一種高抗慶大霉素干酪乳桿菌及其選育方法
【專利說明】-種高抗慶大霉素干酪乳桿菌及其選育方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種高抗慶大霉素干酪乳桿菌 (Lactobacilluscasei)GM-l，還設(shè)及一種高抗慶大霉素干酪乳桿菌GM-1的選育方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 乳桿菌是與人類生活關(guān)系密切的益生菌之一，廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸發(fā) 酵及醫(yī)療保健領(lǐng)域。其中，干酪乳桿菌具有較強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽能力，在消化道中有較強(qiáng)生 命力，并對其有較強(qiáng)的粘附能力，同時大量動物和人體實(shí)驗表明，干酪乳桿菌具有較強(qiáng)的抑 制致病菌、降血脂、提高有機(jī)體抗氧化、保護(hù)肝臟、預(yù)防糖耐受量受損和II型糖尿病、調(diào)節(jié) 有機(jī)體免疫力及抗腫瘤等益生功能。
[0003] 慶大霉素屬于氨基糖巧類抗生素，常常作為一線藥物用于治療胃腸道中細(xì)菌引起 的炎癥、尿路生殖系統(tǒng)感染、膽道感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和呼吸道感染的治療。
[0004] 一般地，服用抗生素期間不建議食用益生菌制品?？股氐某霈F(xiàn)可能會導(dǎo)致益生 菌的活力減弱甚至死亡，影響其發(fā)揮特有的生理功效，運(yùn)對日常生活過程中習(xí)慣食用益生 菌制品的人群極為不利。但事實(shí)上，近年來越來越多的臨床研究證據(jù)表明，同時服用益生菌 和抗生素更有利于一些疾病的治療。因此，圍繞抗生素選育具有耐藥特性的益生菌具有非 常重要的現(xiàn)實(shí)意義。 陽〇化]本發(fā)明利用微生物在特定生長條件下的適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)施干酪乳桿菌抗慶大霉素 選育試驗，是一種基于自然選擇的選育方法，具有安全顯效的特點(diǎn)。通過耐藥實(shí)驗證實(shí)所得 干酪乳桿菌GM-1對慶大霉素具有高耐藥性特征，該特征可確保干酪乳桿菌GM-1制品在與 慶大霉素同時服用時維持較高的活力。同時，運(yùn)一方法的建立可為高抗慶大霉素乳酸菌制 品的研究和開發(fā)利用奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006] [要解決的技術(shù)問題]
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種高抗慶大霉素干酪乳桿菌GM-1。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種高抗慶大霉素干酪乳桿菌GM-1的選育方法。
[0009] [技術(shù)方案]
[0010] 本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0011] 本發(fā)明設(shè)及一種高抗慶大霉素干酪乳桿菌化actobacilluscasei)GM-l，該菌株 已于2015年07月17日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、保藏，其保藏號為CGMCCNo. 11131。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的高抗慶大霉素干酪乳桿菌GM-1的MIC值 為 16y邑/ml。
[0013] 本發(fā)明還設(shè)及一種高抗慶大霉素干酪乳桿菌GM-1的選育方法，該選育方法包括 下述步驟：
[0014] A、菌株活化培養(yǎng)
[0015] 干酪乳桿菌ZhangCGMCCNo. 1697在液體MRS培養(yǎng)基中在溫度37 °C與有氧的條 件下活化培養(yǎng)2地，運(yùn)樣傳代培養(yǎng)3代，然后將得到的培養(yǎng)液在固體MRS平板上劃線，在溫 度37 °C的條件下培養(yǎng)48h，再隨機(jī)選取=個單菌落作為出發(fā)菌株，它們在MRS培養(yǎng)基中在 溫度37°C與有氧條件下活化傳代培養(yǎng)3代，然后凍干保藏，它們分別命名為干酪乳桿菌 Zhang-1、干酪乳桿菌Zhang-2和干酪乳桿菌Zhang-3。
[0016] B、制備接種液
[0017] 挑取步驟A中干酪乳桿菌Zhang-1、干酪乳桿菌Zhang-2和干酪乳桿菌Zhang-3單 菌落分別于5血生理鹽水中混勻得到S種菌懸液，用LSM培養(yǎng)液稀釋菌懸液至在波長600nm 條件下0D值為0. 16-0.2,得到干酪乳桿菌Zhang-1、Zhang-2和Zhang-3接種液。
[0018] C、含慶大霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)
[0019] 按照LSM培養(yǎng)基體積的1 %接種量，把干酪乳桿菌Zhang-1、干酪乳桿菌Zhang-2 和干酪乳桿菌Zhang-3接種液分別加到一組終濃度為0. 125、0. 25、0. 5、1、4、8、16、32與 64yg/mL慶大霉素的LSM培養(yǎng)基中，接著在溫度37°C的條件下發(fā)酵培養(yǎng)2地，得到一組試驗 發(fā)酵液。
[0020] D、無慶大霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)
