毒素中毒和/或預防金黃色葡萄球菌腸毒素中毒作用的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2可由711個氨基酸殘基組成。為了使a1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1、標簽的序列標簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個)rrrrrpoly-his2-10(通常為6個)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述a3)中的融合蛋白，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的融合蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述a3)中的融合蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。編碼所述融合蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述編碼所述融合蛋白的核酸分子，自5’末端至3’末端依次可包括區(qū)段甲和區(qū)段乙；所述區(qū)段甲的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第1至1755位所示；所述區(qū)段乙的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第1801至2133位所示。所述編碼所述融合蛋白的核酸分子可為如下e1)或e2)或e3)所示的dna分子：e1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；e2)與e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述融合蛋白的dna分子；e3)在嚴格條件下與e1)或e2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述融合蛋白的dna分子。含有所述編碼所述融合蛋白的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述融合蛋白，或，所述編碼所述融合蛋白的核酸分子在制備產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍；所述產(chǎn)品的功能可為抑制細胞分泌炎癥因子和/或與金黃色葡萄球菌腸毒素結(jié)合和/或治療金黃色葡萄球菌腸毒素中毒和/或預防金黃色葡萄球菌腸毒素中毒。所述細胞可為人外周血單個核細胞。所述炎癥因子可為tnf-α和/或ifn-γ。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的產(chǎn)品，其活性成分可為如下(d1)、(d2)或(d3)：(d1)所述融合蛋白；(d2)所述編碼所述融合蛋白的核酸分子；(d3)含有所述編碼所述融合蛋白的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系。所述產(chǎn)品的功能可為抑制細胞分泌炎癥因子和/或與金黃色葡萄球菌腸毒素結(jié)合和/或治療金黃色葡萄球菌腸毒素中毒和/或預防金黃色葡萄球菌腸毒素中毒。所述n端元件作為功能片段的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述應用中，所述功能片段的用途可為與vβ蛋白的n端融合從而使其具有抑制細胞分泌炎癥因子和/或與金黃色葡萄球菌腸毒素結(jié)合和/或治療金黃色葡萄球菌腸毒素中毒和/或預防金黃色葡萄球菌腸毒素中毒的功能。編碼所述n端元件的核酸分子或編碼所述c端元件的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述編碼所述n端元件的核酸分子為如下c1)或c2)或c3)所示的dna分子：c1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第1至1755位所示的dna分子；c2)與c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述n端元件的dna分子；c3)在嚴格條件下與c1)或c2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述n端元件的dna分子。所述編碼所述n端元件的核酸分子可為如下d1)或d2)或d3)所示的dna分子：d1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第1801至2133位所示的dna分子；d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述n端元件的dna分子；d3)在嚴格條件下與d1)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述n端元件的dna分子。上述任一所述金黃色葡萄球菌腸毒素具體可為金黃色葡萄球菌腸毒素b。本發(fā)明還提供了一種制備融合蛋白的方法。本發(fā)明所提供的制備融合蛋白的方法，包括如下步驟：(1)將所述編碼所述融合蛋白的核酸分子插入酵母表達載體，得到重組表達載體；(2)將步驟(1)所述重組表達載體導入酵母宿主菌，得到重組菌；(3)培養(yǎng)步驟(2)所述重組菌，得到融合蛋白。上述方法中，所述酵母表達載體可為載體ppic9k。上述方法中，所述重組表達載體可為重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1。所述重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1具體可為向載體ppic9k的xhoi和ecori酶切位點之間插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的dna分子。上述方法中，所述酵母宿主菌可為畢赤酵母宿主菌gs115。上述方法中，所述步驟(3)中，所述培養(yǎng)可采用bmmy培養(yǎng)基。上述方法中，所述步驟(3)可為：采用bmmy培養(yǎng)基培養(yǎng)所述重組菌，培養(yǎng)過程中采用甲醇進行誘導。所述甲醇在所述培養(yǎng)的體系中的濃度可為0.5％。上述方法中，所述步驟(3)具體可為：采用bmmy培養(yǎng)基培養(yǎng)所述重組菌；所述培養(yǎng)的條件為30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)168h；所述培養(yǎng)的過程中，每24小時加入甲醇并使其在體系中的體積百分含量為0.5％(第一次加入甲醇的時間為培養(yǎng)24小時后)。所述bmmy培養(yǎng)基的溶質(zhì)及其濃度可為：1％(質(zhì)量百分比)酵母提取物、2％(質(zhì)量百分比)蛋白胨、1.34％(質(zhì)量百分比)酵母氮堿、4×10-5％(質(zhì)量百分比)生物素和0.5％(質(zhì)量百分比)甲醇，bmmy培養(yǎng)基的溶劑可為ph6.0、100mm磷酸鉀緩沖液。