一種蘋(píng)果中irt1啟動(dòng)子插入元件的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蘋(píng)果中IRT1啟動(dòng)子插入元件的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)一種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的方法，包括檢測(cè)待測(cè)植物的IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列，IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均具有5′-ATTATAA-3′序列的待測(cè)植物的耐缺鐵能力大于或候選大于IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均不具有5′-ATTATAA-3′序列的待測(cè)植物的耐缺鐵能力。利用本發(fā)明公開(kāi)的IRT1啟動(dòng)子上的元件TATA-box的缺失和存在可以快速的篩選后代中的耐缺鐵植株。本發(fā)明在植物的耐缺鐵領(lǐng)域中具有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種蘋(píng)果中I RT1啟動(dòng)子插入元件的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種蘋(píng)果中IRT1啟動(dòng)子插入元件的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵元素是作物生長(zhǎng)必需的微量元素之一。缺鐵脅迫造成的果樹(shù)葉片黃化和植株早 衰的現(xiàn)象能引起作物品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低，對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益有著極大的影響。我國(guó)蘋(píng)果樹(shù)大 多生長(zhǎng)于偏堿性土壤中，易發(fā)生黃葉病的現(xiàn)象，因此尋求缺鐵脅迫的內(nèi)在機(jī)制來(lái)改善蘋(píng)果 缺鐵失綠癥顯得愈來(lái)愈重要。
[0003] 蘋(píng)果鐵高效基因型小金海棠缺鐵處理的根系CDNA文庫(kù)中克隆得到的二價(jià)陽(yáng)離子 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 MxIRTl基因 （Peng li，et al，2006)，其合成的蛋白對(duì)小金海棠對(duì)鐵的吸收和 轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要作用。該基因的cDNA全長(zhǎng)為1398bp，0RF為1095bp。該基因編碼一 個(gè)364個(gè)氨基酸的多肽，是一種膜蛋白，具有一個(gè)由30個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列和7個(gè) 跨膜螺旋，3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)0-糖基化位點(diǎn)，在第3和第4個(gè)跨膜螺旋之間有一富 含組氨酸的區(qū)域（HGHFHAHNH)，該區(qū)域被認(rèn)為是金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)。MxIRTl基因的表達(dá) 在缺鐵不同時(shí)間存在差異，但造成其差異表達(dá)的內(nèi)在原因還不清楚。
[0004] 小金海棠是一種耐缺鐵的植株，它是一種典型的機(jī)理I植物，g卩：植物通過(guò)質(zhì)膜上 的H+-ATPase，使土壤酸化，增加鐵的可溶性，然后在三價(jià)鐵還原酶的作用下將三價(jià)鐵還原 成二價(jià)鐵，在二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下將二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，增加植株的耐缺鐵性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種蘋(píng)果中IRT1啟動(dòng)子插入元件的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供一種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的方法，包括檢測(cè)待測(cè)植 物的IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列，IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均具有 5' -ATTATAA-3'序列的待測(cè)植物的耐缺鐵能力大于或候選大于IRT1蛋白質(zhì)的基因組基 因序列啟動(dòng)子區(qū)域均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待測(cè)植物的耐缺鐵能力。
[0007] 上述方法中，所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均具有 5' -ATTATAA-3'序列的待測(cè)植物為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列的-363~-357位置均 為Y -ATTATAA-3'序列的待測(cè)植物；
