本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種雞卵黃抗體的純化方法。
背景技術(shù)：
：卵黃抗體(eggyolkimmunoglobulin,igy)是母雞產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，存在于血清和卵黃中。與哺乳動(dòng)物igg相比，使用卵黃抗體具有獨(dú)特的優(yōu)勢，包括小劑量抗原免疫雞可產(chǎn)生高滴度抗體，收集雞蛋進(jìn)行抗體分離純化十分方便，雞對哺乳動(dòng)物保守蛋白能產(chǎn)生更好的抗體應(yīng)答，卵黃抗體具有良好的熱穩(wěn)定性和ph耐受性。因此，卵黃抗體在疾病防治、診斷試劑等研究領(lǐng)域越來越受到重視和青睞。然而，卵黃抗體的實(shí)際應(yīng)用受到純化方法的制約，主要原因是卵黃含大量難以去除的脂質(zhì)成分。傳統(tǒng)的卵黃抗體純化方法有硫酸銨沉淀法、聚乙二醇沉淀法、水稀釋與超濾法、凝膠過濾法和層析法等，這些方法不僅步驟復(fù)雜、耗時(shí)，而且純化的卵黃抗體純度和產(chǎn)量均較低。鏈球菌g蛋白(spg)是一種免疫球蛋白結(jié)合蛋白，可用于哺乳動(dòng)物igg的純化，但不能用于禽卵黃抗體的純化。最近的研究資料顯示，spg免疫球蛋白結(jié)合區(qū)氨基酸替換可以改變其抗體親和性，從而能與雞卵黃抗體結(jié)合。類彈性蛋白多肽(elastin-likepolypeptide，elp)是根據(jù)人或動(dòng)物體內(nèi)彈性蛋白重復(fù)序列合成的聚合分子，具有溫度敏感的可逆相變特性，在低于特定溫度(相變溫度)的溶液中呈舒展的可溶狀態(tài)，在高于相變溫度的溶液中形成不溶性凝聚物，而且此過程是可逆的。因此，類彈性蛋白多肽融合蛋白不僅可用離心等簡單方法進(jìn)行分離純化，而且純化效率與親和層析法相當(dāng)，具有很好的應(yīng)用前景。本發(fā)明將elp的可逆相變特性與spgc2結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白親和力相結(jié)合，用大腸桿菌表達(dá)的elp-c2融合蛋白進(jìn)行雞卵黃抗體的純化，旨在簡化純化工藝、降低制備成本。盡管這種策略在理論上是可行的，但在設(shè)計(jì)時(shí)還面臨以下具體問題：elp-c2融合序列能否在大腸桿菌中高效表達(dá)？表達(dá)的融合蛋白能否用相變循環(huán)進(jìn)行分離純化？純化的融合蛋白能否與雞卵黃抗體結(jié)合及其最佳條件是什么？技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種雞卵黃抗體純化方法。本發(fā)明的雞卵黃抗體方法用elp-c2融合蛋白進(jìn)行，經(jīng)與冷乙醇和硫酸銨沉淀法比較證明具有簡單、快速、經(jīng)濟(jì)和純化效率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所述的雞卵黃抗體純化方法，是用類彈性蛋白多肽(elp)與鏈球菌g蛋白(spg)c2結(jié)構(gòu)域融合蛋白與粗制卵黃抗體結(jié)合，用相變循環(huán)沉淀結(jié)合復(fù)合物；然后洗脫卵黃抗體，用相變循環(huán)去除elp-c2融合蛋白。其中，所述類彈性蛋白多肽與鏈球菌g蛋白c2結(jié)構(gòu)域融合蛋白可通過下列方法制備：(1)將spgc2結(jié)構(gòu)域編碼序列優(yōu)化成大腸桿菌密碼子序列，將合成序列插入elp融合表達(dá)載體，獲得重組載體pelp-c2；(2)將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用優(yōu)化條件誘導(dǎo)elp-c2融合蛋白表達(dá)；(3)利用溫度敏感的可逆相變循環(huán)純化elp-c2融合蛋白。其中，步驟(1)中spgc2結(jié)構(gòu)域編碼序列為大腸桿菌密碼子優(yōu)化序列如seqidno.1所示。進(jìn)一步地，在優(yōu)化的elp-c2濃度為125μg/ml、結(jié)合溫度為16℃、時(shí)間為60min條件下，將elp-c2融合蛋白與粗制卵黃抗體結(jié)合，用相變循環(huán)沉淀結(jié)合復(fù)合物；所述的洗脫卵黃抗體的優(yōu)化條件是ph9.5、28℃、5min，用相變循環(huán)去除elp-c2融合蛋白，獲得的雞卵黃抗體純度達(dá)96.3％，回收率達(dá)64％。