實驗證明，本發(fā)明所提供的融合蛋白hsa1-vβ1可對金黃色葡萄球菌腸毒素b引起的中毒休克進行救治：對seb中毒小鼠注射融合蛋白hsa1-vβ1后，小鼠血清中tnf-α的含量和ifn-γ的含量均比中毒休克組均顯著降低；對seb中毒小鼠延遲半小時注射融合蛋白hsa1-vβ1，小鼠血清中tnf-α的含量和ifn-γ的含量仍比中毒休克組均顯著降低?？梢娙诤系鞍議sa1-vβ1對seb引起的中毒休克有救治作用，具有重要的應用。附圖說明圖1為hsa1基因和vβ1基因的pcr擴增產(chǎn)物。其中m1為dnamarker，泳道1為實施例1中的pcr擴增產(chǎn)物1，泳道2為實施例1中的pcr擴增產(chǎn)物2。圖2為hsa1和vβ1融合后的pcr擴增產(chǎn)物。其中m1為dnamarker，泳道1為實施例1中的pcr擴增產(chǎn)物3。圖3為重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1的酶切鑒定結(jié)果。圖4為融合蛋白hsa1-vβ1表達的sds-page。圖5為融合蛋白hsa1-vβ1純化的sds-page。圖6為蛋白vβ表達的sds-page。圖7為蛋白vβ純化的sds-page。圖8為蛋白vβ純化的sds-page。圖9為vβ1基因的pcr擴增產(chǎn)物。其中m1為dnamarker，泳道1為實施例1中的pcr擴增產(chǎn)物4。圖10為蛋白vβ1表達的sds-page。圖11為蛋白vβ1與seb的結(jié)合活性。圖12為融合蛋白hsa1-vβ1與金黃色葡萄球菌腸毒素b的親和力分析。圖13為hsa與金黃色葡萄球菌腸毒素b的親和力分析。圖14為融合蛋白hsa1-vβ1體外抑制pbmc分泌細胞因子tnf-α。圖15為融合蛋白hsa1-vβ1體外抑制pbmc分泌細胞因子ifn-γ。圖16為融合蛋白hsa1-vβ1和金黃色葡萄球菌腸毒素b共孵育體內(nèi)救治中毒休克小鼠。圖17為融合蛋白hsa1-vβ1降低小鼠血清中tnf-α含量。圖18為融合蛋白hsa1-vβ1降低小鼠血清中ifn-γ含量。圖19為融合蛋白hsa1-vβ1推遲30min給藥對小鼠的體內(nèi)救治。圖20為延遲半小時注射融合蛋白hsa1-vβ1降低小鼠血清中ifn-γ含量。圖21為延遲半小時注射融合蛋白hsa1-vβ1降低小鼠血清中tnf-α含量。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。fortebioblitz單樣本分子相互作用分析儀為palllifesciences公司產(chǎn)品；aktafplc蛋白純化儀為ge公司產(chǎn)品，用于表達蛋白的純化；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀為biorad公司產(chǎn)品，用于純化蛋白的純度分析。金黃色葡萄球菌腸毒素b標準產(chǎn)毒株fris-6記載在如下文獻中：葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，雷祚榮，1992年9月第一版，中國科學技術(shù)出版社。人細胞因子tnf-α測定elisa試劑盒、人細胞因子ifn-γ測定elisa試劑盒、鼠細胞因子ifn-γ測定elisa試劑盒和鼠細胞因子tnf-α測定elisa試劑盒均為欣博盛生物科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號依次為cat#ehc103a、cat#ehc102g、cat#emc101g和cat#emc102a；脫鹽柱為thermoscientific公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為b2162579；人血清白蛋白(hsa)為華蘭生物工程重慶有限公司產(chǎn)品，國藥準字s20110310，批號為201206003；biotin標記試劑盒為thermo公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為21335；畢赤酵母宿主菌gs115為invitrogen公司產(chǎn)品，貨號為k1710-01；載體ppic9k為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為v175-20；載體pet43.1a為novagen公司產(chǎn)品，貨號為70939-3；載體puc57為biomicsbiotech公司產(chǎn)品，貨號為bk0033；phenylhp為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為18-1172-87ac；s30q柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為17-1275-01；deae層析柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為71-5017-51ag；source30s為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為17-1273-20。bmgy培養(yǎng)基的溶質(zhì)及其濃度為：1％(質(zhì)量百分比)酵母提取物、2％(質(zhì)量百分比)蛋白胨、1.34％(質(zhì)量百分比)酵母氮堿、4×10-5％(質(zhì)量百分比)生物素和1％(質(zhì)量百分比)甘油，bmgy培養(yǎng)基的溶劑為ph6.0、100mm磷酸鉀緩沖液。bmmy培養(yǎng)基的溶質(zhì)及其濃度為：1％(質(zhì)量百分比)酵母提取物、2％(質(zhì)量百分比)蛋白胨、1.34％(質(zhì)量百分比)酵母氮堿、4×10-5％(質(zhì)量百分比)生物素和0.5％(質(zhì)量百分比)甲醇，bmmy培養(yǎng)基的溶劑為ph6.0、100mm磷酸鉀緩沖液。封閉液：向ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液中加入牛血清蛋白(bsa)，使牛血清蛋白含量為3％(質(zhì)量百分比)。洗滌液：含0.5‰吐溫-20的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液。在下述實施例中，根據(jù)文獻中記載的制備方法制備金黃色葡萄球菌腸毒素b(staphylococcalenterotoxinb，seb)；seb的制備方法記載在如下文獻中：gul，etal.evaluationofarecombinantdoublemutantofstaphylococcalenterotoxinb(seb-h32q/k173e)withenhancedantitumoractivityeffectsanddecreasedpyrexia.plosone.2013；8(2)：e55892.doi：10.1371/journal.pone.0055892.epub2013feb6.。seb的核苷酸序列如序列表中序列5所示，編碼序列表中序列6所示的氨基酸序列。c57bl/6鼠為解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心產(chǎn)品，在下文中命名為小鼠。balb/c小鼠為解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心產(chǎn)品。