本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種由干酪乳桿菌發(fā)酵制備胞外多糖的方法。

背景技術(shù)：

胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)是微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外，常滲于培養(yǎng)基中的一類糖類化合物。這些高分子糖類聚合物因具有多種多樣的化學組成、分子結(jié)構(gòu)和獨特的流變學特性，賦予發(fā)酵食品優(yōu)良的功能特性，可作為增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑等在食品和非食品工業(yè)中發(fā)揮重要作用。乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一類公認的具有較高經(jīng)濟價值的食品級微生物，具有公認的食用安全性(Generally recognized as safe，GRAS)，其作為人和動物體內(nèi)重要的正常生理菌群，常定殖于腸道等部位，起到維持體內(nèi)微生態(tài)平衡和健康的作用，已廣泛應用于食品、輕工業(yè)、醫(yī)藥、飼料等多個領(lǐng)域。其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胞外多糖本身具有增稠、乳化、保濕和穩(wěn)定等作用，同時還有助于改善發(fā)酵的流變學特性，減少發(fā)酵乳乳清析出現(xiàn)象，改善發(fā)酵乳質(zhì)地和感官質(zhì)量。一些乳酸菌胞外多糖還具有增強粘膜吸附、促進免疫、降低膽固醇和抗腫瘤等生理功能。因此，產(chǎn)胞外多糖乳酸菌在食品工業(yè)中具有廣闊的市場前景。然而,乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量一般來說都比較低，因此其應用也受到一定的限制。提高胞外多糖產(chǎn)量的研究，目前備受關(guān)注。通過篩選優(yōu)良菌種，優(yōu)化發(fā)酵條件，或?qū)N進行改良，可以在一定程度上提高胞外多糖的產(chǎn)率。近年來,隨著一些乳酸菌全基因組序列的報道和胞外多糖合成相關(guān)基因簇的克隆和功能分析，使得利用基因工程技術(shù)提高胞外多糖的產(chǎn)量成為可能。

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)LC2W(CGMCC No.0828)是一株功能性益生菌。中國專利申請CN104480056A公開了其發(fā)酵液中具有能夠降低 血壓的胞外多糖成分，然而該菌株的胞外多糖產(chǎn)量較低，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中干酪乳桿菌LC2W胞外多糖產(chǎn)量不高的技術(shù)問題，提供一種利用改造的干酪乳桿菌LC2W基因工程菌株高效生產(chǎn)胞外多糖的方法。本發(fā)明的方法在發(fā)酵過程中胞外多糖產(chǎn)量顯著提高，NADH氧化酶活性顯著提高，乳酸產(chǎn)生量顯著降低。

本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)過表達NADH氧化酶的產(chǎn)胞外多糖的干酪乳桿菌LC2W菌株在有氧條件下發(fā)酵相比在無氧條件下發(fā)酵，胞外多糖的產(chǎn)量明顯提高，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明技術(shù)方案之一：一種發(fā)酵含有NADH氧化酶基因表達載體的干酪乳桿菌LC2W的方法，所述方法包括以下步驟：在有氧條件下發(fā)酵含有NADH氧化酶基因表達載體的干酪乳桿菌LC2W。

本發(fā)明技術(shù)方案之二：一種由干酪乳桿菌發(fā)酵制備胞外多糖的方法，包括發(fā)酵含有NADH氧化酶基因表達載體的干酪乳桿菌LC2W，從發(fā)酵液中收集胞外多糖的步驟，所述發(fā)酵為有氧條件下發(fā)酵。

本發(fā)明中，所述干酪乳桿菌LC2W見中國專利申請CN1566326A，其保藏編號為CGMCC No.0828。所述表達載體可以為本領(lǐng)域常規(guī)的載體，較佳地選自各種質(zhì)粒、粘粒、噬菌體和病毒載體中的一種或多種，更佳地為pIB184。所述發(fā)酵含有NADH氧化酶基因表達載體的干酪乳桿菌LC2W較佳地為干酪乳桿菌基因工程菌184-1。所述干酪乳桿菌基因工程菌184-1見中國專利申請CN104480056A，其包含表達來源于變異鏈球菌CGMCC 1.2499的NADH氧化酶基因nox的表達載體pIB184-nox。所述發(fā)酵為有氧條件下發(fā)酵。其中，所述有氧可以為本領(lǐng)域常規(guī)所指的有氧條件，例如在大氣條件下或在發(fā)酵罐中向培養(yǎng)基中通入氧氣。所述發(fā)酵的溫度可以為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，較佳地為35-40℃，更佳地為35-37℃，最佳地為37℃。所述發(fā)酵的時間為 20-36h，更佳地為20-24h，最佳地為24h。所述發(fā)酵較佳地為振蕩發(fā)酵。所述振蕩的轉(zhuǎn)速可以為本領(lǐng)域常規(guī)的轉(zhuǎn)速，較佳地為200-240rpm，更佳地為200-220rpm，最佳地為220rpm。