[0008] 所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均不具有Υ -ATTATM-3'序列 的待測(cè)植物為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列的-363~-357位置均不為Y -ATTATAA-3 ^ 序列的待測(cè)植物；
[0009] 所述-363~-357位置為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列中IRT1基因起始密碼子 ATG的5'上游方向第-363位至第-357位，以IRT1基因起始密碼子ATG中的A為第+1位。
[0010] 上述任一所述的方法中，所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均具有 5 ^ -ATTATAA-3 ^序列的待測(cè)植物的鑒定方法如下：以待測(cè)植物的基因組DNA為模板，以 SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果 所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第216位至第222位均為Υ -ATTATAA-3^，則待測(cè)植物為 IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均具有Y -ATTATAA4序列的待測(cè)植物；
[0011] 所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均不具有Υ -ATTATM-3'序列 的待測(cè)植物的鑒定方法如下：以待測(cè)植物的基因組DNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末 端起第216位至第222位均不為Y -ATTATAA-3'，則待測(cè)植物為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基 因序列啟動(dòng)子區(qū)域均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待測(cè)植物。
[0012] -種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括 檢測(cè)待測(cè)植物的IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列，IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列具有純合 5' -TTG-3'序列的待測(cè)植物的耐缺鐵能力大于或候選大于IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序 列不具有Y -TTG-3'序列的待測(cè)植物的耐缺鐵能力；
[0013] 所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列具有純合Y -TTG-3'序列的待測(cè)植物為 IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列的-376~-374位置均為Y -TTG-3'序列的待測(cè)植物；
[0014] 所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列不具有Y -TTG-3'序列的待測(cè)植物為IRT1 蛋白質(zhì)的基因組基因序列的-376~-374位置均不為Y -TTG-3'序列的待測(cè)植物；
[0015] 所述-376~-374位置為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列中IRT1基因起始密碼子 ATG的5'上游方向第-376位至第-374位，以IRT1基因起始密碼子ATG中的A為第+1位。
[0016] 一種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括 檢測(cè)待測(cè)植物的IRT1蛋白的氨基酸序列，IRT1蛋白自N端起第32位氨基酸為天冬氨酸的 待測(cè)植物的耐缺鐵能力大于或候選大于IRT1蛋白自N端起第32位氨基酸為谷氨酸的待測(cè) 植物的耐缺鐵能力。
[0017] 一種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括 如下步驟：提取待測(cè)植物的基因組DNA，以其為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示 的DNA分子為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度均為727bp的 待測(cè)植物的耐缺鐵能力大于或候選大于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度均為717bp的待測(cè)植物的耐缺 鐵能力。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述植物為蘋(píng)果屬植物。
[0019] 上述任一所述的方法中，所述蘋(píng)果屬植物為小金海棠、山定子、M9或三者之間的雜 交后代。
[0020] -種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該 試劑盒包含如下（1)或（2)所示的成套DNA分子：
[0021] (1) SEQ ID No. 1 所示的 DNA 分子和 SEQ ID No. 2 所示的 DNA 分子；
[0022] (2) SEQ ID No. 3 所示的 DNA 分子和 SEQ ID No. 4 所示的 DNA 分子；
[0023] 所述SEQ ID No. 1所示的DNA分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子獨(dú)立包裝；
[0024] 所述SEQ ID No. 3所示的DNA分子和SEQ ID No. 4所示的DNA分子獨(dú)立包裝；