實施例1、融合蛋白hsa1-vβ1的表達和純化一、重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1的構(gòu)建1、序列表序列3為未經(jīng)密碼子優(yōu)化的vβ基因的核苷酸序列，其編碼的蛋白質(zhì)(以下簡稱蛋白vβ)的氨基酸序列如序列表序列2的第601位至第711位所示。經(jīng)過大量預實驗，對序列表中序列3所示的vβ基因按照畢赤酵母密碼子偏愛性進行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因命名為vβ1基因，其核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端第1801至2133位所示，編碼的蛋白質(zhì)(以下簡稱蛋白vβ1)的氨基酸序列如序列表序列2的第601位至第711位所示。2、人工合成序列表中序列1自5’末端第1801至2133位所示的雙鏈dna分子。3、向載體puc57的限制性內(nèi)切酶ecorv的識別位點插入步驟2合成的雙鏈dna分子，得到重組質(zhì)粒puc57-vβ1。4、以步驟3得到的重組質(zhì)粒puc57-vβ1為模板，以人工合成的vβ1-f:5’-gaagctgttgttactc-3’(雙下劃線的序列為部分linker的核苷酸序列，單下劃線的序列為序列表中序列1自5’末端第1801至1816位所示)和vβ1-r:5’-gcttacaagacggacaatctggtac-3’(波浪線為限制性內(nèi)切酶ecori的識別序列，單下劃線為序列表中序列1自5’末端第2114至2133位的反向互補序列)為引物，進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物1。反應程序：95℃3min預變性；95℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，30個循環(huán)；72℃延伸10min。5、反應結(jié)束后，對pcr擴增產(chǎn)物1進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，步驟4擴增獲得了長度約為378bp的pcr擴增產(chǎn)物1(命名為dna片段1)。回收并純化dna片段1。6、序列表序列4為未經(jīng)密碼子優(yōu)化的hsa基因的核苷酸序列，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第585位所示。經(jīng)過大量預實驗，對序列表中序列4所示的hsa基因按照畢赤酵母密碼子偏愛性進行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因命名為hsa1基因，其核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端第1至1755位所示，編碼的蛋白質(zhì)(以下簡稱蛋白hsa1)的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第585位所示。7、人工合成序列表中序列1自5’末端第1至1755位所示的雙鏈dna分子。8、向載體puc57的限制性內(nèi)切酶ecorv的識別位點插入步驟7合成的雙鏈dna分子，得到重組質(zhì)粒puc57-hsa1。9、以步驟8得到的重組質(zhì)粒puc57-hsa1為模板，以人工合成的hsa1-f:5’-ccgaaaagagatgctcataagtctg-3’(波浪線為限制性內(nèi)切酶xhoi的識別序列，單下劃線為序列表中序列1自5’末端第1至16位所示)和hsa-1r:5’-cagtccaagagcagct-3’(雙下劃線的序列為部分linker的核苷酸序列，單下劃線的序列為序列表中序列1自5’末端第1740至1755位的反向互補序列)為引物，進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物2。反應程序：95℃3min預變性；95℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。10、反應結(jié)束后，對pcr擴增產(chǎn)物2進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，步驟9擴增獲得了長度約為1.8kb的pcr擴增產(chǎn)物2(命名為dna片段2)。回收并純化dna片段2。11、將1μgdna片段1和1μgdna片段2混合并作為模板，以步驟9中所述hsa1-f和步驟4中所述vβ1-r為引物，進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物3。反應程序：95℃3min預變性；95℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。12、反應結(jié)束后，對pcr擴增產(chǎn)物3進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，步驟11擴增獲得了長度約為2133bp的pcr擴增產(chǎn)物3(命名為dna片段3)。回收并純化dna片段3。13、用限制性內(nèi)切酶xhoi和ecori雙酶切步驟12獲得的dna片段3，回收酶切產(chǎn)物1。14、用限制性內(nèi)切酶xhoi和ecori雙酶切載體ppic9k，回收約9.3kb載體骨架1。15、將酶切產(chǎn)物1和載體骨架1連接，得到重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1。用限制性內(nèi)切酶xhoi和ecori雙酶切重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1，酶切產(chǎn)物中僅有兩種dna片段且其大小分別為2133bp和9300bp(圖3)。根據(jù)測序結(jié)果，對步驟15獲得的重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1進行結(jié)構(gòu)描述如下：向載體ppic9k的xhoi和ecori酶切位點之間插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的dna分子。重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1表達的蛋白為融合蛋白hsa1-vβ1，融合蛋白hsa1-vβ1的氨基酸序列如序列表序列2的所示。蛋白hsa1的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第585位所示。蛋白vβ1的氨基酸序列如序列表序列2的第601位至第711位所示。二、融合蛋白hsa1-vβ1的表達和純化取步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1，用限制性內(nèi)切酶sali酶切，進行線性化，獲得線性化重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1。