本發(fā)明中，所述發(fā)酵的接種量可以為本領(lǐng)域常規(guī)的接種量。所述發(fā)酵的培養(yǎng)基可以為本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)乳桿菌的培養(yǎng)基，較佳地為MRS培養(yǎng)基。

所述從發(fā)酵液中收集胞外多糖的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，較佳地包括以下步驟：(1)將所得發(fā)酵液煮沸后冷卻，離心收集上清液；(2)將步驟(1)所述上清液用醇沉淀；(3)將步驟(2)所得沉淀重懸，然后加入三氯乙酸沉淀，離心，所得上清再用水透析即得。

步驟(1)中，所述煮沸的時間可以為本領(lǐng)域常規(guī)的時長，較佳地為10min。所述冷卻較佳地為冷卻至室溫。所述離心的速度可以為本領(lǐng)域常規(guī)的速度，較佳地為8000-12000g，更佳地為8000-10000g，最佳地為10000g。所述離心的時間可以為本領(lǐng)域常規(guī)的時長，較佳地為15-25min，更佳地為15-20min，最佳地為20min。所述離心的溫度可以為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，較佳地為4℃。

步驟(2)中，所述醇沉淀法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，較佳地包括加入醇后靜置，離心收集沉淀。所述醇較佳地為乙醇，所述加入醇后的終濃度較佳地為75％，所述百分比為體積百分比。所述靜置的時間較佳地為12小時，所述靜置較佳地為在4℃下靜置。所述離心的速度可以為本領(lǐng)域常規(guī)的速度，較佳地為8000-12000g，更佳地為8000-10000g，最佳地為10000g。所述離心的時間可以為本領(lǐng)域常規(guī)的時長，較佳地為15-25min，更佳地為15-20min，最佳地為20min。所述離心的溫度可以為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，較佳地為4℃。

步驟(3)中，所述重懸較佳地為用水重懸。所述三氯乙酸沉淀是除蛋白的常規(guī)方法，包括加入三氯乙酸、靜置和離心除去沉淀。所述加入三氯乙酸所達到的終濃度可以為本領(lǐng)域常規(guī)的濃度，較佳地為8％，所述百分比為質(zhì)量百分比。所述離心的速度可以為本領(lǐng)域常規(guī)的速度，較佳地為8000-12000g，更佳地為8000-10000g，最佳地為10000g。所述離心的時間可 以為本領(lǐng)域常規(guī)的時長，較佳地為15-25min，更佳地為15-20min，最佳地為20min。所述離心的溫度可以為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，較佳地為4℃。所述透析可以為本領(lǐng)域常規(guī)的操作，所述透析較佳地為用水透析。所述透析的透析袋的截留分子量較佳地為12-14kDa。所述透析的溫度較佳地為4℃。所述透析的時長較佳地為3天，其中每隔8小時換一次水。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明提供制備胞外多糖的方法中NADH氧化酶活性顯著提高，乳酸產(chǎn)生量顯著降低，在發(fā)酵過程中過表達NADH氧化酶的干酪乳桿菌LC2W菌株胞外多糖產(chǎn)量比不表達NADH氧化酶的干酪乳桿菌LC2W菌株的胞外多糖產(chǎn)量可以高出89％-110％；過表達NADH氧化酶的干酪乳桿菌LC2W菌株在有氧條件下發(fā)酵得到的胞外多糖的產(chǎn)量比在無氧條件下發(fā)酵得到的常量高30％。所制備的胞外多糖在提高提高免疫力的藥品、保健品或者食品的應用方面具有廣闊的前景。

