的圖產生的曲線可被分析以評價突變體蛋白 的特性。信號強度的時間進程可以被確定以定量分析其中抗體吸附和解離的狀態(tài)。將洗脫 期間信號強度的變化擬合為衰減曲線以確定直到一半量的結合的抗體解離時的經過的時 間（T a5)，以計算其與上述鄰近該陣列的AD-1中蛋白A的A-結構域的Ta5的比，以確定標 準的T a5，以評價該值作為酸洗脫特性的指示或易被酸洗脫的指示。較低的Ta5可被確定作 為指示更好的酸洗脫特性，即，在pH 4. 0至5. 5的弱酸性條件下與在中性條件下結合的抗 體更好的解離特性。除Ta5之外，抗體的解離常數(shù)（Kd)也可被用作一個指示。
[0199]解離常數(shù)可通過例如使用Biacore (Biacore Co.，Ltd.)作為表面等離子共振生物 傳感器、通過進行蛋白A突變體和抗體之間的結合表征來測定。在這種情況下，其中蛋白A 突變體的氨基酸序列被包含在由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成的 固定的蛋白中作為R2部分的蛋白可被使用以使R1-R2-R3部分與載體結合以使用蛋白固 定的載體。觀察到的表面等離子共振傳感器表面質量隨時間的變化可使用RU(由Biacore 定義的單位）測定，以確定結合速率常數(shù)（kass)、解離速率常數(shù)（kdis)和解離常數(shù)（Kd = kass/kdis)。具有較小解離常數(shù)的蛋白A突變體可被確定為能夠在中性條件下與抗體更強 烈結合的突變體。
[0200] 通過上述方法確定的Ta5和解離常數(shù)被繪制在如圖1所示的坐標平面上，并且T a5 和解離常數(shù)在恒定值范圍的，即，被繪制在坐標中的特定范圍的蛋白A的A-結構域的突變 體可被選出作為在以下方面出色的突變體：在中性條件下與抗體強烈結合并在pH 4. 0至 5. 5的弱酸性條件下與在中性條件下結合的抗體解離的特性。
[0201] 例如，對其上固定有使用由上述SEQ ID NO: 2表示的AD-1制備的蛋白A的A-結 構域的載體進行相同分析，且其中Ta5小于通過使用AD-1中蛋白A的A-結構域測定獲得 的T a5，且解離常數(shù)小于通過使用AD-1中蛋白A的A-結構域測定獲得的解離常數(shù)的蛋白A 可被選出作為根據(jù)本發(fā)明的在以下方面出色的突變體：在中性條件下與抗體強烈結合并在 pH 4.0至5. 5的弱酸性條件下與在中性條件下結合的抗體解離的特性。根據(jù)本發(fā)明的在 以下方面出色的突變體：在中性條件下與抗體強烈結合并在pH 4. 0至5. 5的弱酸性條件下 與在中性條件下結合的抗體解離的特性，具有（當使用以上陣列測定時）1. 00或更小、優(yōu)選 〇. 80或更小、更優(yōu)選0. 60或更小、尤其優(yōu)選0. 55或更小的Ta5，和（使用上述Biacore測 定的）6X 1(T9或更小、優(yōu)選8X 1(T9或更小、更優(yōu)選KT1(I或更小的解離常數(shù)。
[0202] 根據(jù)本發(fā)明的其上固定有由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列 組成的蛋白的固定化載體可被使用以提供其中由R1-R2-R3表示的部分被固定的固定的 蛋白。其上固定有由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成的蛋白的固定 化載體，可通過將由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成的蛋白吸附至 固定化載體上制備。將蛋白吸附至固定化載體可通過如以上描述的在中性至弱堿性條件 下（pH 7至10)使蛋白與固定化載體反應來進行。如上所述，在其上固定有由通過通式： R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成的蛋白的固定化載體中，蛋白的R3部分中包含 的半胱氨酸殘基可被氰化，以產生其上固定有由通過通式：R1-R2-R3表示的氨基酸序列組 成的蛋白的固定化載體。本發(fā)明還包括其上固定有由通過通式：R1-R2-R3表示的氨基酸序 列組成的蛋白的固定化載體。
[0203] 抗體可通過使用其上固定有由通過R1-R2-R3表示的氨基酸序列組成的蛋白的固 定化載體的親和色譜法被純化。用于親和色譜法的親和色譜柱可通過以其上固定有由通過 R1-R2-R3表示的氨基酸序列組成的蛋白的固定化載體填充柱來制備。柱可通過公知的方法 用載體填充。本發(fā)明還包括用于抗體純化的包含其上固定有由通過R1-R2-R3表示的氨基 酸序列組成的蛋白的固定化載體的親和色譜柱。
