一種快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法
【專利摘要】一種快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，將甲酚紅、氯化鉀和碳酸氫鈉溶于無二氧化碳水配置成溶液，然后加入瓊脂得到混合顯色劑；把葡萄糖溶于無二氧化碳水中制成有機碳源母液；將土壤污染物質(zhì)標準品溶于無二氧化碳水中制備母液按稀釋梯度進行稀釋；將混合顯色劑在無菌工作臺內(nèi)加入孔微平板每個孔內(nèi)，制成檢測板，通風干燥后于4℃保存；將制備的有機碳源和污染物質(zhì)母液分別加入另一個微平板孔內(nèi)，制成反應(yīng)板；在反應(yīng)板中每孔加入0.35g土壤，將檢測板緊扣反應(yīng)板上，25℃條件下培養(yǎng)6h，將檢測板取下在酶標儀上讀取吸光值；采用本發(fā)明方法制備的土壤生態(tài)毒性測試板具有使用方便、快速、測試結(jié)果準確等特性。
【專利說明】
一種快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于毒性檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]長期以來，土壤面臨著各種污染物的威脅。土壤微生物作為土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要驅(qū)動者，在維持土壤養(yǎng)分循環(huán)、污染物分解等方面具有不可替代的作用。可以說，土壤微生物在一定程度上指示了土壤乃至整個生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況。長期以來人們多采用反映群落功能、活性和數(shù)量的指標，例如群落多樣性、酶活性、生物量，以及針對不同功能菌群采用的功能指標如硝化勢等，并以這些指標在數(shù)量上的大小變化來評價污染的生態(tài)學(xué)效應(yīng)和污染程度。事實上這些指標不能全面反映污染物對土壤微生物的生態(tài)影響。
[0003]微平板法是一種在微平板上通過污染物質(zhì)對土壤呼吸所產(chǎn)生CO2的變化來評價污染物質(zhì)對土壤的生態(tài)毒性的方法。目前對于微平板法最常用方法有兩類，一是基于土壤菌液的檢驗法，主要方法為B1log ECO微平板法。雖然該方法操作比較簡單，但是由于該方法基于土壤菌液，所以該方法僅適用于檢驗土壤中污染物對細菌的影響，存在一定的局限性，且該方法至少需要培養(yǎng)7天對整體結(jié)果會產(chǎn)生一定的影響。二是基于原始土壤的檢驗法，該方法主要是通過檢測土壤呼吸作用產(chǎn)生的CO2的量的變化來反映污染物對土壤微生物的生態(tài)毒性。需采用氣相色譜進行測定，對于實際應(yīng)用來說不夠經(jīng)濟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，能夠降低污染土壤樣品在生態(tài)毒性檢測過程中的誤差、減少測試時間和經(jīng)濟成本、擴大測試范圍、更加準確的評價污染物質(zhì)對土壤的真實毒性，具有很大的科學(xué)和應(yīng)用價值。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]I)配制混合顯色劑:
[0007]將甲酚紅、氯化鉀和碳酸氫鈉溶于無二氧化碳水配置成溶液，然后加入瓊脂得到混合顯色劑;每升無二氧化碳水中使用:甲酸紅18.75mg、氯化鉀16.77g、碳酸氫鈉0.315g和瓊脂30g。
[0008]2)把葡萄糖(D-glucose)溶于無二氧化碳水中，從而制成有機碳源母液，其濃度為30mg.C.mL—1 ；
[0009]3)將土壤污染物質(zhì)標準品溶于無二氧化碳水中制備母液，按0.5X的稀釋梯度進行稀釋；
[0010]4)將I)中所制備的混合顯色劑在無菌工作臺內(nèi)利用多孔移液器添加到經(jīng)過高溫滅菌的孔微平板內(nèi)，制成檢測板，通風干燥后于4°C保存。
[0011]5)將2)3)所制備的有機碳源和污染物質(zhì)母液分別用自動移液器轉(zhuǎn)移至另一個經(jīng)過高溫滅菌的孔微平板內(nèi)，制成反應(yīng)板。
[0012]6)在5)所制備的反應(yīng)板中每孔加入0.35g 土壤(干重)。
[0013]7)將4)中制備的檢測板緊密的扣在6)中制備的反應(yīng)板上，在25°C條件下培養(yǎng)6h，將檢測板取下在酶標儀上讀取吸光值。
[0014]所述步驟3)中，根據(jù)被測土壤的主要污染物，選擇污染物種類。
[0015]所述步驟4)中，混合顯色劑每次加入量為150yL。
[0016]所述步驟5)中，有機碳源母液先加入且加入量為25yL，污染物質(zhì)母液加入量為25μ
L0
[0017]所述微平板為96孔微平板。
[0018]酶標儀讀取吸光值時波長為590nm。
[0019]根據(jù)所述劑量-反應(yīng)關(guān)系，計算出污染物對微生物的EC50。具體地，將得到的濃度效應(yīng)數(shù)據(jù)用origin軟件進行模擬，方程的表達式如下:
