，pH 7.0)、抗體溶液（其中人多克隆抗體用 運行緩沖溶液稀釋至〇. 2mg/ml的溶液）、用于洗滌的緩沖溶液（1M氯化鈉、50mM磷酸鈉，pH 7. 0)、用于洗脫的緩沖溶液（0. 1M檸檬酸鈉，pH 5. 0)和用于再生的緩沖溶液（0. 1M甘氨酸， pH 2. 5)以0. 6ml/min的速度持續(xù)25分鐘依次經(jīng)過其，并以8秒的間隔隨時間的推移對陣 列圖像拍照并捕獲進入PC用于保存。
[0230] 數(shù)據(jù)分析
[0231] 在數(shù)據(jù)分析中，使用隨裝置提供的分析軟件自動檢測陣列圖像中的點以計算點區(qū) 域中像素的平均亮度和點周圍像素的平均亮度，以確定它們之間比的對數(shù)作為該點的信號 強度。該值被證實與該點上蛋白的量是成比例的。各點的信號強度針對從開始通過陣列基 板起所經(jīng)過的時間被制圖。從信號強度針對經(jīng)過的時間的圖產(chǎn)生的曲線可被分析以評價突 變體蛋白的特性。信號強度的時間進程可以被確定以定量分析其中抗體吸附和解離的狀 〇
[0232] 作為分析的結果，發(fā)現(xiàn)當用于洗脫的緩沖溶液經(jīng)過時，抗體的解離速度，S卩，抗體 的酸洗脫特性取決于突變體蛋白的類型變化很大。因此，針對洗脫期間信號強度的變化擬 合衰減曲線以確定直到一半量的吸附的抗體解離時所經(jīng)過的時間（T a5)，以計算其與上述 鄰近該陣列的AD-1中的蛋白A的A-結構域的Ta5的比，以確定標準化的T a5，以使用該值 作為酸洗脫特性的指示或易于被酸洗脫的指示。
[0233] 然后，基于酸洗脫特性和通過在上述"人IgG抗體分子的結合表征"中描述的方法 確定的解離常數(shù)（Kd)兩種指示作為指示，試圖選出突變體蛋白。結果，可選出多個突變體 蛋白，其與AD-1中的蛋白A的A-結構域相比，具有高結合親和力（低Kd值）并且易于經(jīng) 受酸洗脫（具有低^直）。更易于經(jīng)受酸洗脫的突變體蛋白可通過以下發(fā)現(xiàn)：制備其中突 變被組合的各突變體蛋白并針對其制備陣列以測定/分析抗體的酸洗脫特性。
[0234] 顯示在SEQ ID NO:l中的其中第15位的E(谷氨酸）被H(組氨酸）取代（E15H) 的氨基酸序列，具有良好的酸洗脫特性。
[0235] (實施例2)
[0236] 基于實施例1的結果，將其他單個氨基酸取代突變進一步添加至E15H突變。作為 添加的突變，檢查了在位點M19(在SEQ ID NO: 1中顯示的氨基酸序列中第19位的甲硫氨 酸）和G29(在SEQ ID N0:1中顯示的氨基酸序列中第29位的甘氨酸）處的取代突變。這 是因為M19是唯一存在于AD-1的甲硫氨酸殘基并對空氣氧化敏感，并且該位點的氨基酸取 代被預期增加作為化學性質的抗氧化性能。位點G29是如以下位點之一所示的位點：作為 陣列分析的結果，其突變被預期改善在pH 5. 0下的洗脫特性。對于位點M19,選擇M19V (在 第19位用V (纈氨酸）取代甲硫氨酸）作為突變，其中作為在pH 5時易于洗脫的參數(shù)的T。. 5 被改善，以及對于位點G29,選擇G29 A (在第29位用A (丙氨酸）取代甘氨酸）、G29D (在 第29位用D (天冬氨酸）取代甘氨酸）、和G29E (在第29位用E (谷氨酸）取代G)。結果 顯示在表1中。
[0237] [表 1]
【主權項】
1. 一種固定化載體，所述固定化載體不包括具有整體結構的固定化載體，蛋白通過靜 電相互作用吸附在所述固定化載體上，所述蛋白由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的 氨基酸序列組成，其中由R1-R2-R3表示的部分被用于固定在所述固定化載體上，其中： 所述序列表示從氨基末端側到羧基末端側的序列； R1部分的序列可不存在，且如果存在，是包含除賴氨酸和半胱氨酸殘基之外的氨基酸 殘基的序列； R2部分的序列是作為待被固定的蛋白的蛋白A突變體的序列或其中蛋白A突變體的序 列的1至3個單位被連接在一起的序列，以及是不包含賴氨酸或半胱氨酸殘基的序列，所述 蛋白A突變體具有在中性條件下與抗體強烈結合并在pH4. 0至5. 5的弱酸性條件下與在 中性條件下結合的所述抗體解離的特性； R3部分的序列可不存在，且如果存在，是包含除賴氨酸和半胱氨酸殘基之外的氨基酸 殘基的間隔序列； R4部分的序列是包含由半胱氨酸-X表示的2個氨基酸殘基的序列，其中X表示丙氨酸 或除丙氨酸和半胱氨酸之外的氨基酸殘基； R5部分的序列可不存在，且如果存在，是不包含賴氨酸和半胱氨酸殘基的序列，以及是 包含能夠使得由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成的整個蛋白的等電 點在酸性側的酸性氨基酸殘基的序列；且 R6部分的序列是用于蛋白純化的親和標簽序列。
