一種氧化微桿菌發(fā)酵二醇組人參皂苷制備稀有人參皂苷ck的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種氧化微桿菌發(fā)酵二醇組人參皂苷制備稀有人參皂苷CK的方法，具體涉及一種利用微生物菌株在全自動發(fā)酵罐中發(fā)酵轉(zhuǎn)化二醇組人參皂苷Rb1、Rd等，制備20?O?β?D?吡喃葡萄糖基?20?二醇組人參皂苷的方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，其步驟是：（1）菌株的發(fā)酵培養(yǎng)；（2）以Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸HxYW12O40·nH2O為催化劑，其中Y選自P、Si、Fe或Zn，x為3或4，n為0?30的正整數(shù)，利用發(fā)酵的微生物對原料Rb1、Rd等的轉(zhuǎn)化；（3）制備型色譜分離純化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，最終獲得化學(xué)名為20?0?β?D?吡喃葡萄糖基?20?二醇組人參皂苷的化合物。
【專利說明】
一種氧化微桿菌發(fā)酵二醇組人參皂苷制備稀有人參皂苷CK的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種氧化微桿菌發(fā)酵二醇組人參皂苷制備稀有人參皂苷CK的方法，具體涉及一種氧化微桿菌能特異性催化二醇型皂苷，轉(zhuǎn)化生成20-0-13-D-吡喃葡萄糖基-20-二醇組人參皂苷的方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]近年來，由于人參中含有生物活性的皂苷成分，其被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。目前多種具有活性的皂苷被發(fā)現(xiàn)并已用于治療和預(yù)防疾病中，例如抗皮膚老化、抗腫瘤、抗炎癥、保護心肌等療效。大部分皂苷是由二醇組人參皂苷(Rbl、Rb2、Rc、Rd)及原人參三醇(Re、Rgl)組成，總含量在皂苷中占80%以上，據(jù)報道這些占主要比例的皂苷在體內(nèi)的生物利用度很低(Rbl，0.1-4.4%;Rb2，3.7%;Rgl，1.9-18.4%)，并且發(fā)現(xiàn)皂苷的生物活性與糖苷鏈密切相關(guān)，通過修飾皂苷中的糖苷鏈可以顯著地改變其生物活性。
[0003]研究表明，人體內(nèi)的腸道微生物能代謝口服的皂苷，生成高生物活性并能被人體吸收的稀有去糖皂苷。例如二醇組人參皂苷包括Rbl、Rb2、Rc被腸道微生物代謝可生成CK，屬于原人參三醇的皂苷Rgl、Re可被消化代謝生成Rhl、Fl等稀有皂苷。但是這些腸道微生物大部分都是厭氧菌，在外界的培養(yǎng)條件比較苛刻并產(chǎn)率不高，因此尋找一種高效的、易于培養(yǎng)發(fā)酵、成本低的菌株用來轉(zhuǎn)化水解糖鏈制備稀有人參皂苷具有重要應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種氧化微桿菌發(fā)酵二醇組人參皂苷制備稀有人參皂苷CK的方法，具體是一種氧化微桿菌能特異性催化二醇型皂苷，轉(zhuǎn)化生成20-0-13_D-吡喃葡萄糖基-20-二醇組人參皂苷(稀有人參皂苷CK)的方法，這種氧化微桿菌保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCC AB 205576。
[0005]本發(fā)明的具體實現(xiàn)過程如下:
一種氧化微桿菌發(fā)酵二醇組人參皂苷制備稀有人參皂苷CK的方法，包含如下步驟:
(1)將氧化微桿菌從固體培養(yǎng)基接種至微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，并將其置于發(fā)酵罐中發(fā)酵；
(2)將二醇組人參皂苷皂苷溶于有機水溶液中配成濃度為50-200g/L的皂苷溶液投入到步驟(I)中發(fā)酵好的微生物培養(yǎng)物種，并添加催化量的Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸HxYWi2O40.ηΗ2θ催化劑，其中Y選自P、S1、Fe或Zn，x為3或4，n為0_30的正整數(shù)，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)；
(3)步驟(2)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)離心、洗滌、萃取，并用半制備色譜柱進行分離純化得到純度在93%以上的目標產(chǎn)物。
[0006]上述方法，具體包括如下步驟:
(I)微生物的培養(yǎng):將氧化微桿菌從固體培養(yǎng)基接種至微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵罐中，121°(:，201^11在線滅菌，微生物培養(yǎng)溫度25-40°(:，通氣比例0.1-10%￥八，攪拌速率為100-360rpm/min，發(fā)酵時間 36-120h ；