[0025] 該試劑盒用于擴(kuò)增IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列；
[0026] 該試劑盒還含有記載在可讀載體上的使用說(shuō)明，說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容為上述任一所述的 方法。
[0027] 上述試劑盒中，所述植物為蘋(píng)果屬植物；
[0028] 所述蘋(píng)果屬植物具體為小金海棠、山定子、M9或三者之間的雜交后代。
[0029] 本發(fā)明所提供的IRT1啟動(dòng)子上的元件TATA-box的缺失和存在對(duì)于缺鐵脅迫的植 株來(lái)說(shuō)有很重要的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)小金海棠和山定子，小金海棠和M9后代 IRT1啟動(dòng)子上的元件TATA-box的分離情況，并結(jié)合各后代的黃化表型可以發(fā)現(xiàn)IRT1的啟 動(dòng)子上的TATA-box的插入與耐缺鐵性狀相關(guān)，而TATA-box的缺失減弱其耐缺鐵能力。
[0030] 利用本發(fā)明所提供的IRT1啟動(dòng)子上的元件TATA-box的缺失和存在可以快速的篩 選后代中的耐缺鐵植株。本發(fā)明在植物的耐缺鐵領(lǐng)域中具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為IRT1基因在蘋(píng)果基因組上的位置示意圖。
[0032] 圖2為IRT1啟動(dòng)子插入或缺失片段序列比對(duì)。
[0033] 圖3為IRT1啟動(dòng)子插入或缺失片段功能預(yù)測(cè)結(jié)果。
[0034] 圖4為IRT1編碼區(qū)cDNA序列比對(duì)。
[0035] 圖5為IRT1編碼區(qū)氨基酸序列比對(duì)。
[0036] 圖6為IRT1啟動(dòng)子插入或缺失片段與編碼區(qū)氨基酸突變連鎖示意圖。
[0037] 圖7為毛細(xì)管電泳預(yù)實(shí)驗(yàn)。
[0038] 圖8為測(cè)序驗(yàn)證毛細(xì)管電泳結(jié)果。
[0039] 圖9為毛細(xì)管電泳分析蘋(píng)果后代中TATA-box的分離情況。
[0040] 圖10為蘋(píng)果雜交后代缺鐵條件下葉片黃化情況調(diào)查。
【具體實(shí)施方式】
[0041 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 小金海棠 （Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)在文獻(xiàn)"成明昊，李曉林，張?jiān)?貴。蘋(píng)果優(yōu)良砧木資源-小金海棠，西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000年10月，22 (5) :383-386"中 公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0044] 山定子（Malus baccata Borkh)在文獻(xiàn)"張凌云，翟衡，張憲法.蘋(píng)果站木鐵高效 基因型篩選，2002,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，35(1) :68-71"中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0045] M9在文獻(xiàn)"余亮，王飛.蘋(píng)果砧木M9快繁技術(shù)的建立及試管苗生根進(jìn)程解剖研 究，西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2013,28(4) :106-110"中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0046] 實(shí)施例1、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1啟動(dòng)子缺失元件的獲得
[0047] 一、IRT1啟動(dòng)子及編碼區(qū)序列分析
[0048] 在蘋(píng)果基因組中對(duì)IRT1進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)蘋(píng)果基因組中存在兩個(gè)⑶S相似度 為100%的IRT1基因，它們均位于第5號(hào)染色體上，相距36735bp，如圖1所示。圖1表明， IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列的基本結(jié)構(gòu)包括三個(gè)外顯子（圖1中的深色的實(shí)心框）和 兩個(gè)內(nèi)含子（圖1中連接深色實(shí)心框的黑色線），為了便于描述基因結(jié)構(gòu)，下述實(shí)施例中將 IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列中IRT1基因起始密碼子ATG中的A的位置記作為+1，-代 表1RT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列中IRT1基因起始密碼子ATG的5'方向，+代表1RT1蛋 白質(zhì)的基因組基因序列中IRT1基因起始密碼子ATG的3'方向。
[0049] 二、提取小金海棠的基因組DNA，以其為模板，以F1和R1為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0050] F1 :5，-GCAGCTGCCAACCTCAATCC-3'，（SEQ ID No. 1)
[0051] R1 :5，-CGACCGGCTTGACACCAAAA-3，。（SEQ ID No. 2)