將線性化重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1電轉(zhuǎn)化導入畢赤酵母宿主菌gs115中，得到含有重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1的轉(zhuǎn)基因酵母，命名為gs115/ppic9k-hsa1-vβ1。將載體ppic9k電轉(zhuǎn)化導入畢赤酵母宿主菌gs115中，得到含有載體ppic9k的轉(zhuǎn)基因酵母，命名為gs115/ppic9k，作為陰性對照。按照下述步驟進行融合蛋白hsa1-vβ1的表達和純化：1、將gs115/ppic9k-hsa1-vβ1單菌落接種于5mlbmgy培養(yǎng)基，30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)36小時得到培養(yǎng)菌液；將2ml培養(yǎng)菌液收集于離心管，以3000g離心力離心5min，棄上清，收集菌體。2、將步驟1收集的菌體用30mlbmmy培養(yǎng)基重懸，得到菌懸液，然后30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)168h(培養(yǎng)過程中，每24小時加入甲醇并使其在體系中的體積百分含量為0.5％，第一次加入甲醇的時間為培養(yǎng)24小時后)。培養(yǎng)過程中每24小時取樣1ml，11000rpm離心1min，收集上清液。3、將步驟2得到的各個上清液進行sds-page。結(jié)果見圖4(圖4中，m1為蛋白質(zhì)分子量marker；泳道1至8依次為gs115/ppic9k-hsa1-vβ1培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h后的上清液；泳道9為gs115/ppic9k培養(yǎng)72h后的上清液)；結(jié)果表明，融合蛋白hsa1-vβ1存在于培養(yǎng)gs115/ppic9k-hsa1-vβ1得到的上清液中，融合蛋白hsa1-vβ1的分子量為78kda。4、完成步驟2后，取gs115/ppic9k-hsa1-vβ1培養(yǎng)168h后的上清液，8000離心20min，過濾，將上清液濃縮至原有體積的1/10～1/20，命名為濃縮上清液。5、向步驟4獲得的濃縮上清液中加入2倍體積的ph8.0、50mmtris-hcl緩沖液和硫酸銨，得到上樣液；硫酸銨在上樣液中的濃度為1m。6、將步驟5制備的上樣液上樣至phenylhp(上樣速度為3ml/min)，然后按照下述步驟進行洗脫：(1)用含1m硫酸銨的ph7.5～8.2、20mmtris-hcl緩沖液洗脫1～2個柱體積以洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白。(2)完成步驟(1)后，用ph7.5～8.2、20mmtris-hcl緩沖液進行洗脫，收集并合并紫外吸收峰高于基線50～100mau的洗脫產(chǎn)物。(3)將步驟(2)收集的洗脫產(chǎn)物用脫鹽柱透析除鹽，再置換入20mmtris-hcl緩沖液中。(4)將完成步驟(3)的產(chǎn)物上樣至s30q柱，用ph7.8～8.2、20mmtris-hcl緩沖液洗脫1～2個柱體積以洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白。(5)完成步驟(4)后，用含1mnacl的ph7.8～8.2、20mmtris-hcl緩沖液進行洗脫，收集并合并紫外吸收峰高于基線50～100mau的洗脫產(chǎn)物，得到的溶液即為融合蛋白hsa1-vβ1溶液。用gs115/ppic9k代替gs115/ppic9k-hsa1-vβ1進行上述步驟，得到對照溶液。將步驟(5)收集的不同的洗脫峰進行sds-page，測定融合蛋白hsa1-vβ1的純度。sds-page實驗結(jié)果見圖5(m為蛋白質(zhì)分子量marker，泳道1為紫外吸收峰高于基線50au的洗脫產(chǎn)物，泳道2為紫外吸收峰高于基線80au的洗脫產(chǎn)物)，結(jié)果表明，融合蛋白hsa1-vβ1溶液中融合蛋白hsa1-vβ1的純度大于90％。實施例2、蛋白vβ的表達和純化一、重組質(zhì)粒pet43.1a-vβ的構(gòu)建(1)人工合成序列表中序列3所示的雙鏈dna分子。(2)以步驟1合成的雙鏈dna分子為模板，以人工合成的vβ-f:cgcatatggaggctgtcgtcacccaaagcccaa(下劃線為限制性內(nèi)切酶ndei的識別序列)和vβ-r:ggaattcttataggaccgatagtcgggtgcccgca(下劃線為限制性內(nèi)切酶ecori的識別序列)為引物，進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物。反應程序：97℃預變性7min；95℃1min，60℃1min，72℃30sec，30個循環(huán)；72℃延伸7min。(3)用限制性內(nèi)切酶ndei和ecori雙酶切步驟2獲得的pcr擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(4)用限制性內(nèi)切酶ndei和ecori雙酶切載體pet43.1a，回收約7.3kb載體骨架。(5)將步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物和步驟(4)得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pet43.1a-vβ。根據(jù)測序結(jié)果，對步驟(5)獲得的重組質(zhì)粒pet43.1a-vβ進行結(jié)構(gòu)描述如下：向載體pet43.1a的ndei和ecori酶切位點之間插入核苷酸序列是序列表中的序列3所示的dna分子。二、蛋白vβ的表達取步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pet43.1a-vβ轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)，得到含有重組質(zhì)粒pet43.1a-vβ的重組大腸桿菌，命名為bl21/pet43.1a-vβ。1、將bl21/pet43.1a-vβ單菌落接種于5mllb培養(yǎng)基(將10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10gnacl氯化鈉溶于1l蒸餾水)，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)4小時得到培養(yǎng)菌液。2、向步驟1得到的培養(yǎng)菌液中加入iptg，使iptg在體系中的濃度為1mm，然后37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)4小時，以3000g離心力離心15min，棄上清，收集菌體。3、取步驟2收集的菌體，用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液重懸，然后超聲破碎，得到菌體破碎液。將該菌體破碎液8000rpm離心10min，得到菌體破碎上清液和菌體破碎沉淀。將步驟3得到的菌體破碎上清液和菌體破碎沉淀分別進行sds-page。