[0204] 使用本發(fā)明的親和色譜柱的抗體純化可通過公知的親和色譜法進行；其特征在于 在溫和pH條件下，與蛋白A突變體結合的抗體可從抗體被洗脫。在抗體純化中，含有待純化 的抗體的溶液（原材料粗溶液）首先經過以其上固定有由通過R1-R2-R3表示的氨基酸序 列組成的蛋白的固定化載體填充的親和色譜柱，以使抗體吸附至載體上的蛋白A突變體。 在這種情況下，原材料粗溶液預先被調整為pH 6. 0至8. 5。用于pH調整的緩沖溶液不限； 然而，例如，磷酸鈉、磷酸鉀、HEPES (2-[4_ (2-羥乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸）或MES (2-嗎啉 乙磺酸）可被使用。親和色譜柱優(yōu)選預先使用pH 6.0至8. 5的上述緩沖溶液平衡。之后， 將抗體吸附至其的載體用中性緩沖溶液諸如磷酸鈉緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液洗滌以 去除雜質。其后，結合的抗體可使用pH 4. 0至5. 5的緩沖溶液洗脫用于回收。pH 4. 0至 5. 5的緩沖溶液可以是乙酸鈉緩沖溶液、檸檬酸鈉緩沖溶液、磷酸鈉緩沖溶液、MES(2-嗎啉 乙磺酸）等。使用的緩沖溶液的濃度不限；然而，可使用10至50mM濃度的溶液。取決于用 作樣品的含有抗體的原材料粗溶液的體積，柱的尺寸可以為，例如，2. 5至30cm的長度。
[0205] 實施例
[0206] 以下將參照實施例對本發(fā)明進行描述。然而，本發(fā)明不限于這些實施例。
[0207] 在以下實施例中，通常使用以下實驗方法。
[0208] (實施例1)
[0209] 基因合成
[0210] 實施例中描述的基因由合成基因的合約制造商合成。dsDNA基于以下顯示的核苷 酸序列（SEQ ID NO:8)被合成，并被插入pUC18載體的BamHI-EcoRI位點；得到的克隆的序 列通過單鏈分析被證實，并進行核苷酸序列的信息的交叉核對；通過諸如定點誘變的方法 對鑒定為錯配的位點進行突變校正；并且交付產生的獲得的質粒DNA (約1 y g)。交付的質 粒的期望部分通過測序再次證實其序列。
[0211] SEQ ID NO:8的核苷酸序列
[0212] GGATCCTTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAA AGGAGGAACGACTATGGCGGATAACAACTTTAACCGCGAACAGCAGAACGCGTTTTATGAAATTCTGAACATGCC GAACCTGAACGAAGAACAGCGCAACGGCTTTATTCAGAGCCTGCGCGATGATCCGAGCCAGAGCGCGAATCTGCT GAGCGAAGCGCGTCGTCTGAATGAAAGCCAGGCGCCGGGCTGTGCGGATGACGACGACGATGATCACCACCATCA CCATCATTAAGAATTC
[0213] 單個氨基酸取代突變體的制備
[0214] 使用各自具有24個核苷酸的原始序列的DNA引物及其互補DNA引物，通過將編碼 待取代的位點的氨基酸的DNA序列轉化為期望的密碼子序列并遵照QuickChang方法（在 來自 Stratagene Co.，Ltd?的 QuickChang Site-directed Mutagenesis 試劑盒中描述的 方法），進行基于AD-1 (其氨基酸序列在SEQ ID N0:2中顯示）的蛋白A的A-結構域中的 氨基酸取代。
[0215] 蛋白純化
[0216] 將以重組質粒轉化的大腸桿菌菌株JM109在35°C下2L培養(yǎng)基（含有20g氯化鈉、 20g酵母提取物、32g胰蛋白酶和100mg氨芐青霉素鈉）中過夜培養(yǎng)。其后，使培養(yǎng)物溶液經 受20分鐘的低速離心（以5, OOOrpm)，以提供3至5g按濕重計的細菌細胞。將這些細菌細 胞懸浮在20mL 10mM磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0)中，并且使用弗氏按壓裝置（French press apparatus)將細胞壓碎，隨后高速離心（以20, OOOrpm) 20分鐘，以分離上清液。