技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的方法。

背景技術(shù)：

羥脯氨酸（hydroxyproline），亞氨基酸之一，通常在第四位上帶有羥基，但有時也在第3位上。由于有兩個不對稱的碳原子，所以有4種立體異構(gòu)體。在動物膠和骨膠原中含有L-羥脯氨酸。自然界中不存在D-羥脯酸。是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿，可以通過脯氨酸羥化酶生成。在食品、醫(yī)學(xué)和工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用。在食品上, 羥脯氨酸可作為嬰兒的營養(yǎng)物質(zhì)來源來補(bǔ)充甘氨酸丙氨酸和葡萄糖，羥脯氨酸還有獨(dú)特的甜味能改善飲料的風(fēng)味，常作為飲料的添加劑；醫(yī)學(xué)上，在食品和飲料中添加可防止過敏性炎癥，衍生物 N-乙酰羥脯氨酸可用于治療結(jié)蹄組織疾病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；順式-4-羥脯氨酸作為抗癌藥物治療各種癌癥，包括肝，膀胱，前列腺，腎盂等。防止骨膠原折疊成一個穩(wěn)定的三螺旋構(gòu)象,從而減少瘤細(xì)胞生長和纖維化過程中膠原過度沉積；抗肝纖維化、抗高血壓。

隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，大氣污染和全球變暖的趨勢日益惡化。國內(nèi)多采用生物提取法由明膠、骨膠、干酪素、大豆表皮等蛋白質(zhì)，用鹽酸水解，用亞硝化法提取亞氨酸后經(jīng)樹脂層析后精制、結(jié)晶而成，并且順式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)還需要通過手性異構(gòu)合成，生物法合成順式-4-羥脯氨酸具有經(jīng)濟(jì)學(xué)和生態(tài)學(xué)雙重意義，生物法合成順式-4-羥脯氨酸的基因工程菌主要有大腸桿菌和酵母。目前生物法合成順式-4-羥脯氨酸主要有兩種方式：發(fā)酵法和生物轉(zhuǎn)化法。發(fā)酵法原料來源廣泛且可再生，成本低，產(chǎn)量較高，污染也較小，但其調(diào)控過程比較復(fù)雜；生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)量高，成本低，過程簡單，有利于下游提取操作。大腸桿菌生長速率快，生產(chǎn)周期短，而大腸桿菌中存在底物降解途徑與羥脯氨酸產(chǎn)生存在競爭，而羥脯氨酸的產(chǎn)生需要α-酮戊二酸參加反應(yīng)，而α-酮戊二酸也存在其他途徑的競爭，然而敲除過多基因會抑制菌體的生長，本文通過CASI抑制putA脯氨酸脫氫酶基因，以及琥珀酸脫氫酶sucA，sucB,異檸檬酸裂解酶基因aceA,異檸檬酸激酶aceK的表達(dá)提高反應(yīng)中α-酮戊二酸和脯氨酸濃度利于順式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)生。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的方法，該方法簡單易行，提高了原料利用率，節(jié)約了生產(chǎn)成本，該方法能利用脯氨酸產(chǎn)生順式-4-羥脯氨酸即解決了生產(chǎn)過程中的環(huán)境污染問題，又解決了敲除多個基因會影響菌體的快速生長，又能提高底物與輔酶濃度提高產(chǎn)物的產(chǎn)生。

一種產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的方法，通過在宿主菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建過表達(dá)脯氨酸羥化酶基因Ecp4H，利用CRISPR-Cas9技術(shù)抑制脯氨酸降解途徑中脯氨酸羥化酶基因putA以及α-酮戊二酸降解途徑中琥珀酸脫氫酶基因sucA、sucB，異檸檬酸裂解酶基因aceA和異檸檬酸激酶基因aceK的表達(dá)得到重組菌株，并將重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)后獲取全細(xì)胞，最后全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸。

作為上述方法優(yōu)選的是，所述脯氨酸羥化酶基因putA，GenBank: AY143338.1 ；琥珀酸脫氫酶sucA和sucB,Gene ID: 7329904；異檸檬酸裂解酶基因aceA,Gene ID: 946829；異檸檬酸激酶aceK,Gene ID:946036。

作為上述方法優(yōu)選的是，所述的宿主菌為大腸桿菌BL21、大腸桿菌TransB、大腸桿菌Rosetta或大腸桿菌Origami中的一種。

上述方法包括以下步驟：

步驟1，配種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、反應(yīng)液、soc培養(yǎng)基、菌體洗液，并與培養(yǎng)皿、錐形瓶、離心管滅菌后備用；

步驟2，構(gòu)建得重組質(zhì)粒pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及質(zhì)粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK，并轉(zhuǎn)入宿主菌細(xì)胞內(nèi)37℃下培養(yǎng)12-14h得菌種；

