用于抗體純化的載體、其制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于抗體純化的載體及其制備方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及以用于抗體純 化的載體填充的親和色譜柱，以及用于使用該柱純化抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，對基于抗體的具有有限副作用的抗體藥物的需求逐年增加。使用其上固 定有蛋白A(Protein A)的載體的親和色譜法被廣泛用作用于純化抗體的方法。此處所用 的蛋白A是指源自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的蛋白A(在A.Forsgren和 J. Sjoquist, J. Immunol. (1966)97, 822-827中被描述）或能表現(xiàn)出與抗體結(jié)合的功能的構(gòu) 成該蛋白的結(jié)構(gòu)域序列的一部分。
[0003] 用于利用親和色譜法純化抗體的典型方法如下，所述親和色譜法使用其上固定有 蛋白A的載體。即，該方法包括（1)使含有抗體的原材料粗溶液經(jīng)過以其上固定有蛋白A 的載體填充的柱，以使期望的抗體吸附至載體，（2)用中性緩沖溶液洗滌抗體吸附至其的載 體，以去除雜質(zhì)，以及然后（3)使用酸性緩沖溶液（具體地，pH 2. 5至3. 0)洗脫吸附至載 體的抗體。
[0004] 本發(fā)明人開發(fā)了一種技術(shù)作為用于通過提高每載體與抗體結(jié)合的容量 (capacity)有效純化抗體的手段，包括通過控制定向（orientation)將源自蛋白A的蛋白 作為與抗體的Fc結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合同時控制定向的蛋白引入不溶性載體（參見專利文獻(xiàn) 1 至 16)〇
[0005] 當(dāng)以更一般化的形式表述時，本發(fā)明人開發(fā)的定向控制的 (orientation-controlled)固定方法如下。
[0006] 該方法是一種定向控制的固定方法，包括使用由通過通式： Rl-R2-R3-R4-R5-R6(其中所述序列表示從氨基末端側(cè)到羧基末端側(cè)的序列；R1部分的序 列可不存在，且如果存在，是包含除賴氨酸和半胱氨酸殘基之外的氨基酸殘基的序列；R2 部分的序列是待被固定的源自蛋白A的蛋白的序列，及被改造為不包含賴氨酸或半胱氨酸 殘基的序列，從而它可保持與抗體結(jié)合的特性；R3部分的序列可不存在，且如果存在，是包 含除賴氨酸和半胱氨酸殘基之外的氨基酸殘基的間隔序列（spacer sequence) ;R4部分的 序列是包含由半胱氨酸_X(其中X表示賴氨酸或除半胱氨酸之外的氨基酸殘基）表示的 2個氨基酸殘基的序列；R5部分的序列可不存在，且如果存在，是不包含賴氨酸或半胱氨酸 殘基的序列，以及包含能夠使得由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成 的整個蛋白的等電點在酸性側(cè)的酸性氨基酸殘基的序列；且R6部分的序列是用于純化蛋 白的親和標(biāo)簽序列）表示的氨基酸序列組成的蛋白以氰化（cyanate)在R4部分唯一存在 的半胱氨酸殘基的SH基團(tuán)，以及使半胱氨酸氰化的（cyanocysteinated)蛋白與引入氨基 作為官能團(tuán)的不溶性載體反應(yīng)，以通過在其羧基端和載體的氨基端之間酰胺鍵合來固定由 R1-R2-R3表示的部分。
[0007] 此外，迄今為止，在使用由本發(fā)明人開發(fā)的通過蛋白A的定向控制固定的載體的 抗體純化中，已經(jīng)應(yīng)用包括以下的純化手段：（1)使含有抗體的原材料粗溶液經(jīng)過以其上 固定有蛋白A的載體填充的柱，以使期望的抗體吸附至載體，（2)用中性緩沖溶液洗滌抗體 吸附至其的載體，以去除雜質(zhì)，以及（3)使用酸性緩沖溶液（具體地，pH 2. 5至3. 0)洗脫 吸附至載體的抗體，提供用于通過提高的每載體與抗體結(jié)合的容量有效純化抗體的手段。
[0008] 然而，包括使用具有2. 5至3. 0的pH的酸性緩沖溶液洗脫抗體的上述方法具有嚴(yán) 重的缺陷。具體地，存在以下問題：抗體與強(qiáng)酸（例如，pH 3.0或更?。┚彌_溶液的接觸 導(dǎo)致抗體的酸修飾并改變抗體的高級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致誘導(dǎo)聚集以及作為藥物的抗體的活性的損 失。為了解決該問題，試圖開發(fā)更穩(wěn)定的抗體分子；然而，明顯的是，這樣的解決方案不可能 是針對伴隨通過使用其上固定有蛋白A的載體的親和色譜法純化的問題的常規(guī)解決方案， 且對能夠廣泛應(yīng)用于許多抗體分子的制備的方法的開發(fā)存在需求。