2. 根據(jù)權利要求1所述的固定化載體，其中所述蛋白A突變體是以下蛋白A突變體： 當抗體與固定在陣列基板上的所述蛋白A突變體結合并用pH5. 0的0. 1M的檸檬酸鈉溶液 洗脫時，其直到一半量的結合的所述抗體解離時經(jīng)過的時間（Ta5)和其與所述抗體的解離 常數(shù)，與由SEQIDNO:3表示的蛋白A突變體的Ta5和解離常數(shù)相比是減小的。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的固定化載體，其中所述蛋白A突變體是由其中在源自金 黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)的蛋白A的氨基酸序列中1至3個氨基酸殘基被 取代的氨基酸序列組成的突變體。
4. 根據(jù)權利要求1至3任一項所述的固定化載體，其中所述蛋白A突變體是蛋白A的 A-結構域的突變體。
5. 根據(jù)權利要求1至4任一項所述的固定化載體，其中所述R2部分的序列是由SEQ IDN0:4至7的任何序列組成的蛋白A的A-結構域的突變體蛋白的序列，或其中由SEQID N0:4至7的任何序列組成的蛋白A的A-結構域的突變體蛋白的序列的1至3個單位被連 接在一起的序列。
6. 根據(jù)權利要求1至5任一項所述的固定化載體，用于將存在于由通過通式： R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成的蛋白中唯一的半胱氨酸殘基的巰基基團轉 化為硫氰酸基基團，并使所得物作用于具有伯胺作為官能團的任何固定化載體，用于使 R1-R2-R3部分通過酰胺鍵合與所述載體結合，所述R1-R2-R3部分是所述蛋白的半胱氨酸 殘基的氨基末端側存在的氨基酸序列部分。
7. 根據(jù)權利要求1至6任一項所述的固定化載體，其中由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表 示的氨基酸序列中所述R3部分的序列是由1至10個甘氨酸殘基組成的序列。
8. 根據(jù)權利要求1至7任一項所述的固定化載體，其中由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表 示的氨基酸序列中所述R5部分的序列是由天冬氨酸和/或谷氨酸的氨基酸殘基組成的1 至10個氨基酸殘基的序列。
9. 根據(jù)權利要求8所述的固定化載體，其中由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸 序列中所述R5部分的序列是由1至10個天冬氨酸殘基組成的序列。
10. 根據(jù)權利要求1至9任一項所述的固定化載體，其中由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6 表示的氨基酸序列中所述R6部分的序列是由4個或更多個組氨酸殘基組成的序列。
11. 根據(jù)權利要求1至10任一項所述的固定化載體，其中所述載體選自由以下組成的 組：二氧化硅載體、玻璃珠和聚合物。
12. -種用于制備根據(jù)權利要求1至11任一項所述的固定化載體的方法，包括通過 靜電相互作用將由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成的蛋白吸附至載 體。
13. -種固定化載體，其上固定有蛋白A突變體，所述固定化載體通過以下制備：將根 據(jù)權利要求1至11任一項的由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成的蛋 白中存在的唯一半胱氨酸殘基的巰基基團轉化為硫氰酸基基團，并使所得物作用于具有伯 胺作為官能團的任何固定化載體，用于使R1-R2-R3部分作為所述蛋白的半胱氨酸殘基的 氨基末端側存在的氨基酸序列部分通過酰胺鍵合與所述載體結合。
14. 一種用于制備根據(jù)權利要求12所述的固定化載體的方法，包括將根據(jù)權利要求1 至11任一項的由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成的蛋白中存在的唯 一半胱氨酸殘基的巰基基團轉化為硫氰酸基基團，并使所得物作用于具有伯胺作為官能團 的任何固定化載體，用于使R1-R2-R3部分作為所述蛋白的半胱氨酸殘基的氨基末端側存 在的氨基酸序列部分通過酰胺鍵合與所述載體結合。