[0052] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列和部分啟動(dòng)子（長(zhǎng)度為2302bp): 5' -578bp+IRT(3Extron+2Intron) 1637bp+87bp-3' 〇
[0053] 三、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，存在差異的序列比對(duì)結(jié)果 如圖2所示。
[0054] 圖2表明，小金海棠基因組DNA上在IRT1基因啟動(dòng)子即ATG上游的-363~-357 位置（或步驟二的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第216位至第222位）存在一段差異 片段V -ATTATAA-3'。該插入片段在plantcare啟動(dòng)子功能預(yù)測(cè)網(wǎng)站：(http:// bioinformatics· psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖 3 所不。 圖3表明，該段序列為一個(gè)TATA-box，此TATA-box通常位于轉(zhuǎn)錄起始的-30bp左右，是IRT1 啟動(dòng)子核心元件。
[0055] 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的編碼區(qū)進(jìn)行分析，該區(qū)段包括擴(kuò)增產(chǎn)物中IRT1基因的起始密碼 子ATG到終止密碼子TAA之間所有外顯子部分，共1095bp。IRT1編碼區(qū)cDNA序列比對(duì)結(jié) 果如圖4所示。
[0056] 圖4表明，IRT1編碼區(qū)有四個(gè)位點(diǎn)堿基突變會(huì)造成有義突變： +96, +447, +489, +513 (以起始密碼子ATG中的A位置記為+1，5'其方向?yàn)?，3'方向?yàn)?)。
[0057] IRT1編碼區(qū)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖5所示。
[0058] 圖5表明，IRT1編碼區(qū)氨基酸比對(duì)結(jié)果有義突變位置：+32，+149，+163，+171(IRTl 蛋白N端第一個(gè)氨基酸Μ的位置記為+1)。與之前啟動(dòng)子區(qū)域的TATA-box突變位點(diǎn)進(jìn)行比 對(duì)發(fā)現(xiàn)其中有一處氨基酸的突變與TATA-box的缺失緊密連鎖，如圖6所示。
[0059] 圖6表明，TATA-box ( 即IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列中ATG上游的第-363位 至第-357位的Y -ATTATAA-3'，或步驟二的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第216位至第222 位的Y -ATTATAA-3')缺失時(shí)，該基因的編碼區(qū)序列+96位置的堿基為G，IRT1蛋白的氨 基酸序列自N端起第32位的氨基酸為E (谷氨酸），TATA-box (即IRT1基因組DNA序列中 ATG上游的第-363位至第-357位的Y -ATTATAA-3'，或步驟二的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末 端起第216位至第222位的Y -ATTATAA-3')存在時(shí)，該基因的編碼區(qū)序列+96位置的 堿基為T(mén)，IRT1蛋白的氨基酸序列自N端起32位的氨基酸為D (天冬氨酸）。
[0060] 實(shí)施例2、毛細(xì)管電泳分析蘋(píng)果雜交后代中TATA-box的分離情況
[0061] -、以小金海棠為母本，山定子為父本進(jìn)行雜交，以小金海棠為母本，M9為父本進(jìn) 行雜交，將小金海棠 XM9和小金海棠 X山定子的F1代雜交后代具有黃化差異的植株，分 別采集這些植株的葉片，提取基因組DNA。
[0062] 二、設(shè)計(jì)并合成如下引物：
[0063] IRT1-F -.5' -AAGCCACCGGAGGACATGG-3，，（SEQ ID No. 3)
[0064] IRT1-R :5' -GGGCTATGATTTTGAGGGGCA-3，。（SEQ ID No. 4)
[0065] 對(duì)IRT1-F在5'端加上FAM熒光標(biāo)記，最終得到熒光標(biāo)記的IRT1-F。
[0066] 三、以步驟一得到的各基因組DNA為模板，以熒光標(biāo)記的IRT1-F和IRT1-R為引 物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0067] PCR 擴(kuò)增體系（15μ1):
[0068] 表 1
[0069] PCR反應(yīng)組分每個(gè)體系加入量
[0070]
[0071] PCR反應(yīng)程序：
[0072] 表 2
[0073]
[0074] 四、將各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3730XL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳及檢測(cè)，將檢測(cè)得到的原 始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到分析軟件中進(jìn)行分析。
[0075] 先隨機(jī)抽取4個(gè)樣品（小金海棠 X山定子F1代2個(gè)，小金海棠 XM9F1代2 個(gè)）進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示，圖7表明，各個(gè)抽取的樣品在717. 05(717bp)和 727. 24(727bp)兩個(gè)位置中出現(xiàn)明顯的峰，說(shuō)明同一樣品中用同一對(duì)引物可以擴(kuò)增出兩條 帶，其長(zhǎng)度差值為10個(gè)堿基。