[0009] 引用列表
[0010] 專利文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)1 :日本專利公開（Kokai)號2011-132140 A
[0012] 專利文獻(xiàn)2 :日本專利公開（Kokai)號2011-132145 A
[0013] 專利文獻(xiàn)3 :日本專利公開（Kokai)號2011-132141 A
[0014] 專利文獻(xiàn)4 :日本專利號2990271
[0015] 專利文獻(xiàn)5 :日本專利號3047020
[0016] 專利文獻(xiàn)6 :日本專利號3740529
[0017] 專利文獻(xiàn)7 :日本專利公開（Kokai)號2005-112827 A
[0018] 專利文獻(xiàn)8 :日本專利號4528951
[0019] 專利文獻(xiàn)9 :日本專利公開（Kokai)號2008-115151 A
[0020] 專利文獻(xiàn)10 :日本專利公開（Kokai)號2008-115152 A
[0021] 專利文獻(xiàn)11 :日本專利公開（Kokai)號2008-115153 A
[0022] 專利文獻(xiàn)12 :日本專利公開（Kokai)號2008-266219 A
[0023] 專利文獻(xiàn)13 :日本專利公開（Kokai)號2008-266221 A
[0024] 專利文獻(xiàn)14 :日本專利公開（Kokai)號2009-156767 A
[0025] 專利文獻(xiàn)15 :日本專利公開（Kokai)號2010-127856 A
[0026] 專利文獻(xiàn)16 :日本專利號40006523
[0027] 發(fā)明概述
[0028] 技術(shù)問題
[0029] 為了提供針對上述伴隨通過使用其上固定有包含蛋白A的蛋白的載體的親和色 譜法的純化的問題的常規(guī)解決方案，本發(fā)明提供了其上固定有蛋白A的載體及其制備方 法，所述蛋白A具有允許抗體在其中許多抗體不經(jīng)受酸修飾的溫和pH條件（具體地，pH 4.0至5. 5)下解吸的特定氨基酸序列。另外，本發(fā)明提供了用于抗體純化的親和色譜柱及 使用該柱純化抗體的方法，所述親和色譜柱以其上固定有包含蛋白A的蛋白的載體填充。
[0030] 問題的解決方案
[0031] 本發(fā)明人已進(jìn)行了關(guān)于解決上述在蛋白A的固定中待消除的問題的深入研宄。
[0032] 本發(fā)明人已經(jīng)獲得一個想法，如果蛋白A突變體可被開發(fā)作為在包含由通式： R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列的序列部分中負(fù)責(zé)與抗體結(jié)合的R2部分中使用的 蛋白A，可解決上述問題，所述由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列用于蛋白的 定向控制的固定，蛋白A突變體具有以下特性：在抗體純化期間，在使含有抗體的原材料粗 溶液經(jīng)過以蛋白A固定的載體填充的柱并使期望的抗體吸附至載體、隨后洗脫的步驟中， 其在洗脫吸附至載體的抗體中通過使用酸性緩沖溶液允許抗體在作為溫和pH條件的pH 4. 0至5. 5的范圍內(nèi)解吸，而不影響用中性緩沖溶液洗滌抗體吸附至其的載體以去除雜質(zhì) 的操作。
[0033] 在完成本發(fā)明之前的時間點，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)蛋白A表現(xiàn)出與抗體強(qiáng)烈的結(jié)合反 應(yīng)，該蛋白A通過用精氨酸或甘氨酸取代源自蛋白A的A-結(jié)構(gòu)域的序列中所有賴氨酸殘基 被改造為在R2部分不包含賴氨酸或半胱氨酸，所述源自蛋白A的A結(jié)構(gòu)域的序列通過SEQ ID NO: 1 表示（日本專利公開（Kokai)號 2011-132140 A、2011-132145 A、和 2011-132141 A)。因此，制備了由被改造為上述通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6的序列組成的蛋白，其包含蛋 白A的氨基酸序列（該蛋白被稱作AD-l.SEQ ID N0:2)，并基于該序列進(jìn)行另外詳盡的單個 氨基酸取代，以制備AD-1的約800個突變體。如果能夠遵循如由本發(fā)明人開發(fā)的用于改良 蛋白的方法（日本專利No. 4534030、日本國內(nèi)再公開號01/000797、M. 1界&1〇^&等181〇1. Chem. 281，13234-13246 (2006)、和日本專利公開（Kokai)號 2005-058059 A)來確定在酸性 條件下所有約800個突變體的抗體洗脫特性，則認(rèn)為能夠得到作為本發(fā)明目的的突變體。