[0020]y=Al+(A2_Al)/(l+10((logEC50—log x)Xslpoe))0
[0021]式中，A1和A2分別為檢測板培養(yǎng)6h后最小吸光值和最大吸光值，X為反應(yīng)板中進入污染物的濃度，s Ipose為擬合曲線的斜率。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0023]1、本發(fā)明利用原位土壤檢測法實現(xiàn)對污染土壤中污染物質(zhì)對細菌、真菌、放線菌生態(tài)毒性的同時進行檢測，較之于傳統(tǒng)使用土壤懸濁液只能檢測污染物對細菌的生態(tài)毒性能更加全面客觀地反映污染物對土壤中微生物的生態(tài)毒性。
[0024]2、本發(fā)明檢測土壤樣品中污染物的生態(tài)毒性快速、靈敏，相比較傳統(tǒng)使用B1log微平板法需要培養(yǎng)144h-168h，本發(fā)明只需25 V培養(yǎng)6h。并且對于土壤微生物而言培養(yǎng)時間亦可影響其檢測結(jié)果，本發(fā)明縮短了土壤微生物的培養(yǎng)時間，從而降低了檢測結(jié)果的誤差，更加客觀地反映污染物對土壤微生物的真實生態(tài)毒性。
[0025]3、本發(fā)明檢測土壤樣品中污染物的生態(tài)毒性更加經(jīng)濟，減少成本開支。從測試成本考慮避免了采用傳統(tǒng)方法中昂貴的B1log微平板，節(jié)約了成本開支;從測定方法考慮本發(fā)明所采用的測定方法僅需要可以測定96孔的酶標儀，避免了傳統(tǒng)方法中使用GC-MS測定CO2環(huán)節(jié)，節(jié)省了高額的測試費用。
【附圖說明】
[0026]圖1是本發(fā)明所用的孔微平板結(jié)構(gòu)示意圖，為96孔，體積為2ml，分為A、B兩板，其中A板為加入顯色劑的顯色板。B板1-12列為12個稀釋梯度，A-H行為12個稀釋梯度的8個平行。
[0027]圖2是本發(fā)明檢測板與反應(yīng)板緊扣在一起的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0028]圖3為B1log微平板測試結(jié)果。
[0029]圖4為本發(fā)明測試結(jié)果。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖和實施例詳細說明本發(fā)明的實施方式。
[0031]實施例1
[0032]一種快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，選取常年施用含Cu污泥土壤(A)及撂荒土壤(B)進行對比來確定本發(fā)明的可行性。再依次進行以下步驟:
[0033]I)配制混合顯色劑:
[0034]將甲酚紅18.75mg、氯化鉀16.77g、碳酸氫鈉0.315g溶于IL無二氧化碳水配置成溶液，然后加入30g瓊脂得到混合顯色劑；
[0035]2)將上述所制備的混合顯色劑在無菌工作臺內(nèi)利用多孔移液器添加到經(jīng)過高溫滅菌的96孔微平板內(nèi)，制成檢測板，通風干燥后于4°C保存。96孔微平板的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0036]3)把葡萄糖(D-glucose)溶于無二氧化碳水中，從而制成有機碳源母液，其濃度為
3Omg.C.mL—1 ；
[0037]4)將土壤污染物質(zhì)重金屬Cu (C11SO4)溶于無二氧化碳水中制備最大濃度為6000mg/L母液，按0.5 X的稀釋設(shè)置12個梯度進行稀釋，且每個濃度設(shè)置八個平行；
[0038]5)將3)4)所制備的有機碳源和污染物質(zhì)母液分別用自動移液器轉(zhuǎn)移25uL至另一個經(jīng)過高溫滅菌的孔微平板內(nèi)，制成反應(yīng)板。
[0039]6)在5)所制備的反應(yīng)板中每孔加入0.35g 土壤(干重)。
[0040]7)將4)中制備的檢測板I緊扣在6)中制備的反應(yīng)板2上，如圖2所示，圖中，混合顯色劑3位于檢測板I的孔中，反應(yīng)板2的孔中為土壤、污染物和有機碳源的混合物4。然后在25°C條件下培養(yǎng)6h，將檢測板取下在酶標儀上讀取吸光值。
[0041]為了證明本發(fā)明的優(yōu)點，分別采用制作的檢測板與B1logECO微平板對上述土壤進行對比試驗:
[0042]速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板培養(yǎng)6h后進行檢測，B1logECO微平板培養(yǎng)144h后進行檢測。培養(yǎng)后選取9個梯度結(jié)果擬合污染物劑量一效應(yīng)關(guān)系曲線，如圖3和圖4所示。
[0043]結(jié)果表明，應(yīng)用B1log ECO微平板(圖3)檢測兩種土壤的半數(shù)效應(yīng)濃度無明顯差異，而應(yīng)用本發(fā)明的生態(tài)毒性測試板(圖4)結(jié)果產(chǎn)生明顯差異。可以看出本發(fā)明的生態(tài)毒性測試板與B1log ECO板相比，檢測快速且結(jié)果更加可靠。