(2)CK的轉(zhuǎn)化制備:將二醇組人參皂苷皂苷溶于10-90%的有機水溶液中，配成濃度為50-200g/L的皂苷溶液2-6L投入到步驟(I)中發(fā)酵好的微生物培養(yǎng)物種，并添加催化量的Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化劑，其中Y選自P、S1、FeSZn，xS3S4，r^0_3(^正整數(shù)，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)，攪拌速率為100-300rpm，反應(yīng)溫度為25-50°C，維持24-96h；
(3 )反應(yīng)產(chǎn)物CK的收集與純化:將步驟(2 )的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物離心，沉淀用去離子水清洗數(shù)次，加入水:有機溶劑體積比為I: 4?3: 2的有機水溶液進行萃取分離，合并有機相萃取液，減壓蒸餾濃縮到原體積的1/15?1/30，用半制備色譜柱進行分離純化，得到純度在93%以上的目標產(chǎn)物。
[0007]上述的氧化微桿菌保藏編號為CCTCC AB 205576。
[0008]上述微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖2-40g/L，蛋白胨10-30g/L，牛肉膏l(xiāng)_25g/L。
[0009]上述步驟(2)和(3)中所述的有機水溶液中有機溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯。
[0010]上述方法制備的目標產(chǎn)物可以采用工業(yè)化色譜柱對目標產(chǎn)物精制純化。
[0011]利用上述方法制備的稀有人參皂苷CK作為原料藥制成硬膠囊、軟膠囊、片劑、沖劑、滴丸或注射劑。
[0012]這種氧化微桿菌發(fā)酵二醇組人參皂苷制備稀有人參皂苷CK的方法:
(1)微生物的培養(yǎng):將氧化微桿菌(CCTCCAB 205576)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配置好的50-300L微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖2-40g/L，蛋白胨10_30g/L，牛肉膏l(xiāng)_25g/L;置于發(fā)酵罐中，在線滅菌(121°C，20min)，微生物培養(yǎng)溫度25-40°C，通氣比例 0.1-10%(v/v)攪拌速率為 100-360rpm/min，發(fā)酵時間 36-120h;
(2)CK的轉(zhuǎn)化制備:將二醇組人參皂苷皂苷溶于10-90%的有機水溶液中(有機相可為甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等)配成濃度為50-200g/L的皂苷溶液2-6L，投入到上述發(fā)酵好的微生物培養(yǎng)物種，并添加催化量的Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化劑，其中Y選自P、S1、Fe或Zn，x為3或4，n為0-30的正整數(shù)，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)。攪拌速率為100-300rpm，反應(yīng)溫度為25-50 V，維持24_96h ；
(3)反應(yīng)產(chǎn)物CK的收集與純化:將上述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物離心，棄上清。沉淀用去離子水清洗數(shù)次，加入水:有機溶劑為1:4?3: 2(體積比)混合液進行萃取分離，合并有機相萃取液，減壓蒸餾濃縮到原體積的1/15?1/30。用半制備色譜柱進行分離純化。其產(chǎn)率為80%以上，純度93%以上。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點:本發(fā)明綜合使用有機酸和雜多酸催化劑，催化效果得到大大提升；本發(fā)明涉及的氧化微桿菌是一種易于在外界培養(yǎng)，并能代謝產(chǎn)出糖苷酶的菌株，利用大規(guī)模發(fā)酵氧化微桿菌并催化二醇組人參皂苷Rbl、Rd等定向生產(chǎn)CK在國內(nèi)外還尚未報道。
【附圖說明】
[0014]圖1為人參皂苷Rbl轉(zhuǎn)化為人參皂苷CK的示意圖；
圖2為人參皂苷CK標準品液相色譜圖；
圖3為本發(fā)明生產(chǎn)得到的人參皂苷CK純化后液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0016]實施例1
(1)微生物的培養(yǎng):將氧化微桿菌(CCTCCAB 205576)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配置好的200L微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖10g/L，蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L;置于發(fā)酵罐中，在線滅菌(121°C，20min)，微生物培養(yǎng)溫度30°C，通氣比例5%(v/v)攪拌速率為200rpm/min，發(fā)酵時間48h ；
(2)CK的轉(zhuǎn)化制備:將純度90%二醇組人參皂苷皂苷Rbl溶于50%的甲醇溶液中，配成6L濃度為100g/L皂苷溶液投入到上述發(fā)酵好的微生物培養(yǎng)物種，并添加1g雜多酸H3PW12O40.6H20，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)。攪拌速率為200rpm，反應(yīng)溫度為30 V，維持96h;