實驗結(jié)果見圖6(泳道m(xù)為蛋白質(zhì)分子量marker，泳道1為菌體破碎上清液，泳道2為菌體破碎沉淀，箭頭所指為蛋白vβ)。結(jié)果表明，蛋白vβ主要存在于包涵體，大小約為14kd。三、蛋白vβ的純化1、取步驟二中3得到的菌體破碎液，首先依次用含0.1％tritonx-100和2m脲的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液洗滌，然后用含8m脲的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解包涵體，命名為溶解液。2、用a1液(含8m脲的ph8.0、0.02mol/ltris-hcl緩沖液)透析步驟1獲得的溶解液，獲得透析液1。3、用5倍柱體積的a1液平衡deae層析柱，然后上樣步驟2獲得的透析液1(收集上樣穿透液)，然后進行如下洗脫(洗脫過程中實時監(jiān)測紫外吸收值，檢測波長為280nm)：首先用10％b1液(含8m脲和1mnacl的ph8.0、0.02mol/ltris-hcl緩沖液)洗脫(紫外吸收值從50au開始繼續(xù)上升然后下降至80au，出現(xiàn)第一個峰)，然后用20％b1液洗脫(紫外吸收值從50au開始繼續(xù)上升然后下降至80au，出現(xiàn)第二個峰)，然后用b1液洗脫(紫外吸收值從50au開始繼續(xù)上升然后下降至80au，出現(xiàn)第三個峰)，每種洗脫液收集峰值對應的20ml過柱后溶液。10％b1液由1體積份b1液和9體積份a1液組成。20％b1液由2體積份b1液和8體積份a1液組成。進行sds-page，實驗結(jié)果見圖7(泳道m(xù)為蛋白質(zhì)分子量marker，s1為上樣液，c1為穿透液，10％b1為用10％b1液進行洗脫的洗脫收集液，20％b1用20％b1液進行洗脫的洗脫收集液，100％b1用b1液進行洗脫的洗脫收集液)。結(jié)果表明，蛋白vβ幾乎全部穿透。4、用a2液(含8m脲的ph4.9、25mmol/lnaac-hac緩沖液)透析步驟3用b1液洗脫獲得的洗脫收集液，獲得透析液2。5、用5倍柱體積的a2液平衡source30s層析柱，然后上樣步驟4獲得的透析液2(收集上樣穿透液)，然后進行如下洗脫(洗脫過程中實時監(jiān)測紫外吸收值，檢測波長為280nm)：首先用2％b2液(含8m脲和1mnacl的ph4.9、25mmol/lnaac-hac緩沖液)洗脫(紫外吸收值從50au開始繼續(xù)上升然后下降至80au，出現(xiàn)第一個峰)，然后用b2液洗脫(紫外吸收值從50au開始繼續(xù)上升然后下降至80au，出現(xiàn)第二個峰)，實驗過程中，2％b2液洗脫液收集峰值對應的20ml過柱后溶液(5ml/管，共4管)，b2液洗脫液收集峰值對應的20ml過柱后溶液(20ml/管，共2管)。2％b2液由2體積份b2液和98體積份a2液組成。進行sds-page，實驗結(jié)果見圖8(泳道m(xù)為蛋白質(zhì)分子量marker，s2為上樣液，c2-1為穿透液-1，c2-2為穿透液-2，2％b2-1、2％b-2、2％b-3和2％b-4為用2％b2液進行洗脫的洗脫收集液，100％b2為用b2液進行洗脫的洗脫收集液)。結(jié)果表明，用2％b2液進行洗脫的洗脫液中蛋白vβ的純度較高，用b2液進行洗脫的洗脫液中含有蛋白vβ和雜蛋白。步驟5收集的洗脫產(chǎn)物即為蛋白vβ溶液，蛋白vβ溶液中蛋白vβ濃度為1mg/ml。結(jié)果表明，蛋白vβ可以實現(xiàn)很好的分離純化，純度>95％。四、蛋白vβ的復性條件摸索(1)不同ph值蛋白復性緩沖液對復性的影響取步驟1的蛋白vβ溶液，用ph7.5、0.01mol/lpbs緩沖液、ph8.0、0.01mol/lpbs緩沖液、ph8.5、0.01mol/lpbs緩沖液、ph9.0、0.01mol/lpbs緩沖液或ph9.5、0.01mol/lpbs緩沖液處理48h。結(jié)果表明，用ph7.5、0.01mol/lpbs緩沖液或ph8.0、0.01mol/lpbs緩沖液處理后，蛋白vβ均在去除變性劑的過程中發(fā)生聚集沉淀，用ph8.5、0.01mol/lpbs緩沖液、ph9.0、0.01mol/lpbs緩沖液或ph9.5、0.01mol/lpbs緩沖液處理后，蛋白vβ均在全部去除變性劑后發(fā)生聚集沉淀。(2)梯度降低變性劑濃度對復性的影響取步驟1的蛋白vβ溶液，然后采用透析復性的方法，梯度降低復性液中變性劑的濃度，即由含8m脲的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液依次降低為含4m脲的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液、含2m脲的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液、含1m脲的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液、含0.5m脲的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液和ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液。結(jié)果表明，在含1m脲的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液降低為含0.5m脲的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液的透析復性過程中，蛋白vβ發(fā)生聚集沉淀。(3)不同蛋白vβ濃度對復性的影響取步驟1的蛋白vβ溶液，用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液分別稀釋至0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.06mg/ml和0.05mg/ml，獲得溶液1、溶液2、溶液3和溶液4。取溶液1、溶液2、溶液3或溶液4，按照步驟(2)的方法，進行透析復性。結(jié)果表明，蛋白vβ均在全部去除變性劑后發(fā)生聚集沉淀。(4)稀釋復性對復性的影響取步驟1的蛋白vβ溶液，用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液稀釋至50倍體積或100倍體積，得到蛋白稀釋液。取所述蛋白稀釋液，用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液處理48h，然后濃縮20倍，按照步驟(2)的方法，進行透析復性。結(jié)果表明，蛋白vβ在全部去除變性劑后發(fā)生聚集沉淀。上述結(jié)果表明，經(jīng)過大量復性實驗，仍未獲得vβ蛋白。實施例3、蛋白vβ1的表達和純化一、重組質(zhì)粒ppic9k-vβ1的構(gòu)建1、以實施例1步驟一3得到的重組質(zhì)粒puc57-vβ1為模板，以人工合成的vβ1-xhoi：5’-ctcgagaaaagagaagctgttgttac-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶xhoi的識別序列)和vβ1-ecori：5’-ggaattccttacaagacggacaatctggtac-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶ecori的識別序列)為引物進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物4。