步驟3，向離心管中依次接入種子培養(yǎng)基和菌種后，搖床上培養(yǎng)9-10h得發(fā)酵菌種；

步驟4，向錐形瓶中依次接入發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵菌種，搖床培養(yǎng)至OD至少為0.6，再加入至終濃度為0.8-1.2mmol的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)后離心8-10min，倒掉上清，收集菌體，用菌體洗液洗滌2-4遍后得備用菌體；

步驟5，向滅菌后錐形瓶中依次加入反應(yīng)液和備用菌體，加入緩沖溶液，并用KOH調(diào)節(jié)pH至中性，進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)，反應(yīng)中并用磷酸調(diào)節(jié)pH至中興，其中，備用菌體的干重為0.41g/L；

步驟6，每隔5-8h取樣一次，并通過液相檢測產(chǎn)物，待全細(xì)胞催化55-65h時結(jié)束得產(chǎn)物順式-4-羥脯氨酸。

作為方法優(yōu)選的是，步驟1中反應(yīng)液由脯氨酸、α-酮戊二酸、硫酸亞鐵和維生素C組成，其中，脯氨酸密度為9-11g/L， α-酮戊二酸密度為10-12g/L，硫酸亞鐵和維生素C的摩爾濃度比為3：4mmol/L。

作為方法優(yōu)選的是，步驟3中搖床培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為250rpm。

作為上述方法優(yōu)選的是，步驟4中發(fā)酵培養(yǎng)基與搖瓶體積比為1：5，發(fā)酵菌種的量為發(fā)酵培養(yǎng)基的1-2%倍，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為20℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，離心用的離心力為4000g/min，離心10min。

作為上述方法優(yōu)選的是，步驟5中pH調(diào)節(jié)至6-8。

作為pH優(yōu)選的是，步驟5中pH通過磷酸調(diào)節(jié)至6.5。

作為上述方法優(yōu)選的是，步驟6中全細(xì)胞催化時間為60h。

有益效果

本發(fā)明方法提供了一種產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的方法，有效降低了胞內(nèi)脯氨酸在其他路徑上的消耗，首次實現(xiàn)了用CASI系統(tǒng)減少了脯氨酸用于其他路徑的消耗，并且抑制了降解α-酮戊二酸的競爭途徑抑制了多個基因，但不影響菌體的生長，使得一種產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的方法變得更加簡單，不僅有效的減少了底物脯氨酸和α-酮戊二酸的消耗，而且大幅度提高了轉(zhuǎn)化效率。這從很大程度上節(jié)約了生產(chǎn)成本，并對于環(huán)境的保護(hù)起到了一定的作用。

（1）有效降低了胞內(nèi)脯氨酸在其他路徑上的消耗的培養(yǎng)策略，增加了CASI

抑制比不增加CASI抑制產(chǎn)量提高了1.5倍，效果明顯。

（2）抑制了降解α-酮戊二酸的競爭，降低了反應(yīng)成本，并且不影響菌體的

生長，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為標(biāo)準(zhǔn)品順式-4-羥脯氨酸的出峰時間4.1分鐘；

圖2為標(biāo)準(zhǔn)品底物L(fēng)-脯氨酸的出峰時間8.1分鐘；

圖3為實施例2中順式-4-羥脯氨酸的出峰時間及底物L(fēng)-脯氨酸的出峰時間；

圖4 為重組質(zhì)粒pET-28a-CP4H；

圖5 為重組質(zhì)粒pACYC-Cas9；

圖6 為重組質(zhì)粒pCDF-303-putA-aceA-aceK-sucA-sucB。

具體實施方式

實施例1 構(gòu)建重組質(zhì)粒

1.通過金唯質(zhì)基因合成公司合成優(yōu)化后脯氨酸羥化酶基因構(gòu)建于在體pET-28a載體上酶切位點(diǎn)為NdeI/XhoI. 構(gòu)建得重組質(zhì)粒pET-28a-Ecp4H

2.pACYC-CAS9蛋白為實驗室提供

3.pCDF-303-CriRNA-putA-sucA-sucB-aceA-aceK

抑制代謝途徑脯氨酸降解基因putA,琥珀酸脫氫酶基因sucA和sucB,異檸檬酸裂解酶基因aceA,異檸檬酸激酶aceK，轉(zhuǎn)化pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及質(zhì)粒pCDF-putA-sucA-sucB-aceA-aceK。

實施例2

一種產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的方法，包括以下步驟：

步驟1，配種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、反應(yīng)液、soc培養(yǎng)基、菌體洗液，并與培養(yǎng)基、錐形瓶、離心管一起滅菌備用，其中：

發(fā)酵培養(yǎng)基LB：蛋白胨10g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，氨芐青霉素0.02%，氯霉素0.01%，鏈霉素0.01% pH7.0。

反應(yīng)液：10 g /L 脯氨酸， 10 g/Lα-酮戊二酸, 0.2mol/L磷酸二氫鉀, 0.2mol/L磷酸氫二鉀,0.8mmol/L維生素C, 0.4 mmol/L 硫酸亞鐵，其中硫酸亞鐵用純水配置。