(3)反應(yīng)產(chǎn)物CK的收集與純化:將上述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物離心，棄上清。沉淀用去離子水清洗數(shù)次，加入水:乙酸乙酯為1:1(體積比)混合液進行萃取分離，合并有機相萃取液，減壓蒸餾濃縮到原體積的1/20。用制備色譜進行分離純化。其產(chǎn)率為90%，純度96%。
[0017]對比實例:與上述制備方法類似，不同的是僅使用有機酸或雜多酸，用制備色譜進行分離純化，稀有人參皂苷CK產(chǎn)率介于60-70%。
[0018]實施例2
(1)微生物的培養(yǎng):將氧化微桿菌(CCTCCAB 205576)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配置好的150L微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖20g/L，蛋白胨30g/L，牛肉膏30g/L;置于發(fā)酵罐中，在線滅菌(121°C，20min)，微生物培養(yǎng)溫度30°C，通氣比例3%(v/v)攪拌速率為200rpm/min，發(fā)酵時間120h;
(2)CK的轉(zhuǎn)化制備:將純度90%二醇組人參皂苷皂苷Rd等溶于50%的甲醇溶液中，配成3L濃度為I 00g/L皂苷溶液投入到上述發(fā)酵好的微生物培養(yǎng)物種，并添加20g雜多酸H4Siffi2O40.25H20，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)。攪拌速率為250rpm，反應(yīng)溫度為30°C，維持96h;
(3)反應(yīng)產(chǎn)物CK的收集與純化:將上述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物離心，棄上清。沉淀用去離子水清洗數(shù)次，加入水:乙酸乙酯為1:3(體積比)混合液進行萃取分離，合并有機相萃取液，減壓蒸餾濃縮到原體積的1/20。用制備色譜進行分離純化。其產(chǎn)率為92%，純度93%。
[0019]實施例3
(1)微生物的培養(yǎng):將氧化微桿菌(CCTCCAB 205576)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配置好的100L微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖30g/L，蛋白胨30g/L，牛肉膏25g/L;置于發(fā)酵罐中，在線滅菌(121°C，20min)，微生物培養(yǎng)溫35°C，通氣比例5%(v/v)攪拌速率為200rpm/min，發(fā)酵時間120h;
(2)CK的轉(zhuǎn)化制備:將純度95%二醇組人參皂苷皂苷Rb2等溶于80%的甲醇溶液中，配成2L濃度為100g/L皂苷溶液投入到上述發(fā)酵好的微生物培養(yǎng)物種，并添加40g雜多酸H3Feffi2O40.19H20，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)。攪拌速率為250rpm，反應(yīng)溫度為40°C，維持72h;
(3)反應(yīng)產(chǎn)物CK的收集與純化:將上述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物離心，棄上清。沉淀用去離子水清洗數(shù)次，加入水:乙酸乙酯為1:1(體積比)混合液進行萃取分離，合并有機相萃取液，減壓蒸餾濃縮到原體積的1/20。用制備色譜進行分離純化。其產(chǎn)率為85%，純度95%。
[0020]實施例4 (1)微生物的培養(yǎng):將氧化微桿菌(CCTCCAB 205576)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配置好的300L微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖20g/L，蛋白胨30g/L，牛肉膏25g/L;置于發(fā)酵罐中，在線滅菌(121°C，20min)，微生物培養(yǎng)溫32°C，通氣比例5%(v/v)攪拌速率為200rpm/min，發(fā)酵時間10h;
(2)CK的轉(zhuǎn)化制備:將純度95%二醇組人參皂苷皂苷Rb3等溶于80%的甲醇溶液中，配成5L濃度為200g/L皂苷溶液投入到上述發(fā)酵好的微生物培養(yǎng)物種，并添加20g雜多酸H3Znffi2O40.30H20，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)。攪拌速率為250rpm，反應(yīng)溫度為40°C，維持64h;
(3)反應(yīng)產(chǎn)物CK的收集與純化:將上述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物離心，棄上清。沉淀用去離子水清洗數(shù)次，加入水:乙酸乙酯為1:1(體積比)混合液進行萃取分離，合并有機相萃取液，減壓蒸餾濃縮到原體積的1/20。用制備色譜進行分離純化。其產(chǎn)率為80%，純度95%。
[0021]實施例5