反應程序：95℃3min預變性；95℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，30個循環(huán)；72℃延伸10min。2、反應結(jié)束后，對pcr擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖9。結(jié)果表明，步驟1擴增獲得了長度約為355bp的pcr擴增產(chǎn)物(命名為dna片段4)?；厥詹⒓兓痙na片段4。3、用限制性內(nèi)切酶xhoi和ecori雙酶切步驟2獲得的dna片段4，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶xhoi和ecori雙酶切載體ppic9k，回收約9.3kb載體骨架。5、將酶切產(chǎn)物和載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒ppic9k-vβ1。根據(jù)測序結(jié)果，對步驟5獲得的重組質(zhì)粒ppic9k-vβ1進行結(jié)構(gòu)描述如下：向載體ppic9k的xhoi和ecori酶切位點之間插入核苷酸序列是序列表中的序列1自5’末端第1801至2133位所示的dna分子。二、蛋白vβ1的表達取步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒ppic9k-vβ1，用限制性內(nèi)切酶sali酶切，進行線性化，獲得線性化重組質(zhì)粒ppic9k-hsa1-vβ1。將線性化重組質(zhì)粒ppic9k-vβ1電轉(zhuǎn)化導入畢赤酵母宿主菌gs115中，得到含有重組質(zhì)粒ppic9k-vβ1的轉(zhuǎn)基因酵母，命名為gs115/ppic9k-vβ1。將載體ppic9k電轉(zhuǎn)化導入畢赤酵母宿主菌gs115中，得到含有載體ppic9k的轉(zhuǎn)基因酵母，命名為gs115/ppic9k，作為陰性對照。按照下述步驟進行蛋白vβ1的表達：1、將gs115/ppic9k-vβ1或gs115/ppic9k單菌落接種于5mlbmgy培養(yǎng)基，30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)36小時得到培養(yǎng)菌液；將2ml培養(yǎng)菌液收集于離心管，以3000g離心力離心5min，棄上清，收集菌體。2、將步驟1收集的菌體用30mlbmmy培養(yǎng)基重懸，得到菌懸液，然后30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)168h(培養(yǎng)過程中，每24小時加入0.5％(體積比)甲醇，第一次加入甲醇的時間為培養(yǎng)24小時后)。培養(yǎng)過程中每24小時取樣1ml，11000rpm離心1min，收集上清液。3、將步驟2得到的各個上清液進行sds-page。結(jié)果見圖10(圖10中，m1為蛋白質(zhì)分子量marker；泳道1至7依次為gs115/ppic9k-hsa1-vβ1培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h后的上清液；泳道8為gs115/ppic9k培養(yǎng)72h后的上清液)；結(jié)果表明，蛋白vβ1存在于培養(yǎng)gs115/ppic9k-hsa1-vβ1得到的上清液中，蛋白vβ1的分子量為14kd。三、蛋白vβ1與seb的結(jié)合活性1、蛋白vβ1與seb的結(jié)合活性(1)取酶標板，用步驟二中2的gs115/ppic9k-vβ1培養(yǎng)168h后的上清液作為包被原進行包被(用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液稀釋步驟二中2的gs115/ppic9k-vβ1培養(yǎng)168h后的上清液中的蛋白vβ1，設(shè)置包被濃度為25μg/ml或50μg/ml，每孔加入100μl)。(2)完成步驟(1)后，向酶標板每孔加入200μl封閉液，用封口膜封好微孔板，37℃封閉90min，然后棄上清，用洗滌液洗滌(洗滌5次，每次加入300μl洗滌液，每次洗滌3min)，拍干；(3)完成步驟(2)后，每孔加入100μlseb溶液(用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液稀釋seb，使其濃度分別為0ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml或10ng/ml)，用封口膜封好，37℃孵育30min；然后棄上清，用洗滌液洗滌(洗滌5次，每次加入300μl洗滌液，每次洗滌3min)，拍干；(4)完成步驟(3)后，測量在450nm處的吸光值。2、按照上述方法，將gs115/ppic9k-vβ1培養(yǎng)168h后的上清液替換為gs115/ppic9k培養(yǎng)168h后的上清液，其它步驟均不變，作為陰性對照。3、取酶標板，用seb單克隆抗體(制備方式具體為用seb免疫balb/c小鼠，然后取脾與同系骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤，篩選陽性的雜交瘤克隆腹腔接種balb/c小鼠，收集腹水純化即得到seb單克隆抗體，以下簡稱seb單抗，制備方法具體參考文獻：葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，雷祚榮，第109頁，1992年9月第一版，中國科學技術(shù)出版社。)作為包被原進行包被(用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液稀釋seb單抗，設(shè)置包被濃度為5μg/ml，每孔加入100μl)，然后按照步驟1中(2)至(4)的方法，其它步驟均不變，作為陽性對照。實驗結(jié)果見圖11，結(jié)果表明，蛋白vβ1沒有seb結(jié)合活性。實施例4、融合蛋白hsa1-vβ1與seb的親和力測定1、biotin-seb蛋白溶液的制備參考biotin標記試劑盒的操作步驟，將seb進行生物素標記，具體步驟如下：1)取脫鹽柱，放入15ml離心管中，1000g離心2min，棄液體。2)向完成步驟1)的脫鹽柱中加入ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液2.5ml，1000g離心2min，棄液體。3)重復步驟2)兩次。4)取完成步驟3)的脫鹽柱，置于新的15ml離心管中，然后加入濃度為1mg/mlseb溶液(溶劑為ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液)1ml，1000g離心2min，收集液體。5)取步驟4)收集的液體，加入生物素化試劑(biotin標記試劑盒中的組件)70μl和ddh2o180μl；4℃標記2.5h，獲得標記的蛋白溶液。6)另取脫鹽柱，重復步驟1)、2)和3)。7)將步驟5)獲得的標記的蛋白溶液加入完成步驟6)的脫鹽柱，1000g離心2min，收集液體，即為biotin-seb蛋白溶液。