[0034] 源自蛋白A的A-結(jié)構(gòu)域的序列（SEQ ID NO: 1):
[0035] Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln
[0036] Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
[0037] Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
[0038] Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pr〇-Ser-Gln
[0039] Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Lys-Lys
[0040] Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pr〇-Lys
[0041] AD-1的序列（通過基于蛋白A的A-結(jié)構(gòu)域序列改造為R1-R2-R3-R4-R5-R6形式 制備的序列）（SEQ ID NO:2):
[0042] Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
[0043] Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
[0044] Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
[0045] Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pr〇-Ser-Gln
[0046] Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
[0047] Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pr〇-Gly-Gly-Gly
[0048] Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
[0049] His-His-His-His-His-His
[0050] 此處，在通式為R1-R2-R3-R4-R5-R6中，在SEQ ID N0:2中顯示的序列（AD-1)的 尺1、1?2、1?3、1?4、1?5和1?6為以下序列。
[0051] R1 (源自用于在大腸桿菌（Escherichia coli)中表達(dá)的起始密碼子的甲硫氨酸， 通常由于在表達(dá)后幾乎都被移除而不存在）：
[0052] Met
[0053] R2 (其中蛋白A的A-結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被修飾為不包含半胱氨酸和賴氨酸的序 列）（SEQ ID N0:3):
[0054] Ala-Asp-Asn-Asn-Phe-Asn-Arg-Glu-Gln-Gln
[0055] Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro
[0056] Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Gly-Phe
[0057] Ile-Gln-Ser-Leu-Arg-Asp-Asp-Pr〇-Ser-Gln
[0058] Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ser-Glu-Ala-Arg-Arg
[0059] Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Pr〇-Gly
[0060] R3 (不包含半胱氨酸和賴氨酸的接頭序列）：
[0061] Gly-Gly-Gly-Gly
[0062] R4(用于通過氰化半胱氨酸引起固定化反應(yīng)的序列）：
[0063] Cys-Ala
[0064] R5(用于使得等電點為負(fù)值的序列）：
[0065] Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
[0066] R6 (用于純化的標(biāo)簽序列）
[0067] His-His-His-His-His-His
[0068] 本發(fā)明人詳盡地制備了突變體蛋白，其中基于名為AD-1的氨基酸序列，組成R2的 所有氨基酸殘基經(jīng)受單個氨基酸取代。
[0069] 然而，鑒于以前的發(fā)現(xiàn)結(jié)果，從多達(dá)800個單個氨基酸取代突變體中有效選擇作 為本發(fā)明目的的突變體蛋白是困難的，所述突變體蛋白具有允許抗體在其中許多抗體不經(jīng) 受酸修飾的溫和pH條件（pH 4.0至5. 5)下解