與現(xiàn)有的卵黃抗體純化方法相比，本發(fā)明的雞卵黃抗體純化方法具有簡單、快速、經(jīng)濟(jì)和純化效率高等優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1.elp-c2融合表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。spg為鏈球菌g蛋白，c為免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，d為重復(fù)區(qū)，pt7為t7啟動(dòng)子，elp為類彈性蛋白多肽編碼序列。圖2.elp-c2融合蛋白的純化及電泳分析。1為重組菌裂解液，2為第一輪相變循環(huán)沉淀的融合蛋白，3為第二輪相變循環(huán)純化的融合蛋白。圖3.elp-c2融合蛋白與家禽igy結(jié)合的免疫轉(zhuǎn)印檢測。圖4.elp-c2融合蛋白純化雞卵黃抗體的電泳分析。1為粗制卵黃抗體，2為elp-c2融合蛋白與卵黃抗體形成的復(fù)合物，3為洗脫和去除融合蛋白后的卵黃抗體。圖5.冷乙醇和硫酸銨沉淀法純化雞卵黃抗體的電泳分析。1為粗制卵黃抗體，2為冷乙醇沉淀法純化的卵黃抗體，3為硫酸銨沉淀法純化的卵黃抗體。具體實(shí)施方式生物材料：1.pet-elp載體：本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(文獻(xiàn)：wen-junliu,qianwu,bixu,xin-yuzhang,xiao-lixia,huai-changsun.single-steppurificationofrecombinantproteinsusingelastin-likepeptide-mediatedinversetransitioncyclingandself-processingmodulefromneisseriameningitidesfrpc.proteinexpressionandpurification,2014,98:18-24)。2.dh5α大腸桿菌：從美國bdbiosciencesclontech公司引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。3.blr(de3)大腸桿菌：從美國novagen公司引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。4.puc57載體：由金斯瑞生物科技(南京)有限公司保存和提供。具體實(shí)施步驟如下：1.表達(dá)載體構(gòu)建(1)從genbank下載鏈球菌g蛋白c2結(jié)構(gòu)域編碼序列(x06173.1)，用javacodonadaptiontool(文獻(xiàn)：grotea,hillerk,scheerm,münchrb,hempeldc,jahnd.jcat:anoveltooltoadaptcodonusageofatargetgenetoitspotentialexpressionhost.nucleicacidsresearch,2005，1:33)優(yōu)化為大腸桿菌(k12株)密碼子序列(seqidno.1)。序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，插入puc57載體；5-acctacaaactggttatcaacggtaaaaccctgaaaggtgaaaccaccaccgaagctgttgacgctgctaccgctgaaaaagttttcaaacagtacgctaacgacaacggtgttgacggtgaatggacctacgacgacgctaccaaaaccttcaccgttaccgaataa-3(seqidno.1)。(2)用限制酶sali和noti將c2結(jié)構(gòu)域編碼序列從puc57載體上切下，插入pet-elp載體，獲得重組載體pelp-c2(圖1)。2.融合蛋白表達(dá)(1)將pelp-c2載體轉(zhuǎn)化blr(de3)大腸桿菌，在卡那霉素(50μg/ml)lb培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜；(2)按1：100體積比接種卡那霉素2×yt培養(yǎng)液(tryptone16g，yeastextract10g，nacl5g，ph7.2)，37℃搖床培養(yǎng)至od600＝0.8，加入0.2mmiptg，37℃誘導(dǎo)6h；(3)4℃、12000g離心5min，沉淀菌體用tn緩沖液(50mmtris-hcl,150mmnacl,1mmedta，ph7.4)懸浮，超聲波裂解(30w，10s，間隔15s，共5min)；(4)4℃、12000g離心10min，收集上清液，沉淀用同體積pbs懸浮。