副干酪乳桿菌HD1.7prcK基因siRNA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及副干酪乳桿菌基因的siRNA分子。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來研宄中研宄人員發(fā)現(xiàn)在某些G+菌QS體系中的AIP不僅僅是信號分子，它 還具有抗菌能力，如乳酸乳球菌的nisin，植物乳桿菌的植物乳桿菌素等等。這些抗菌肽 (antimicrobial peptide，AMP)的基因簇中除了含有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因外，還有一個輔 助蛋白（accessory protein，AP)編碼基因，它們的產(chǎn)物組成了 AMP輸出和處理體系。AMP 的結(jié)構(gòu)基因都位于其相應(yīng)的免疫蛋白基因之前，產(chǎn)生的AMP大多數(shù)富含半胱氨酸，具有疏 水性，而且，經(jīng)研宄發(fā)現(xiàn)，AMP的最大生產(chǎn)量與產(chǎn)生菌的非最佳生長條件有關(guān)。
[0003] 根據(jù)AMP的性質(zhì)不同，可將AMP分為兩大類：一類是I型AMPs或硫醚抗生素，它 們是一些對熱穩(wěn)定的肽類，在被分泌之前會被進(jìn)行高度的翻譯后修飾，如nisin、枯草菌素； 另一類是II型AMPs或熱穩(wěn)定的AMPs，它們具有特征性的雙甘氨酸基序，分泌之前不存在 修飾過程，但在分泌后，前體肽的N端會有一個片段被移去，如植物乳桿菌素、乳酸桿菌素P 等。
[0004] 副干酷乳桿菌（Lactobacillusparacasei)HDl. 7,革蘭氏陽性菌，2003年從齊齊 哈爾豐源食品有限公司乳酸酸菜發(fā)酵液中分離獲得。它最大的特點(diǎn)是在其發(fā)酵液中可產(chǎn)生 抑制多種G+、G1P釀酒酵母生長的肽類物質(zhì)，分子量在10kD左右，熱穩(wěn)定，酸性條件下（pH 2~6)活性高，其性能比目前市面上常用的nisin更為優(yōu)越，因?yàn)閚isin能有效的抑制革蘭 氏陽性菌如一些腐敗菌、致病菌和芽孢菌，而對革蘭氏陰性菌起的作用并不大，甚至不起作 用。同時經(jīng)過研宄還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將高密度菌體發(fā)酵液（>l〇 n個/mL)添加到低密度菌體發(fā)酵液 (<105個/mL)中時，可促進(jìn)低密度菌體中這種AMP的生成；發(fā)酵24h和48h的菌體發(fā)酵液， 其抑菌能力相差較大。以上種種現(xiàn)象說明，該菌產(chǎn)生的這種AMP的產(chǎn)量可能受到菌群密度 影響和控制。
[0005] 國外Nakayama等通過PCR方法克隆到了副干酪乳桿菌擬群體效應(yīng)相關(guān)基因 (prcA、prcK和prcR)，但對于這些基因在群體感應(yīng)中的具體功能，以及AMP產(chǎn)量是否與群體 感應(yīng)有關(guān)尚不明確。
[0006] 目前，基因功能的研宄方法主要有兩種：一種是增強(qiáng)基因表達(dá)，然后對獲得的表達(dá) 產(chǎn)物進(jìn)行研宄；另一種是減弱或者終止基因表達(dá)，通過觀察生物整體功能的變化，進(jìn)而推測 相應(yīng)的基因功能。由于第一種方法往往不能反映基因產(chǎn)物的真實(shí)表達(dá)情況，而逐漸被拋棄。 第二種方法中RNA干擾技術(shù)（RNAi)實(shí)際上只是在轉(zhuǎn)錄后水平上降低基因的表達(dá)；其中，基 因敲除技術(shù)是構(gòu)建基因沉默突變株最為常用的方法。但是，構(gòu)建自殺質(zhì)粒必須選擇出合適 的載體，載體質(zhì)粒在受體菌中不能復(fù)制，載體質(zhì)粒必須帶有一個在整合到染色體內(nèi)以后可 供選擇的抗性標(biāo)記，載體質(zhì)粒帶有易于克隆的多克隆位點(diǎn)；必須選擇出足夠長的同源臂，同 源臂越長越有利于同源重組的發(fā)生，可降低錯誤置換的發(fā)生率，而且同源臂又必須滿足酶 切位點(diǎn)的單一性，在同源臂內(nèi)部不能包含插入時用到的限制性酶切位點(diǎn)；必須選擇出合適 的目標(biāo)基因，目標(biāo)基因片段與替換的片段長度相同，且不含插入時用到的限制性酶切位點(diǎn)， 不能引入突變。所以，要同時滿足上述所有條件構(gòu)建自殺質(zhì)粒的難度非常大；而且，同源臂 的長短依賴目的基因的長短，不利于同源重組的發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明為了解決構(gòu)建自殺質(zhì)粒難度大，同源臂的長短依賴目的基因的長短，不利 于同源重組的發(fā)生等問題，而提供的副干酪乳桿菌HD1. 7prcK基因siRNA。
[0008] 本發(fā)明第一種副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7prcK 基因 siRNA 的核苷酸序列為5' -GCAACGCUCCAACUUUCAUTT-3' ；第一種副干酪乳桿菌HD 1. 7prcK基因 siRNA 的正義鏈核苷酸序列為 5' -AUGAAAGUUGGAGCGUUGCTT-3'。
[0009] 本發(fā)明第二種副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7prcK 基因 siRNA 的核苷酸序列為5' -CCAACUUUCAUUGCAACAATT-3' ；第二種副干酪乳桿菌HD 1. 7prcK基因 siRNA的正義鏈核苷酸序列為5' -UU⑶UGCAAUGAAA⑶UGGTT-3'。
[0010] 本發(fā)明利用siRNA分子具有獨(dú)特的雙鏈結(jié)構(gòu)，在協(xié)同因子的協(xié)同下有效的裂 解靶RNA。本發(fā)明的兩種siRNA分子都能夠高效的阻斷副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7prcK基因的表達(dá)，從而降低副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei) HD1. 7細(xì)菌素的產(chǎn)量。根據(jù)測定，siRNA電轉(zhuǎn)化副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei) HD1. 7突變株的生長曲線與原始菌株的生長曲線基本一致，突變株的生長情況與原始菌株 并無顯著差異。