[0044]實施例2
[0045]—種快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，依次進行以下步驟:
[0046]I)配制混合顯色劑:
[0047]將甲酚紅18.75mg、氯化鉀16.77g、碳酸氫鈉0.315g溶于IL無二氧化碳水配置成溶液，然后加入30g瓊脂得到混合顯色劑；
[0048]2)將上述所制備的混合顯色劑在無菌工作臺內(nèi)利用多孔移液器添加到經(jīng)過高溫滅菌的96孔微平板內(nèi)，制成檢測板，通風干燥后于4°C保存。
[0049]3)把葡萄糖(D-glucose)溶于無二氧化碳水中，從而制成有機碳源母液，其濃度為3Omg.C/mL；
[0050]4)將土壤污染物質(zhì)重金屬Cu (C11SO4)溶于無二氧化碳水中制備最大濃度為6000mg/L母液，按0.5 X的稀釋設(shè)置12個梯度進行稀釋；
[0051]5)將3)4)所制備的有機碳源和污染物質(zhì)母液分別用自動移液器轉(zhuǎn)移25uL至另一個經(jīng)過高溫滅菌的孔微平板內(nèi)，制成反應(yīng)板。
[0052]6)在5)所制備的反應(yīng)板中每孔加入0.35g 土壤(干重)。
[0053]7)將4)中制備的檢測板緊密的扣在6)中制備的反應(yīng)板上，在25°C條件下培養(yǎng)6h，將檢測板取下在酶標儀上讀取吸光值。
[0054]為了證明本發(fā)明的優(yōu)點分別采用已制作的生態(tài)毒性測試板與傳統(tǒng)采用GC-MS測定土壤呼吸CO2的方法進行對比，結(jié)果表明兩種方法所得土壤樣本半數(shù)效應(yīng)濃度差異較小，可以看出本發(fā)明可以節(jié)省測試成本、簡化復(fù)雜的測試方法并且所得結(jié)果可靠。
【主權(quán)項】
1.一種快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)配制混合顯色劑: 將甲酚紅、氯化鉀和碳酸氫鈉溶于無二氧化碳水配置成溶液，然后加入瓊脂得到混合顯色劑； 2)把葡萄糖(D-glucose)溶于無二氧化碳水中制成有機碳源母液； 3)將土壤污染物質(zhì)標準品溶于無二氧化碳水中制備污染物質(zhì)母液并進行稀釋； 4)將步驟I)所制備的混合顯色劑在無菌工作臺內(nèi)利用多孔移液器添加到經(jīng)過高溫滅菌的孔微平板內(nèi)，制成檢測板，通風干燥后于4°C保存； 5)將步驟2)制備的有機碳源母液和步驟3)制備的污染物質(zhì)母液分別用移液器轉(zhuǎn)移至另一個經(jīng)過高溫滅菌的孔微平板內(nèi)，制成反應(yīng)板； 6)以干重計，在步驟5)制備的反應(yīng)板中每孔加入0.35g土壤； 7)將步驟4)制備的檢測板緊扣在步驟6)得到的反應(yīng)板上，在25°C條件下培養(yǎng)6h，將檢測板取下在酶標儀上讀取吸光值； 8)采用線性模型擬合法，建立污染物不同濃度與吸光值的劑量-反應(yīng)關(guān)系。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中，每升無二氧化碳水中使用:甲酸紅18.75mg、氯化鉀16.77g、碳酸氫鈉0.315g和瓊脂30g。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，有機碳源母液中葡萄糖濃度為30mg.C/mLo4.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中，按0.5 X的稀釋梯度進行稀釋。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中，根據(jù)被測土壤的主要污染物，選擇污染物種類。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中，混合顯色劑每次加入量為150yL。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，其特征在于，所述步驟5)中，有機碳源母液先加入且加入量為25yL，污染物質(zhì)母液加入量為25yL。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，其特征在于，所述微平板為96孔微平板。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢驗污染土壤生態(tài)毒性測試板的制備方法，其特征在于，酶標儀讀取吸光值時波長為590nmo
【文檔編號】C12Q1/02GK105838773SQ201610162440
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月22日
【發(fā)明人】殷亞楠, 宋雯, 谷潔, 張凱煜, 張雅君, 高華, 王小娟
【申請人】西北農(nóng)林科技大學(xué), 陜西佰特綠源環(huán)境修復(fù)科技有限公司