sds-page分析結(jié)果顯示：與未誘導(dǎo)組相比，iptg誘導(dǎo)組出現(xiàn)約55kda額外蛋白條帶，約90％表達(dá)產(chǎn)物存在于離心上清中(可溶性蛋白)，但表達(dá)水平較低；(5)將pelp-c2重組菌在不同溫度(24、26、28、30℃)用不同濃度iptg(0.1、0.15、0.2、0.5、1.0mm)誘導(dǎo)不同時(shí)間(6、12、18、24、30h)，sds-page分析結(jié)果顯示：elp-c2融合蛋白的最佳表達(dá)條件為0.1mmiptg、26℃、30h。3.融合蛋白純化(1)將200mlpelp-c2重組菌在26℃、0.1mmiptg誘導(dǎo)30h，離心沉淀菌體，超聲波裂解，菌體裂解液用tn緩沖液稀釋至5mg/ml蛋白；(2)加等量4m氯化鈉，分別在20、25、28、32℃孵育10min，室溫、14000g離心5min，沉淀用適量pbs溶解；(3)蛋白樣品用12％sds-page分離，考馬斯藍(lán)染色后，用moleculargeldoctmxr+system(bio-rad,usa)進(jìn)行蛋白條帶灰度掃描，用imagelabtmsoftware(bio-rad,usa)計(jì)算蛋白純度，結(jié)果顯示：沉淀elp-c2融合蛋白最佳溫度為32℃；(3)分別加不同濃度(1.5、2.0、2.5、3.0m)氯化鈉，32℃孵育10min，室溫、14000g離心5min，沉淀用適量pbs溶解，定量sds-page分析結(jié)果顯示：沉淀elp-c2融合蛋白最佳氯化鈉濃度為3.0m；(4)用優(yōu)化條件(32℃、3m氯化鈉)純化elp-c2融合蛋白，用0.5％tritonx-100pbs離心洗滌1次，定量sds-page分析結(jié)果顯示：純化elp-c2融合蛋白的純度達(dá)99％，回收率達(dá)91.3％(圖2)。4.融合蛋白igg結(jié)合鑒定(1)將純化elp-c2融合蛋白及elp對照進(jìn)行12％sds-page分離，用常規(guī)方法轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，在5％脫脂乳粉pbst(含0.1％tween20pbs)中37℃封閉1h；(2)加1：1000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記兔、羊、人、牛、豬igg和雞、鴨和鵝igy(上海生工生物工程有限公司或自行標(biāo)記)，37℃孵育1h，pbst洗滌3次；(3)按照化學(xué)發(fā)光試劑(thermofisherscientific,usa)說明書進(jìn)行染色，用fluorcheme化學(xué)發(fā)光凝膠成像與分析系統(tǒng)(proteinsimple,usa)進(jìn)行雜交信號掃描。結(jié)果顯示：elp-c2融合蛋白能與牛、豬、鼠、羊、兔、人igg以及雞igy結(jié)合，不能與鴨和鵝igy結(jié)合(圖3)。5.卵黃抗體純化(1)從新城疫弱毒疫苗免疫雞蛋(江蘇廣大禽業(yè)有限公司)吸取卵黃液5ml，用45ml去離子水稀釋，用鹽酸調(diào)節(jié)ph5.0，室溫10000g離心20min，收集上清即粗制卵黃液；(2)將500μl粗制卵黃液與等量純化elp-c2融合蛋白(100μg/ml,ph7.0)混合，分別在不同溫度(4、16、22、28、32、37℃)孵育60min，用上述相變循環(huán)沉淀蛋白復(fù)合物，pbs離心洗滌1次，sds-page分析結(jié)果顯示：elp-c2結(jié)合雞卵黃抗體的最佳溫度為16℃；(3)將不同濃度(25、50、75、100、125、150μg/ml)elp-c2融合蛋白與定量(500μl)粗制卵黃液混合，分別在16℃孵育60min，用上述相變循環(huán)沉淀蛋白復(fù)合物，pbs離心洗滌1次，sds-page分析結(jié)果顯示：結(jié)合雞卵黃抗體的最佳elp-c2濃度為125μg/ml；(4)將elp-c2融合蛋白(125μg/ml)與等量(500μl)粗制卵黃液混合，16℃孵育60min，用相變循環(huán)沉淀蛋白復(fù)合物，pbs離心洗滌1次，分別用200μl不同ph(2.5、3.0、3.5、4.0、8.0、8.5、9.0、9.5)0.1m甘氨酸室溫洗脫10min，立即用5m氫氧化鈉或2m鹽酸中和至ph7.0，用上述相變循環(huán)去除elp-c2融合蛋白，sds-page分析結(jié)果顯示：從elp-c2融合蛋白洗脫卵黃抗體的最佳ph為9.5；(5)用ph9.5甘氨酸在不同溫度(4、16、22、28、32、37℃)洗脫卵黃抗體，立即中和至ph7.0，用上述相變循環(huán)去除elp-c2，sds-page分析結(jié)果顯示：從elp-c2融合蛋白洗脫卵黃抗體的最佳溫度為28℃；(6)用ph9.5甘氨酸在28℃洗脫卵黃抗體不同時(shí)間(5、15、30、45、60min)，立即中和至ph7.0，用上述相變循環(huán)去除elp-c2融合蛋白，sds-page分析結(jié)果顯示：從elp-c2融合蛋白洗脫卵黃抗體的最佳時(shí)間為5min；(7)在上述(2)-(6)的優(yōu)化條件下，用elp-c2融合蛋白從5ml粗制卵黃液純化卵黃抗體，在用相變循環(huán)沉淀獲得蛋白-抗體復(fù)合物后，保留上清液用于第二輪和第三輪卵黃抗體純化，將三輪相變循環(huán)純化的卵黃抗體合并。