2、融合蛋白hsa1-vβ1與seb的親和力測定(1)取步驟1制備的biotin-seb蛋白溶液，用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液稀釋至biotin-seb蛋白的濃度為50μg/ml，得到biotin-seb蛋白工作液。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液稀釋實施例1制備的融合蛋白hsa1-vβ1溶液，依次獲得融合蛋白hsa1-vβ1濃度為3197nm的溶液1、319.7nm的溶液2、31.97nm的溶液3和15.98nm的溶液4。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液稀釋hsa，依次獲得hsa濃度為3108nm的溶液5、310.8nm的溶液6、31.08nm的溶液7和15.54nm的溶液8。(2)參照fortebioblitz單樣本分子相互作用分析儀的操作步驟，先將biotin-seb蛋白工作液中的biotin-seb蛋白包被到sasensor上，然后將已包被biotin-seb蛋白的sasensor置于步驟(1)配制的溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5、溶液6、溶液7或溶液8；設(shè)置結(jié)合和解離時間均為120s。(3)運用fortebioblitz單樣本分子相互作用分析儀軟件計算親和力常數(shù)。融合蛋白hsa1-vβ1與seb的親和力測定實驗結(jié)果見圖12。hsa與seb的親和力測定實驗結(jié)果見圖13。結(jié)果表明，融合蛋白hsa1-vβ1與seb的親和力常數(shù)為7.272×10-9m，hsa與seb基本沒有親和力。實施例5、融合蛋白hsa1-vβ1抑制外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)分泌炎癥因子1、人pbmc的分離(1)將1體積份人全血和1體積份不含小牛血清的1640培養(yǎng)基(gibco公司產(chǎn)品，貨號為c11875500bt)混勻，獲得細胞溶液。(2)取10ml離心管，加入淋巴細胞分離液(ge公司產(chǎn)品，貨號為17-1440-02)到三分之一處，然后用吸管將步驟(1)獲得的細胞溶液貼著管壁緩緩加入，到離心管的10ml刻度處，保持界面清晰；2000rpm離心25min。(3)完成步驟(2)后，取所述離心管，吸取中間細胞層，即為外周血單個核細胞層細胞。(4)取50ml滅菌離心管，先加入步驟(3)獲得的外周血單個核細胞層細胞，再加入5倍體積的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液洗滌，1500rpm離心10min。(5)取完成步驟(4)后的下層液相置于新的50ml滅菌離心管，加入5倍體積的ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液洗滌，1500rpm離心10min。(6)取完成步驟(5)后的下層液相(即人pbmc)，加入1ml含10％fbs的1640培養(yǎng)基(gibco公司,貨號c11875500bt)重懸，獲得人pbmc懸浮液。2、融合蛋白hsa1-vβ1抑制pbmc分泌炎癥因子(1)用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液稀釋實施例1制備的融合蛋白hsa1-vβ1溶液，獲得濃度不同的融合蛋白hsa1-vβ1稀釋液。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液稀釋hsa，獲得hsa稀釋液。(2)取24孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入1ml步驟1分離的人pbmc懸浮液(每孔約1×106個細胞)，然后加入seb(每孔10μl，seb在孔中的濃度為10ng/ml)。(3)完成步驟(2)后，加入步驟(1)配制的融合蛋白hsa1-vβ1稀釋液(每孔10μl，使融合蛋白hsa1-vβ1在孔中的濃度為16nm、32nm、63.9nm)，5％co2、37℃孵育16h，收集上清，然后按照人細胞因子tnf-α測定elisa試劑盒和人細胞因子ifn-γ測定elisa試劑盒的操作步驟，檢測上清中細胞因子的含量。測定方法和步驟按自帶說明書進行。(4)完成步驟(2)后，加入步驟(1)配制的hsa稀釋液(每孔10μl，使hsa在孔中的濃度為63.9nm)，5％co2、37℃孵育16h，收集上清，然后用人細胞因子tnf-α測定elisa試劑盒和人細胞因子ifn-γ測定elisa試劑盒分別檢測上清中細胞因子的含量。測定方法和步驟按自帶說明書進行。在24孔細胞培養(yǎng)板中設(shè)置陽性對照孔，每個陽性對照孔加入1ml步驟1分離的人pbmc懸浮液(每孔約1×106個細胞)和seb(每孔10μl，seb在孔中的濃度為10ng/ml)。在24孔細胞培養(yǎng)板中設(shè)置陰性對照孔，每個陰性對照孔加入1mlph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液。將陽性對照孔和陰性對照孔在5％co2、37℃孵育16h，收集上清，然后用人細胞因子tnf-α測定elisa試劑盒和人細胞因子ifn-γ測定elisa試劑盒分別檢測上清中細胞因子的含量，測定方法和步驟按自帶說明書進行。實驗結(jié)果見圖14和圖15(其中pbs為陰性對照，seb為陽性對照)。結(jié)果表明，融合蛋白hsa1-vβ1可以顯著抑制炎癥因子tnf-α和ifn-γ的表達，且具有量效關(guān)系，抑制率分別達到80％和49％。hsa則不能抑制炎癥因子tnf-α和ifn-γ的表達。實施例6、融合蛋白hsa1-vβ1體內(nèi)救治seb中毒休克小鼠一、不同劑量融合蛋白hsa1-vβ1與seb預孵育的中毒救治實驗1、預孵育混合液的配制用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解seb，獲得濃度為0.3nmol/ml的seb溶液1。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解融合蛋白hsa1-vβ1，獲得濃度為3.2nmol/ml的融合蛋白hsa1-vβ1溶液1。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解融合蛋白hsa1-vβ1，獲得濃度為16nmol/ml的融合蛋白hsa1-vβ1溶液2。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解hsa，獲得濃度為3.2nmol/ml的hsa溶液1。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解hsa，獲得濃度為16nmol/ml的hsa溶液2。預孵育混合液1：將100μl的seb溶液1和100μl的融合蛋白hsa1-vβ1溶液1混合，4℃孵育12h，得到預孵育混合液1；預孵育混合液1中融合蛋白hsa1-vβ1和seb的摩爾比為10：1。預孵育混合液2：將100μl的seb溶液1和100μl的融合蛋白hsa1-vβ1溶液2混合，4℃孵育12h，得到預孵育混合液2；預孵育混合液2中融合蛋白hsa1-vβ1和seb的摩爾比為50：1。