[0011] 本發(fā)明利用siRNA分子干擾技術(shù)構(gòu)建副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei) HD 1. 7prcK基因沉默突變株，對進(jìn)一步研宄prcK基因?qū)Ω备衫胰闂U菌（Lactobaci 1 lus paracasei) HD1. 7產(chǎn)細(xì)菌素的影響具有重大意義，為之后研宄prcK基因與副干酪乳桿菌擬 群體效應(yīng)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0012] 本發(fā)明siRNA構(gòu)建簡單，不依賴目的基因的長短，不易發(fā)生同源重組。
[0013] 本發(fā)明的兩種副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7prcK 基因 siRNA 在用量較少的情況下仍能夠顯著降低prcK基因的表達(dá)，具有高效干擾性。
【附圖說明】
[0014] 圖1是實(shí)施例1中熒光標(biāo)記siRNA(5' -FAM labelled siRNA)分子電轉(zhuǎn)化副干酪 乳桿菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7感受態(tài)細(xì)胞顯微鏡觀察圖。
[0015] 圖2是實(shí)施例1中熒光標(biāo)記siRNA(5' -FAM labelled siRNA)分子電轉(zhuǎn)化副干酪 乳桿菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7感受態(tài)細(xì)胞焚光顯微鏡觀察圖。
[0016] 圖3是實(shí)施例1中熒光定量PCR測定prcK基因相對表達(dá)量柱形圖。
[0017] 圖4是實(shí)施例1中不同電轉(zhuǎn)化副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7 突變株及原始副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7發(fā)酵上清液對指示菌的抑 制程度柱形圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。
【具體實(shí)施方式】 [0019] 一：本實(shí)施方式副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei) HD1. 7prcK基因siRNA的反義鏈核苷酸序列為5' -GCAACGCUCCAACUUUCAUIT-3' ；副干酪乳桿 菌 HD1. 7prcK 基因 siRNA 的正義鏈核苷酸序列為 5' -AUGAAAGUUGGAGCGUUGCTT-3'。
[0020] 本實(shí)施方式siRNA命名為siRNA-Kl。
【具體實(shí)施方式】 [0021] 二：本實(shí)施方式副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei) HD1. 7prcK基因siRNA的反義鏈核苷酸序列為5' -CCAACUUUCAUUGCAACAAIT-3' ；副干酪乳桿 菌 HD1. 7prcK 基因 siRNA 的正義鏈核苷酸序列為 5' -UUGUUGCAAUGAAAGUUGGIT-3'。
[0022] 本實(shí)施方式siRNA命名為siRNA-K2。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 一、siRNA分子電轉(zhuǎn)化副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7感受態(tài)細(xì) 胞：
[0025] 取特異性 siRNA 分子（siRNA-Kl 和 siRNA-K2)、非特異性 siRNA 分子（siRNA-KS) 以及熒光標(biāo)記siRNA分子（5' -FAM labelled siRNA)分別與L. paracasei HD1. 7感受態(tài)細(xì) 胞混合，在電壓值2. 5kv、電阻值200 D、電容值25 y F的條件下電擊時間5ms ;其中，siRNA 分子的濃度為〇. 3 y g/ y L，感受態(tài)細(xì)胞濃度為5X 107CFU/ y L，電轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系總體積為 50 yL。另外，設(shè)空白對照組不加siRNA分子，直接取L. paracasei HD1. 7感受態(tài)細(xì)胞置于 電轉(zhuǎn)化杯中，在電壓值2. 5kv、電阻值200 Q、電容值25 y F的條件下電擊時間5ms。
[0026] 表1 siRNA分子反義鏈序列
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 副干酪乳桿菌HDL 7prcK基因siRNA，其特征在于副干酪乳桿菌HDL 7prcK基因 siRNA 的核苷酸序列為 5' -GCAACGCUCCAACUUUCAUTT-3'。
2. 副干酪乳桿菌HDL 7prcK基因siRNA，其特征在于副干酪乳桿菌HDL 7prcK基因 siRNA 的核苷酸序列為 5' -CCAACUUUCAUUGCAACAATT-3'。
【專利摘要】副干酪乳桿菌HD1.7prcK基因siRNA，它涉及副干酪乳桿菌基因的siRNA分子。它解決構(gòu)建自殺質(zhì)粒難度大，同源臂的長短依賴目的基因的長短，不利于同源重組的發(fā)生等問題。siRNA-K1核苷酸序列為5'-GCAACGCUCCAACUUUCAUTT-3'。siRNA-K2核苷酸序列為5'-CCAACUUUCAUUGCAACAATT-3'。本發(fā)明的兩種siRNA分子都能夠高效的阻斷副干酪乳桿菌HD1.7prcK基因的表達(dá)，從而降低副干酪乳桿菌HD1.7細(xì)菌素的產(chǎn)量。
【IPC分類】C12N15-113
【公開號】CN104845972
【申請?zhí)枴緾N201510259660
【發(fā)明人】葛菁萍, 王洋, 孫艷陽, 高冬妮, 平文祥
【申請人】黑龍江大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月20日