[0076] 五、基因克隆測(cè)序驗(yàn)證毛細(xì)管電泳結(jié)果的可靠性
[0077] 將步驟四的4個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖8所示。圖8表明，測(cè)序得到的兩 條序列的長(zhǎng)度差值與熒光檢測(cè)的結(jié)果相同，由于5' -ATTATAA-3'與上游5' -TTG-3'（位置 為-376~-374)緊密連鎖共10bp，所以?xún)煞N擴(kuò)增條帶的差值為10bp，說(shuō)明該方法可以成功 鑒定雜合的情況。
[0078] 六、對(duì)蘋(píng)果雜交后代（小金海棠 X山定子F1代63個(gè)，小金海棠 XM9F1代33個(gè)） 進(jìn)行步驟三的PCR擴(kuò)增以及步驟四的毛細(xì)管電泳分析，結(jié)果如圖9所示。圖9表明，絕大部 分樣本在717. 05和727. 24兩個(gè)位置中出現(xiàn)明顯的峰，說(shuō)明在絕大部分F1代的IRT1蛋白 質(zhì)的基因組基因序列中啟動(dòng)子TATA-box(即5' -ATTATAA-3'）的雜合體。但其中也鑒定 出5個(gè)單峰株系，分別為：株系號(hào)為37-007的小金海棠 X山定子F1代，該株系為727單峰 (IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列中啟動(dòng)子TATA-box(即5'-ATTATAA-3'）插入）；株系號(hào)分 別為2-048, 3-250, 3-248,1-063的小金海棠 XM9雜交F1代，這些株系均為717單峰（IRT1 蛋白質(zhì)的基因組基因序列中啟動(dòng)子TATA-box (即5' -ATTATAA-3'）缺失）。
[0079] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖8所示。由于5' -ATTATAA-3'（位置 為-363~-357)與上游5'-TTG-3'（位置為-376~-374)緊密連鎖共10bp，所以?xún)煞N擴(kuò)增 條帶（727單峰和717單峰）的差值為10bp，只具有727單峰表明所檢測(cè)的植物為IRT1蛋 白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均具有Y -ATTATAA-3'序列的植物，只具有717單峰 表明所檢測(cè)的植物為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域不具有Y -ATTATAA-3' 序列的待測(cè)植物。
[0080] 5' -ATTATAA-3'位于-363~-357位置，-363~-357位置為IRT1蛋白質(zhì)的基因 組基因序列中IRT1基因起始密碼子ATG的5'上游方向第-363位至第-357位，以IRT1基 因起始密碼子ATG中的A為第+1位。
[0081] 七、蘋(píng)果雜交后代缺鐵條件下葉片黃化情況調(diào)查
[0082] 為了推測(cè)IRT1啟動(dòng)子TATA-box缺失與蘋(píng)果耐缺鐵性狀的關(guān)系，在缺鐵條件下進(jìn) 行葉片黃化情況調(diào)查，方法如下：
[0083] 于2013年3月，將小金海棠 X山定子、小金海棠 XM9雜交F1代扦插擴(kuò)繁，每個(gè) 株系選取生長(zhǎng)一致的三棵扦插苗，移栽于河沙基質(zhì)栽培槽中，正常供鐵時(shí)濃度為40 μ M，低 鐵處理時(shí)為4 μ Μ。低鐵處理12天后觀察幼葉黃化情況，拍照記錄，并提取基因組DNA進(jìn)行 步驟三的PCR擴(kuò)增以及步驟四的毛細(xì)管電泳分析。
[0084] 結(jié)果如圖10所示。
[0085] 圖10中，37-007只具有727單峰（727單峰表明所檢測(cè)的植物為IRT1蛋白質(zhì)的 基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均具有Υ -ΑΤΤΑΤΑΑ-3 ^序列的植物），該株系表現(xiàn)為耐缺鐵， 2-048, 3-250, 3-248,1-063只具有717單峰（717單峰表明所檢測(cè)的植物為IRT1蛋白質(zhì)的 基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域不具有5' -ATTATAA-3'序列的植物），該株系表現(xiàn)為不耐缺 鐵。結(jié)果表明，IRT1基因組基因序列中啟動(dòng)子區(qū)域的TATA-box (即5' -ATTATAA-3'）的插 入與耐缺鐵性狀相關(guān)，而TATA-box的缺失減弱其耐缺鐵能力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的方法，包括檢測(cè)待測(cè)植物的IRT1蛋白 質(zhì)的基因組基因序列，IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均具有Y -ATTATAA-3' 序列的待測(cè)植物的耐缺鐵能力大于或候選大于IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域 均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待測(cè)植物的耐缺鐵能力。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列 啟動(dòng)子區(qū)域均具有Y -ATTATAA-3'序列的待測(cè)植物為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列 的-363~-357位置均為Y -ATTATAA-3'序列的待測(cè)植物； 所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待 測(cè)植物為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列的-363~-357位置均不為Y -ATTATAA-3'序 列的待測(cè)植物； 所述-363~-357位置為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列中IRT1基因起始密碼子ATG 的5'上游方向第-363位至第-357位，以IRT1基因起始密碼子ATG中的A為第+1位。