附圖說明

圖1為發(fā)酵培養(yǎng)時菌體的生長曲線圖。LC2W為干酪乳桿菌出發(fā)菌株，184-1為其重組菌株。

圖2為184-1重組菌株在無氧及有氧條件下的菌體生長曲線。

具體實施方式

下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

本發(fā)明所用到的培養(yǎng)基成分如下：

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨1g、牛肉浸膏1g、酵母浸膏0.5g、葡萄糖2g、醋 酸鈉0.5g、吐溫800.1mL、檸檬酸二胺0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.058g、MnSO₄·4H₂O 0.025g、K₂HPO₄0.2g、水100mL，pH6.2-6.6，115℃，殺菌15min。

本發(fā)明所用到的菌株：干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)LC2W，光明乳業(yè)股份有限公司，見中國專利申請CN1566326A；干酪乳桿菌基因工程菌184-1，光明乳業(yè)股份有限公司，見中國專利申請CN104480056A。

本發(fā)明HPLC檢測乳酸的方法請見“葡萄酒蘋果酸—乳酸發(fā)酵HPLC分析方法的研究”郎詠梅,王傳芬,蔣文強中國釀造，2006,154:64-66；

硫酸-苯酚法測定胞外多糖含量的方法請見：Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et al.Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances.Anal Chem,1956,28:350-356；

NADH氧化酶活性測定方法請見：De Felipe FL,Kleerebezem M,De Vos WM,Hugenholtz J.Cofactor engineering:a novel approach to metabolic engineering in Lactococcus lactis by controlled expression of NADH oxidase.J Bacteriol 1998；180:3804-3808。

以下實施例所涉及到的濃度單位中乳酸產(chǎn)量單位g/L指每升發(fā)酵液中含有乳酸的克數(shù)，NADH氧化酶的活性單位U/mL指每毫升發(fā)酵液中含有的NADH氧化酶的酶活單位數(shù)，胞外多糖的產(chǎn)量mg/L指每升發(fā)酵液中含有的胞外多糖的毫克數(shù)。

實施例1

將干酪乳桿菌LC2W與干酪乳桿菌基因工程菌184-1分別接種于MRS培養(yǎng)基37℃有氧發(fā)酵24h，所述有氧發(fā)酵具體指在大氣條件下220rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束，檢測發(fā)酵液中乳酸產(chǎn)量，干酪乳桿菌LC2W乳酸產(chǎn)量為42.5g/L，干酪乳桿菌基因工程菌184-1乳酸產(chǎn)量為29.6g/L。

胞外多糖的提取方法包括以下步驟：

(1)收集發(fā)酵液在沸水浴中放置10分鐘，冷卻至室溫后，4℃10000×g離心20min，收集上清液；

(2)加入發(fā)酵液3倍體積的無水乙醇，4℃放置12h，4℃10000×g離 心20min；

(3)沉淀溶于發(fā)酵液1/10體積的去離子水，加入三氯乙酸至終濃度為8％(v/v)，4℃放置12小時，4℃10000×g離心20min，上清液在去離子水中利用透析袋進行透析，所述透析袋的截留分子量為12-14kDa，4℃透析，每8小時換一次水，透析3天。

用硫酸-苯酚法測定胞外多糖，測定結(jié)果為：干酪乳桿菌LC2W胞外多糖產(chǎn)量為125.6mg/L，干酪乳桿菌基因工程菌184-1胞外多糖產(chǎn)量為263.7mg/L，提高110.0％。

菌體經(jīng)超聲破碎后，進行NADH氧化酶活性測定。結(jié)果顯示，干酪乳桿菌LC2W NADH氧化酶活性為0.055U/mL，干酪乳桿菌基因工程菌184-1NADH氧化酶活性為2.65U/mL，干酪乳桿菌基因工程菌184-1比干酪乳桿菌LC2W株高48.2倍。