預孵育混合液3由100μl的seb溶液1和100μl的hsa溶液1混合，4℃孵育12h，得到預孵育混合液3；預孵育混合液3中hsa和seb的摩爾比為10：1。預孵育混合液4由100μl的seb溶液1和100μl的hsa溶液2混合，4℃孵育12h，得到預孵育混合液4；預孵育混合液4中hsa和seb的摩爾比為50：1。2、將80只8周齡體重為20～22g左右的小鼠隨機分成八組(每組10只)，分別進行如下處理：pbs：腹腔注射ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液處理，注射劑量為200μl/只；seb+lps(中毒休克組)：先腹腔注射seb溶液1，注射劑量為0.03nmol/只；4h后，腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只；lps：腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只；seb：腹腔注射seb溶液1處理，注射劑量為0.03nmol/只；seb+hsa1-vβ1組1(1.6μmhsa1-vβ1救治組1)：腹腔注射預孵育混合液1，注射劑量為200μl/只；4h后，腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只；seb+hsa1-vβ1組2(8μmhsa1-vβ1救治組2)：腹腔注射預孵育混合液2，注射劑量為200μl/只；4h后，腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只；seb+lps+hsa組1(1.6μmhsa對照組1)：腹腔注射預孵育混合液3，注射劑量為200μl/只；4h后，腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只；seb+lps+hsa組2(8μmhsa對照組2)：腹腔注射預孵育混合液4，注射劑量為200μl/只；4h后，腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只。3、步驟2各處理完成2h后，從小鼠尾靜脈取血，然后用鼠細胞因子ifn-γ測定elisa試劑盒和鼠細胞因子tnf-α測定elisa試劑盒分別檢測小鼠血清中細胞因子的含量，測定方法和步驟按自帶說明書進行。步驟2各處理完成72h內(nèi)，對小鼠的存活率進行統(tǒng)計(時間點為0h、12h、24h、36h、48h、60h或72h)。小鼠的存活率的實驗結(jié)果見圖16。結(jié)果表明，1.6μmhsa1-vβ1救治組1中60％的小鼠存活超過72小時，具有顯著的統(tǒng)計學意義；1.6μmhsa救治組1中約20％～30％的小鼠存活超過72小時。小鼠血清中細胞因子的含量的檢測結(jié)果見圖17和圖18，結(jié)果表明，8μmhsa1-vβ1救治組1中tnf-α的含量為中毒休克組的18.3％，1.6μmhsa1-vβ1救治組2中tnf-α的含量為中毒休克組的33％，1.6μmhsa1-vβ1救治組1中ifn-γ的含量為中毒休克組的10.8％，8μmhsa1-vβ1救治組2中ifn-γ的含量為中毒休克組的16％，均顯著降低。二、延遲半小時注射融合蛋白hsa1-vβ1的中毒救治效果評價1、預孵育混合液的配制用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解seb，獲得濃度為0.15nmol/ml的seb溶液1。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解融合蛋白hsa1-vβ1，獲得濃度為1.6nmol/ml的融合蛋白hsa1-vβ1溶液3。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解融合蛋白hsa1-vβ1，獲得濃度為8nmol/ml的融合蛋白hsa1-vβ1溶液4。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解hsa，獲得濃度為1.6nmol/ml的hsa溶液3。用ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液溶解hsa，獲得濃度為8nmol/ml的hsa溶液4。2、將80只8周齡體重為18～22g左右的小鼠隨機分成八組(每組10只)，分別進行如下處理：pbs：腹腔注射ph7.2、0.01mol/lpbs緩沖液處理，注射劑量為200μl/只；seb+lps(中毒休克組)：先腹腔注射seb溶液1，注射劑量為0.03nmol/只；4h后，腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只；lps：腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只；seb：腹腔注射seb溶液1處理，注射劑量為0.03nmol/只；seb+lps+hsa1-vβ1組3(1.6μmhsa1-vβ1救治組3)：先腹腔注射seb溶液1，注射劑量為200μl/只；半小時后，腹腔注射融合蛋白hsa1-vβ1溶液3，注射劑量為200μl/只；3.5h后，腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只；seb+lps+hsa1-vβ1組4(8μmhsa1-vβ1救治組4)：先腹腔注射seb溶液1，注射劑量為200μl/只；半小時后，腹腔注射融合蛋白hsa1-vβ1溶液4，注射劑量為200μl/只；3.5小時后，腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只；seb+lps+hsa組3(1.6μmhsa對照組3)：先腹腔注射seb溶液1，注射劑量為200μl/只；半小時后，腹腔注射hsa溶液3，注射劑量為200μl/只；3.5小時后，腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只；seb+lps+hsa組4(8μmhsa對照組4)：先腹腔注射seb溶液1，注射劑量為200μl/只；半小時后，腹腔注射hsa溶液4，注射劑量為200μl/只；3.5小時后，腹腔注射lps處理，注射劑量為80μg/只。3、步驟2各處理完成2h后，從小鼠尾靜脈取血，然后用鼠細胞因子ifn-γ測定elisa試劑盒和鼠細胞因子tnf-α測定elisa試劑盒分別檢測小鼠血清中細胞因子的含量，測定方法和步驟按自帶說明書進行。步驟2各處理完成72h內(nèi)，對小鼠的存活率進行統(tǒng)計(時間點為0h、12h、24h、36h、48h、60h或72h)。延遲半小時注射融合蛋白hsa1-vβ1，小鼠的存活率的實驗結(jié)果見圖19。結(jié)果表明，1.6μmhsa1-vβ1救治組3中70％的小鼠存活超過72小時，具有顯著的統(tǒng)計學意義；1.6μmhsa救治組3中僅20％的小鼠存活超過72小時。延遲半小時注射融合蛋白hsa1-vβ1，小鼠血清中細胞因子的含量的檢測結(jié)果見圖20和圖21，結(jié)果表明，1.6μmhsa1-vβ1救治組3中tnf-α的含量為中毒休克組的34.6％，1.6μmhsa1-vβ1救治組3中ifn-γ的含量為中毒休克組的20.3％，均顯著降低。當前第1頁12