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列 啟動(dòng)子區(qū)域均具有Y -ATTATAA-3'序列的待測(cè)植物的鑒定方法如下：以待測(cè)植物的基因 組DNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第216位至第222位均為Y -ATTATAA-3'， 則待測(cè)植物為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均具有Y -ATTATAA-3'序列的 待測(cè)植物； 所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列啟動(dòng)子區(qū)域均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待 測(cè)植物的鑒定方法如下：以待測(cè)植物的基因組DNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 所示的引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起 第216位至第222位均不為Y -ATTATAA-3'，則待測(cè)植物為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序 列啟動(dòng)子區(qū)域均不具有Y -ATTATAA-3'序列的待測(cè)植物。4. 一種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的方法，包括檢測(cè)待測(cè)植物的IRT1蛋白 質(zhì)的基因組基因序列，IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列具有純合Y -TTG-3'序列的待測(cè)植 物的耐缺鐵能力大于或候選大于IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列不具有5' -TTG-3'序列 的待測(cè)植物的耐缺鐵能力； 所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列具有純合Y -TTG-3'序列的待測(cè)植物為IRT1蛋 白質(zhì)的基因組基因序列的-376~-374位置均為Y -TTG-3^序列的待測(cè)植物； 所述IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列不具有Y -TTG-3'序列的待測(cè)植物為IRT1蛋白 質(zhì)的基因組基因序列的-376~-374位置均不為Y -TTG-3^序列的待測(cè)植物； 所述-376~-374位置為IRT1蛋白質(zhì)的基因組基因序列中IRT1基因起始密碼子ATG 的5'上游方向第-376位至第-374位，以IRT1基因起始密碼子ATG中的A為第+1位。5. -種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的方法，包括檢測(cè)待測(cè)植物的IRT1蛋白 的氨基酸序列，IRT1蛋白自N端起第32位氨基酸為天冬氨酸的待測(cè)植物的耐缺鐵能力大 于或候選大于IRT1蛋白自N端起第32位氨基酸為谷氨酸的待測(cè)植物的耐缺鐵能力。6. -種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的方法，包括如下步驟：提取待測(cè)植物的 基因組DNA，以其為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的DNA分子為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度均為727bp的待測(cè)植物的耐缺鐵能力大于或 候選大于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度均為717bp的待測(cè)植物的耐缺鐵能力。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述植物為蘋(píng)果屬植物。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述蘋(píng)果屬植物為小金海棠、山定 子、M9或三者之間的雜交后代。9. 一種鑒定或輔助鑒定植物耐缺鐵能力大小的試劑盒，該試劑盒包含如下（1)或（2) 所示的成套DNA分子： (1) SEQ ID No. 1所示的DNA分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子； (2) SEQ ID No. 3所示的DNA分子和SEQ ID No. 4所示的DNA分子。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于：所述植物為蘋(píng)果屬植物； 所述蘋(píng)果屬植物具體為小金海棠、山定子、M9或三者之間的雜交后代。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105838776SQ201510016288
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2015年1月13日
【發(fā)明人】吳婷, 張美玲, 韓振海, 張新忠, 王憶, 許雪峰
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)