菌體生長曲線如圖1所示，過表達NADH氧化酶的干酪乳桿菌基因工程菌184-1生長明顯慢于干酪乳桿菌LC2W，最終的菌體濃度也顯著降低。

實施例2

將干酪乳桿菌基因工程菌184-1接種于MRS培養(yǎng)基，在37℃下分別無氧發(fā)酵和有氧發(fā)酵。所述無氧發(fā)酵具體指在厭氧箱中靜置培養(yǎng)24h；所述有氧發(fā)酵指在大氣條件下220rpm振蕩培養(yǎng)24h。通過HPLC檢測發(fā)酵液中的乳酸含量。當24小時發(fā)酵結(jié)束，無氧條件下重組菌株184-1乳酸產(chǎn)量為37.1g/L，有氧條件下重組菌株184-1乳酸產(chǎn)量為29.6g/L，比無氧發(fā)酵降低20％。

胞外多糖的提取方法同實施例1所述。經(jīng)測定，干酪乳桿菌LC2W基因工程重組菌株184-1在無氧條件下胞外多糖產(chǎn)量為202.7mg/L，在有氧條件下胞外多糖產(chǎn)量為263.7mg/L，有氧條件下發(fā)酵產(chǎn)量提高30％。

菌體經(jīng)超聲破碎后，進行NADH氧化酶活性測定。結(jié)果顯示，干酪乳桿菌基因工程菌184-1在無氧條件下NADH氧化酶活性為0.70U/mL，在有氧條件下NADH氧化酶活性為2.65U/mL，有氧條件下比無氧條件下NADH氧化酶活性提高3.8倍。

菌體生長曲線如圖2所示，過表達NADH氧化酶的干酪乳桿菌基因工程菌184-1在有氧條件下生長明顯慢于無氧條件培養(yǎng)，最終的菌體濃度也顯著降低。

實施例3

將干酪乳桿菌LC2W與干酪乳桿菌基因工程菌184-1分別接種于MRS培養(yǎng)基，35℃有氧發(fā)酵20h。所述有氧發(fā)酵具體指在大氣條件下200rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束，檢測乳酸產(chǎn)量，干酪乳桿菌LC2W乳酸產(chǎn)量為35.4g/L，干酪乳桿菌基因工程菌184-1乳酸產(chǎn)量為29.5g/L，干酪乳桿菌LC2W比干酪乳桿菌LC2W基因工程菌降低17％。

胞外多糖的提取方法同實施例1。

用硫酸-苯酚法測定胞外多糖，測定結(jié)果為：干酪乳桿菌LC2W胞外多糖產(chǎn)量為106.8mg/L，干酪乳桿菌基因工程菌184-1胞外多糖產(chǎn)量為202.3mg/L，干酪乳桿菌基因工程菌184-1比干酪乳桿菌LC2W提高89％。

菌體經(jīng)超聲破碎后，進行NADH氧化酶活性測定。結(jié)果顯示，干酪乳桿菌LC2W NADH氧化酶活性為0.051U/mL，干酪乳桿菌基因工程菌184-1NADH氧化酶活性為1.87U/mL，干酪乳桿菌基因工程菌184-1比干酪乳桿菌LC2W株高36.7倍。

實施例4

將干酪乳桿菌LC2W與干酪乳桿菌基因工程菌184-1分別接種于MRS培養(yǎng)基，40℃有氧發(fā)酵36h，所述有氧發(fā)酵具體指在大氣條件下240rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束，檢測乳酸產(chǎn)量，干酪乳桿菌LC2W乳酸產(chǎn)量為40.9g/L，干酪乳桿菌基因工程菌184-1乳酸產(chǎn)量為35.3g/L，干酪乳桿菌LC2W比干酪乳桿菌LC2W基因工程菌降低14％。

胞外多糖的提取方法與實施例1相同。

用硫酸-苯酚法測定胞外多糖，測定結(jié)果為：干酪乳桿菌LC2W胞外多糖產(chǎn)量為95.6mg/L，干酪乳桿菌基因工程菌184-1胞外多糖產(chǎn)量為182.3mg/L，干酪乳桿菌基因工程菌184-1比干酪乳桿菌LC2W提高91％。

菌體經(jīng)超聲破碎后，進行NADH氧化酶活性測定。結(jié)果顯示，干酪乳桿菌LC2W NADH氧化酶活性為0.058U/mL，干酪乳桿菌基因工程菌184-1NADH氧化酶活性為1.96U/mL，干酪乳桿菌基因工程菌184-1比干酪乳桿菌LC2W株高33.8倍。

應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的相關(guān)條件作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。