15. -種用于抗體純化的親和色譜柱，所述親和色譜柱以根據(jù)權利要求13所述的固定 化載體填充。
16. -種用于純化抗體的方法，包括將包含抗體的溶液應用至根據(jù)權利要求15所述的 用于抗體純化的親和色譜柱，以使所述抗體與所述蛋白A突變體結合，并且然后使用洗脫 緩沖溶液解離并洗脫所述抗體。
17. -種用于設計由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成的蛋白的 方法，所述蛋白用于將由通過R1-R2-R3表示的氨基酸序列組成的蛋白固定至固定化載體 上，所述方法包括選擇Rl、R2、R3、R4、R5和R6部分的氨基酸序列以符合以下條件： (a) 允許所述R1部分的序列不存在，或如果允許其存在，選擇包括除賴氨酸和半胱氨 酸殘基之外的氨基酸殘基的序列； (b) 作為所述R2部分的序列，選擇蛋白A突變體的序列或其中蛋白A突變體的序列的 1至3個單位被連接在一起的序列，以及是不包含賴氨酸或半胱氨酸殘基的序列，所述蛋白 A突變體具有在中性條件下與抗體強烈結合并在pH4. 0至5. 5的弱酸性條件下與在中性條 件下結合的所述抗體解離的特性； (c) 允許所述R3部分的序列不存在，或如果允許其存在，選擇包含除賴氨酸和半胱氨 酸殘基之外的氨基酸殘基的間隔序列； (d) 作為所述R4部分的序列，選擇包含由半胱氨酸-X(其中X表示丙氨酸或除半胱氨 酸之外的氨基酸殘基）表示的2個氨基酸殘基的序列； (e) 允許所述R5部分的序列不存在，或如果允許其存在，選擇不包含賴氨酸或半胱氨 酸殘基的序列，其中所述序列包含能夠使得由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基 酸序列組成的整個蛋白的等電點在酸性側的酸性氨基酸殘基；以及 (f) 作為所述R6部分的序列，選擇用于純化蛋白的親和標簽序列。
18. 根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述蛋白A突變體是以下蛋白A突變體：當抗 體與固定在陣列基板上的所述蛋白A突變體結合并用pH5. 0的0. 1M檸檬酸鈉溶液洗脫時， 其直到一半量的結合的所述抗體解離時經(jīng)過的時間（Ta5)以及其與所述抗體的解離常數(shù)， 與由SEQIDNO:3表示的蛋白A突變體的TQ.5和解離常數(shù)相比是減小的。
19. 根據(jù)權利要求17或18所述的方法，其中所述蛋白A突變體是由其中在源自金黃 色葡萄球菌的蛋白A的氨基酸序列中1至3個氨基酸殘基被取代的氨基酸序列組成的突變 體。
20. 根據(jù)權利要求17至19任一項所述的方法，其中所述蛋白A突變體是蛋白A的A-結 構域的突變體。
21. 根據(jù)權利要求17至20任一項所述的方法，其中所述R2部分的序列是由SEQID N0:4至7的任何序列組成的蛋白A的A-結構域的突變體蛋白的序列，或由其中SEQID N0:4至7的任何序列的1至3個單位被連接在一起的序列組成的蛋白A的A-結構域的突 變體蛋白的序列。
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供其上固定有蛋白A的載體及所述載體的制備方法，所述蛋白A具有允許抗體在其中許多抗體不必經(jīng)受酸修飾的溫和pH條件(具體地，pH4.0至5.5)下解吸的特定氨基酸序列；及所述載體的制備方法。一種固定化載體(不包括具有整體結構的固定化載體)，其上通過靜電相互作用吸附有蛋白，所述蛋白由通過通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列組成，其中由R1-R2-R3表示的部分被用于固定至固定化載體上，其中：該序列表示從氨基末端側到羧基末端側的序列；R2部分的序列是作為待被固定的蛋白的蛋白A突變體的序列，或其中蛋白A突變體的序列的1至3個單位被連接在一起的序列，所述蛋白A突變體具有在中性條件下與抗體強烈結合并在pH4.0至5.5的弱酸性條件下與在中性條件下結合的抗體解離的特性。
【IPC分類】C07K1-22, C07K17-00, G01N33-53, G01N37-00, G01N30-88, C07K14-31
【公開號】CN104603153
【申請?zhí)枴緾N201380042481
【發(fā)明人】巖倉正寬, 廣田潔憲, 大高誠治
【申請人】大曹株式會社
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2013年6月11日
【公告號】EP2862879A1, US20150152195, WO2013187398A1