(1)微生物的培養(yǎng):將氧化微桿菌(CCTCCAB 205576)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配置好的100L微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖30g/L，蛋白胨30g/L，牛肉膏15g/L;置于發(fā)酵罐中，在線滅菌(121°C，20min)，微生物培養(yǎng)溫37°C，通氣比例2%(v/v)攪拌速率為250rpm/min，發(fā)酵時間120h;
(2)CK的轉(zhuǎn)化制備:將純度90%二醇組人參皂苷皂苷Ral溶于50%的甲醇溶液中，配成IL濃度為120g/L皂苷溶液投入到上述發(fā)酵好的微生物培養(yǎng)物種，并添加50g雜多酸H3PW12O40.6H20，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)。攪拌速率為200rpm，反應(yīng)溫度為45 V，維持64h;
(3)反應(yīng)產(chǎn)物CK的收集與純化:將上述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物離心，棄上清。沉淀用去離子水清洗數(shù)次，加入水:乙酸乙酯為1:3(體積比)混合液進行萃取分離，合并有機相萃取液，壓蒸餾濃縮到原體積的1/20。用制備色譜進行分離純化。其產(chǎn)率為80%，純度96%。
【主權(quán)項】
1.一種氧化微桿菌發(fā)酵二醇組人參皂苷制備稀有人參皂苷CK的方法，其特征在于，包含如下步驟: (1)將氧化微桿菌從固體培養(yǎng)基接種至微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，并將其置于發(fā)酵罐中發(fā)酵； (2)將二醇組人參皂苷皂苷溶于有機水溶液中配成濃度為50-200g/L的皂苷溶液投入到步驟(I)中發(fā)酵好的微生物培養(yǎng)物種，并添加催化量的Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸HxYWi2040.ηΗ20催化劑，其中Y選自P、S1、Fe或Zn，x為3或4，n為0_30的正整數(shù)，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)； (3)步驟(2)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)離心、洗滌、萃取，并用半制備色譜柱進行分離純化得到純度在93%以上的目標產(chǎn)物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: (1)微生物的培養(yǎng):將氧化微桿菌從固體培養(yǎng)基接種至微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵罐中，121°(:，201^11在線滅菌，微生物培養(yǎng)溫度25-40°(:，通氣比例0.1-10%￥八，攪拌速率為100-360rpm/min，發(fā)酵時間 36-120h ； (2)CK的轉(zhuǎn)化制備:將二醇組人參皂苷皂苷溶于10-90%的有機水溶液中，配成濃度為50-200g/L的皂苷溶液2-6L投入到步驟(I)中發(fā)酵好的微生物培養(yǎng)物種，并添加催化量的Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化劑，其中Y選自P、S1、FeSZn，xS3S4，r^0_3(^正整數(shù)，進行恒溫攪拌催化反應(yīng)，攪拌速率為100-300rpm，反應(yīng)溫度為25-50°C，維持24-96h； (3)反應(yīng)產(chǎn)物CK的收集與純化:將步驟(2)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物離心，沉淀用去離子水清洗數(shù)次，加入水:有機溶劑體積比為I: 4?3: 2的有機水溶液進行萃取分離，合并有機相萃取液，減壓蒸餾濃縮到原體積的1/15?1/30，用半制備色譜柱進行分離純化，得到純度在93%以上的目標產(chǎn)物。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述的氧化微桿菌保藏編號為CCTCCAB 205576。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述微桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖2-40g/L，蛋白胨 10-30g/L，牛肉膏 1-25g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(2)和(3)中所述的有機水溶液中有機溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:采用工業(yè)化色譜柱對目標產(chǎn)物精制純化。7.利用權(quán)利要求1所述方法制備的稀有人參皂苷CK作為原料藥制成硬膠囊、軟膠囊、片劑、沖劑、滴丸或注射劑。
【文檔編號】C12P33/20GK105838770SQ201610344642
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】范代娣, 段志廣, 惠俊峰, 朱晨輝, 米鈺, 馬沛, 李偉娜, 馬曉軒
【申請人】西北大學(xué)