菌體洗液:PBS 7.0溶液，11.09g/LNaH₂PO_{4 ,}2.96g/LNa₂HPO₄。

soc培養(yǎng)基:蛋白胨4g/L，酵母粉1g/L，NaCl 10mm/L，KCl 2.5mm/L，MgSO₄ 10mm/L，MgCl₂ 20mm/L，葡萄糖20 g/L。

種子培養(yǎng)基的配方同發(fā)酵培養(yǎng)基。

步驟2，將實施例1中構(gòu)建得重組質(zhì)粒pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及質(zhì)粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TransB后在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14h得菌種；

步驟3，向50ml離心管依次接入10ml的種子培養(yǎng)基、0.2um的抗生素和菌種后，搖床37℃轉(zhuǎn)速為200rpm下培養(yǎng)得發(fā)酵菌種；

步驟4，向錐形瓶中依次接入發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵菌種，搖床培養(yǎng)至OD長至0.6時，加入至終濃度為1mmol的IPTG，20℃，200rpm誘導(dǎo)12h后，離心10 分鐘倒掉上清，收集菌體后用菌體洗液2遍后得備用菌體，其中離心時離心力4000g/min；

步驟5，向滅菌后錐形瓶中依次加入反應(yīng)液和備用菌體，控制反應(yīng)溶液中菌體的干重為0.41g/L，加入緩沖溶液，并用KOH調(diào)節(jié)pH至7.2后進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)，反應(yīng)過程中用磷酸調(diào)節(jié)pH在7.2。

步驟6，每隔6h取一次樣檢測，并通過液相檢測產(chǎn)物，等到55h-65h停止催化反應(yīng)，取最終產(chǎn)物。

順式-4-羥脯氨酸含量，HPLC-ELSD分析。

HPLC-ELSD分析使用蒸發(fā)光檢測器，色譜柱為Prevail C18反向柱(250 mm × 4.6 mm × 5 μm)。HPLC條件為：流動相A：1升純水中含有7毫升三氟乙酸0.653毫升七氟丁酸，流動相B：100% 乙腈，條件如下：100% A；流速：1.0 ml/min；柱溫：28.5±1 °C；進(jìn)樣量：10 μl。ELSD檢測條件：霧化溫度為115°C，氣流速為3.2L/min。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)HPLC-ELSD分析（如圖3所示），出峰時間為4.1分鐘與標(biāo)品出峰時間一致。

實施例3

一種產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的方法，包括以下步驟：

步驟1，配種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、反應(yīng)液、soc培養(yǎng)基、菌體洗液，并與培養(yǎng)皿、離心管滅菌備用，其中：

soc培養(yǎng)基:蛋白胨4g/L，酵母粉1 g/L，NaCl 10mm/L，KCl 2.5mm/L，MgSO4 10mm/L，MgCl2 20mm/L，葡萄糖20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基M9：葡萄糖10g/L，NH4Cl 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4 1mol/L,CaCl2 1mol/L,FeSO4?7H2O 0.005mol/L；

反應(yīng)液：10 g /L 脯氨酸， 10 g/Lα-酮戊二酸, 0.2mol/LKH2PO4, 0.2mol/LK2HPO4,0.8mmol /L維生素C, 0.4 mmol /L FeSO4，其中硫酸亞鐵用純水配置；

菌體洗液:PBS 7.0溶液，11.09g/LNaH2PO4 ,2.96g/LNa2HPO4。

步驟2至步驟3同實施例。

步驟4，向錐形瓶中依次接入發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵菌種，搖床培養(yǎng)至OD為0.6時，加入至終濃度為1mmol的IPTG，20℃，200rpm誘導(dǎo)14h后，離心10 分鐘，倒掉上清，收集菌體，用菌體洗液清洗2遍后得備用菌體，其中離心時離心力4000g/min。

步驟5，向滅菌后錐形瓶中依次加入反應(yīng)液和備用菌體，控制反應(yīng)溶液中菌體的干重為0.41g/L，加入緩沖溶液，并用KOH調(diào)節(jié)pH至6.5后進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)，反應(yīng)過程中用磷酸調(diào)節(jié)pH在6.5。

步驟6，每隔6h取一次樣檢測，并通過液相檢測產(chǎn)物，等到55h-65h取產(chǎn)物順式-4-羥脯氨酸。

對比例

以上述產(chǎn)脯氨酸羥化酶菌株進(jìn)行全細(xì)胞催化，其他反應(yīng)條件同實施例2，全細(xì)胞催化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中順式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到2.50g/L。

本發(fā)明方法中不同實施例產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的量記錄于下表中，從中可以看出由于pH的改變導(dǎo)致產(chǎn)量發(fā)生明顯的變化，及由于M9培養(yǎng)基比較簡單，所以菌體生長慢一些，但成本比較低。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制；凡本領(lǐng)域的技術(shù)人員，應(yīng)該理解，上述實施例和說明書中描述的只是說明發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明技術(shù)精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有些許更動、修飾與演變的等同變化，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對以上實施例所做的任何等同變化的更動、修飾與演變等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。