向所得 上清液加入硫酸鏈霉素至終濃度為2 %，并攪拌20分鐘，然后使其經受20分鐘的高速離心 (20, OOOrpm)，以分離上清液。之后，將所得物用硫酸銨處理；將上清液應用于鎳螯合柱（購 自GE Healthcare Bioscience Corporation);將柱以20ml或更多的用于洗絳的緩沖溶液 (5mM咪唑、20mM磷酸鈉、0. 5M氯化鈉，pH 7. 4)充分洗滌；并且在洗滌后，應用20ml用于洗 脫的緩沖溶液（〇. 5M咪唑、20mM磷酸鈉、0. 5M氯化鈉，pH 7. 4)以洗脫期望的蛋白。其后，為 了從蛋白溶液去除咪唑，將其對5L的10mM磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0)透析。MWC03500(購 自Spectrum Laboratories Co.，Ltd.)被用作透析膜。透析之后，使用離心真空干燥器干 燥期望的蛋白。
[0217] 人IgG抗體分子的結合表征
[0218] 根據(jù)由 Biacore Co.，Ltd 提供的操作方案，使用 Biacore(Biacore Co.，Ltd.)作 為表面等離子共振生物傳感器，進行期望蛋白的結合表征。
[0219]作為運行緩沖溶液，具有10mM HEPES (pH 7. 4)、150mM氯化鈉、5 y M EDTA和 0. 005%表面活性劑P20的組成（Biacore Co.，Ltd.)并預先脫氣的溶液被使用。
[0220]SensorChip NTA (Biacore Co.，Ltd.)被用作傳感器芯片。使用運行緩沖溶液將 傳感器芯片充分平衡，隨后注入5mM氯化鎳溶液以完成鎳離子配位。之后，將重組蛋白溶液 (在運行緩沖液中具有100 U g/mL的濃度）注入傳感器芯片以固定重組蛋白。
[0221] 對于固定的重組蛋白和人IgG之間的結合反應，相繼注入使用運行緩沖溶液稀 釋/制備為〇? 25至20 y g/ml的7個濃度的人IgG(Sigma-Aldrich，Inc.)溶液，并且隨后 替換為運行緩沖溶液以維持進給，以定量觀察抗體的結合/解離現(xiàn)象。進給流速被設置為 20 y L/min.;觀察結合的時間（抗體溶液注入時間）為4分鐘；并且觀察解離的時間為4分 鐘。各濃度的抗體溶液各自被注入以觀察結合/解離現(xiàn)象，隨后接著注入6M鹽酸胍溶液持 續(xù)3分鐘以解離所有與固定的重組蛋白結合的人IgG，該固定的重組蛋白隨后使用運行緩 沖溶液被再生，并用于后續(xù)測定。
[0222] 使用RU (由Biacore定義的單位）測定表面等離子共振傳感器表面的質量隨時間 的觀察變化，以確定結合速率常數(shù)（kass)、解離速率常數(shù)（kdis)和解離常數(shù)（Kd = kass/ kdis)〇
[0223] 針對洗脫參數(shù)（Ta5)的值繪制解離常數(shù)的結果顯示在圖1中，所述解離常數(shù)指示 通過Biacore測定的AD-1中蛋白A的A-結構域的詳盡的單個氨基酸取代突變體與抗體的 結合強度，所述洗脫參數(shù)（T a5)的值由通過使用陣列分析裝置的測定獲得的pH 5.0下的洗 脫確定。
[0224] 使用陣列分析裝置分析抗體的酸洗脫特性
[0225] 使用陣列分析裝置的測定如下進行。
[0226] 蛋白在陣列基板上的固定
[0227] 將各突變體蛋白溶解于10mM pH 7. 0的磷酸鹽緩沖溶液，通過使用BCA方法測定 其濃度，將其調整為2mg/ml的終濃度。將0. 2 y L的約2mg/ml的各蛋白溶液以1. 2mm的間 隔點樣在陣列基板（二氧化硅整體多孔材料的薄層）上8X12矩陣上的96個點處。在這 一方面，相同的突變體蛋白被點樣在一個陣列上的2個點處，以確保數(shù)據(jù)的重復性的證實。 AD-1蛋白被點樣在每行的2個點處作為用于比較的蛋白，以確保各突變體蛋白的數(shù)據(jù)和 AD-1蛋白的數(shù)據(jù)之間的比較。點樣后，對各蛋白相繼進行還原反應、氰化反應、通過氰化半 胱氨酸的定向控制的固定化反應、用具有高鹽濃度的緩沖溶液的洗滌以及掩蔽剩余氨基基 團的反應，以將蛋白固定至陣列基板上。
[0228] 測定
[0229] 將突變體被點樣固定（spot-immobilized)在其上的陣列基板放入陣列分析裝 置，并與裝置中的溶液進給系統(tǒng)連接；陣列用280nm下的紫外光照射，同時使溶液自動經過 其用于如以下描述的分析；并且用CCD隨時間的推移對透射光拍照以捕獲陣列的圖像進入 PC。初始緩沖溶液（150mM氯化鈉、50mM磷酸鈉