同時(shí)用硫酸銨沉淀法(文獻(xiàn)：koky，ahndu.preparationofimmunoglobulinyfromeggyolkusingammoniumsulfateprecipitationandionexchangechromatography.poult.sci.2007,86:400-407)和冰乙醇沉淀法(文獻(xiàn)：horikoshit,hiraokaj,saitom,hamadas.iggantibodyfromheneggyolks:purificationbyethanolfractionation.j.foodsci.1993,58:739-742)從5ml粗制卵黃液純化卵黃抗體，用定量sds-page檢測三種方法純化的卵黃抗體的純度和回收率，結(jié)果顯示：elp-c2融合蛋白純化的卵黃抗體的純度為96.3％，回收率為64％(圖4)；硫酸銨沉淀法純化的卵黃抗體的純度為77.9％，回收率為38.8％(圖5)；冰乙醇沉淀法純化的卵黃抗體的純度為76.3％，回收率為55.9％(圖5)。三種雞卵黃抗體純化方法的結(jié)果比較見表1：表1三種方法純化雞卵黃抗體的比較(n＝3)方法卵黃液(ml)純度(％)回收率(％)產(chǎn)量(mg)時(shí)間(h)硫酸銨沉淀577.9±0.3238.8％±1.6520.5±1.8030.3±0.26冰乙醇沉淀576.3±0.5555.9％±0.7632.7±1.754.3±0.25elp-c2融合蛋白596.3±0.7264.0％±1.7338.5±1.802.8±0.26.純化卵黃抗體的活性檢測檢測純化卵黃抗體反應(yīng)原性的elisa按發(fā)表方法(文獻(xiàn)：makkayam,krellpj,nagye.antibodydetection-baseddifferentialelisaforndv-infectedorvaccinatedchickensversusndvhn-subunitvaccinatedchickens.vetmicrobiol.1999，66:209-222)進(jìn)行。用碳酸鹽緩沖液(ph9.6)將雞新城疫病毒(ndv)lasota株接種雞胚尿囊液(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院)稀釋至10μg/ml蛋白，包被elisa板，100μl/孔，37℃孵育1h，用含5％bsa的pbst在37℃封閉1h；加不同濃度純化的雞igy，37℃孵育1h；洗滌后加1：5000辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗雞igy(上海生工生物工程有限公司)，37℃孵育1h；加入四甲基聯(lián)苯胺底物后，用elx808tmelisareader(bio-tek,usa)讀取od450值；以od450值為縱坐標(biāo)，以稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，描繪卵黃抗體反應(yīng)曲線。結(jié)果顯示：用三種方法從ndv免疫雞卵黃純化卵黃抗體均能與ndv反應(yīng)，而且反應(yīng)具有濃度依賴性，但elp-c2融合蛋白純化的卵黃抗體反應(yīng)原性優(yōu)于其他兩種方法純化的卵黃抗體。sequencelisting<110>揚(yáng)州大學(xué)<120>一種雞卵黃抗體的純化方法<130><160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>168<212>dna<213>人工序列<400>1acctacaaactggttatcaacggtaaaaccctgaaaggtgaaaccaccaccgaagctgtt60gacgctgctaccgctgaaaaagttttcaaacagtacgctaacgacaacggtgttgacggt120gaatggacctacgacgacgctaccaaaaccttcaccgttaccgaataa168當(dāng)前第1頁12