[0021] 采用與步驟C操作方式相同的方式，讓干酪乳桿菌Zhang-1、干酪乳桿菌Zhang-2 和干酪乳桿菌Zhang-3在不添加慶大霉素的LSM培養(yǎng)基中進(jìn)行空白對照發(fā)酵，得到一組空 白對照發(fā)酵液。
[0022]E、紫外分光光度法測定
[0023] 在步驟C與步驟D結(jié)束后，采用紫外可見光分光光度法在波長600nm處測定所述 試驗發(fā)酵液0D值與所述空白對照發(fā)酵液0D值，然后對比分析確定能夠抑制50%干酪乳桿 菌Zhang生長的慶大霉素濃度，即慶大霉素ICw測定值。
[0024] 接著，WLSM培養(yǎng)基體積計1 %的接種量將干酪乳桿菌Zhang-1、干酪乳桿菌 Zhang-2和干酪乳桿菌Zhang-3接種液轉(zhuǎn)接至含有運(yùn)個濃度抗生素的LSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得 到第一次發(fā)酵液，將第一次發(fā)酵液再按照WLSM體積計1 %接種量再次接入含有運(yùn)個濃度 抗生素的LSM培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二次發(fā)酵，每日重復(fù)操作進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使運(yùn)些菌株發(fā)生適 應(yīng)性進(jìn)化，產(chǎn)生突變。
[00巧]F、進(jìn)化菌株耐藥性的檢測
[00%] 將出發(fā)菌株和傳代過程中的干酪乳桿菌Zhang用MRS培養(yǎng)基活化3代后，劃線于 固體MRS培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中在溫度37 °C下培養(yǎng)48h，挑取單菌落置于5mL濃度W重 量計0. 85%的化C1溶液中，混勻，測定在波長600nm處的0D值，用運(yùn)種鹽水將其0D值調(diào)整 至0. 16-0. 2,它的活菌數(shù)為3X108CFU/mU再用MRS培養(yǎng)基稀釋500倍后作為種子液待用， 它的活菌數(shù)為6Xl〇5CFU/mL。
[0027] 吸取2mL所述種子液，轉(zhuǎn)接于含有0.5-512yg/mL慶大霉素的LSM培養(yǎng)基中，則慶 大霉素濃度和菌液活菌數(shù)分別減半，每支試管中的活菌數(shù)為3Xl〇5CFU/mL;W4mL未添加 慶大霉素的含有活菌數(shù)3X105CFU的接種LSM與4mL添加慶大霉素又未接種的LSM分別作 為陽性對照與陰性對照，混勻后在恒溫培養(yǎng)箱中在溫度37°C下培養(yǎng)48h;測定=株干酪乳 桿菌Zhang出發(fā)菌株的MIC值為2yg/mU在連續(xù)繼代培養(yǎng)1個月后，耐藥性開始發(fā)生變化， 4個月后達(dá)到16yg/mU于是將運(yùn)種突變株命名為高抗慶大霉素干酪乳桿菌GM-1。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的LSM培養(yǎng)基由W體積計90%1ST培養(yǎng)基 與10% MRS培養(yǎng)基組成。
[0029] 下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0030] 本發(fā)明設(shè)及一種高抗慶大霉素干酪乳桿菌化actobacilluscasei)GM-l，該菌株 已于2015年07月17日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、保藏，其保藏號為CGMCCNo. 11131。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的高抗慶大霉素干酪乳桿菌GM-1的MIC值 為 16y邑/ml。
[0032] 在本發(fā)明中，MIC值是指最小抑制濃度（MinimuminhibitoiTconcentration)，是 經(jīng)培養(yǎng)能夠抑制微生物生長的最小抗生素濃度。
[0033] 本發(fā)明還設(shè)及一種高抗慶大霉素干酪乳桿菌GM-1的選育方法，該選育方法包括 下述步驟：
[0034]A、菌株活化培養(yǎng)
[0035] 干酪乳桿菌ZhangCGMCCNo. 1697在液體MRS培養(yǎng)基中在溫度37 °C與有氧的條 件下活化培養(yǎng)2地，運(yùn)樣傳代培養(yǎng)3代，然后將得到的培養(yǎng)液在固體MRS平板上劃線，在溫 度37°C的條件下培養(yǎng)48h，再隨機(jī)選取=個單菌落作為出發(fā)菌株，它們在MRS培養(yǎng)基中在 溫度37°C與有氧條件下活化傳代培養(yǎng)3代，然后凍干保藏，它們分別命名為干酪乳桿菌 Zhang-1、干酪乳桿菌Zhang-2和干酪乳桿菌Zhang-3。
[0036] 在運(yùn)個步驟中，活化傳代培養(yǎng)3代的目的是使菌種恢復(fù)活力。
[0037] 在運(yùn)個步驟中，所述的MRS培養(yǎng)基是由10克蛋白腺、10克牛肉膏、5克酵母膏、2克 巧樣酸氨二錠、20克葡萄糖、1. 0ml吐溫80、5克=水合乙酸鋼、2克=水合憐酸氨二鐘、0. 58 克屯水合硫酸儀、0. 25克一水合硫酸儘、18克瓊脂與1000ml蒸饋水組成，其抑6. 2-6.6。
[0038] 本發(fā)明使用的液體MRS培養(yǎng)基是0X0ID公司W(wǎng)商品名MRS化oth(CM0359)銷售的 廣品。
[0039] 所述的凍干保藏是微生物技術(shù)領(lǐng)域里常規(guī)的保藏方法。 W40] B、制備接種液
[0041] 挑取步驟A