一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法
【專利摘要】一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，它涉及一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法。本發(fā)明在提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的同時，合理化利用凝乳酶發(fā)酵廢菌體，變廢為寶。本發(fā)明的方法為：將米黑根霉廢菌體過濾除去多余水份，制成混懸液，向混懸液中加入破壁酶進行破壁酶解，得酶解液；在納他霉菌發(fā)酵0～48h，將酶解液加入到納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵后得納他霉素。本發(fā)明通過向納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中添加產(chǎn)凝乳酶的米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶解液，可以顯著提高生產(chǎn)菌株納他霉素的產(chǎn)量，同時解決了米黑根霉發(fā)酵廢菌體難以處理的難題，可謂一舉兩得。
【專利說明】
一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法
技術(shù)領域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 納他霉素(Natamycin)，別稱游霉素、匹馬霉素(Pimaricin)，是一種多烯烴大環(huán)內(nèi) 脂類抗真菌劑，專性抑制霉菌和酵母菌(崔旭海.納他霉素在食品工業(yè)中的最新研究現(xiàn)狀. 肉類研究· 2009，12:35-38)，主要由納塔爾鏈霉菌（Streptomyces natalensis)、恰塔努加 鏈霉菌(S. chattanovgensis)、褐黃抱鏈霉菌(S. gilvosporeus)和利迪鏈霉菌(S · lydicus) 等放線菌產(chǎn)生（胡海洋，喬春明，葛菁萍，平文祥.納他霉素的特性和生產(chǎn)研究狀況.中國現(xiàn) 代藥物應用.2009，3 (2): 200-201)。納他霉素的分子式為C33H47N013，分子量為665.725。納他 霉素含有一個26元的大環(huán)內(nèi)酯，環(huán)外有一個通過糖苷鍵鏈接的海藻氨基糖。
[0003] 納他霉素性質(zhì)穩(wěn)定，但難溶于水、油脂，因而很難被人體消化、吸收，大部分攝入的 納他霉素會隨糞便排出，未見有霉菌和酵母菌對納他霉素產(chǎn)生異常的耐藥性，使用大于MIC 的納他霉素量人為誘導也沒發(fā)現(xiàn)真菌對納他霉素形成抗性（Davidson P M，Dona C H. Antimicrobio in Foods[J] · Natamycin，1993，7:395-407 ·)。1982年6月，美國食品與藥 品管理局(FDA)已正式批準納他霉素作為食品添加劑使用，還將其歸為GRAS產(chǎn)品之列，CFR 編碼:21CFR172.155,納他霉素的DAI值是0.3mg/kg。我國食品添加劑委員會于1996年對納 他霉素進行評價后也建議批準使用，并在《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》(GB2760)規(guī)定納他霉 素可用于乳酪、肉制品、廣式月餅和糕點表面、果汁原漿表面、易發(fā)霉食品、加工器皿表面， 食物中最大殘留量l〇mg/kg，而納他霉素在實際應用中的使用量為10-6,因此納他霉素是一 種安全、高效的天然防腐劑（閻永貞，周緒霞，李衛(wèi)芬，陳南南，宋文輝.納他霉素抑菌機理及 其在食品中的應用.食品工業(yè)科技.2010，31 (4): 365-373)。目前已有瑞士、美國、歐盟、南 美、東歐及中東等地區(qū)的三十多個國家將納他霉素用于乳制品、肉制品、果汁飲料、葡萄酒 等食品的保減。
[0004] 納他霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)過程中需要大量的碳源和氮源。目前，納他霉素在發(fā) 酵過程中常用到的氮源主要包括玉米漿干粉、麥芽浸粉、大豆蛋白粉、酵母抽提物和牛骨蛋 白胨等。納他霉素的發(fā)酵周期較長，一般為96~108h。較長的發(fā)酵周期往往導致菌株在發(fā)酵 中后期培養(yǎng)基中營養(yǎng)不足，尤其是氮源。速效氮源中由于富含游離氨基酸和小分子肽類物 質(zhì)微生物培養(yǎng)基主要是由水、碳源、氮源、無機鹽及其它成分組成。氮源主要用于構(gòu)建菌體 細胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸等)和含氮代謝物，可分為有機氮源和無機氮源。有機氮源 除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸外，還含有少量糖類、脂肪、無機鹽、維生素及某些 生長因子。大部分有機氮源是農(nóng)副產(chǎn)品的副產(chǎn)物，由于原料來源和加工條件的不同，成分上 存在一定的波動。和碳源利用相同，微生物先利用速效氮源再利用遲效性氮源
[0005] 氮源在工業(yè)發(fā)酵調(diào)控中的作用主要體現(xiàn)在以下幾個方面：
[0006] 1、促進生長，調(diào)節(jié)初級代謝及次級代謝的通量。氮源通過提供中間代謝物(前體）， 如核苷酸、氨基酸、糖、乙酰CoA等，生成核酸、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等物質(zhì)，直接用于微生物的 生長;或者由前體物質(zhì)作用于次級代謝物的合成途徑。
[0007] 2、控制合適水平，啟動次級代謝產(chǎn)物形成。比生長速率下降、限制性養(yǎng)分的耗竭、 幾種調(diào)節(jié)因子的聯(lián)合作用（cAMP，碳源，氮源，或磷源的同化速率）、嚴謹響應、微生物信號因 子。
[0008] 3、控制生長速率，影響菌型形成，從而影響發(fā)酵液流變特性；
[0009] 4、影響供氧水平，增加功率消耗。
[0010] 因此，根據(jù)不同菌種對不同氮源的利用度、利用速率不同，針對具體的發(fā)酵產(chǎn)品或 行業(yè)，應選擇不同的氮源或氮源組合。
[0011]真菌誘導子是一類能誘導植物和微生物產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)，它一經(jīng)識 另|J，將通過信號轉(zhuǎn)導途徑，引起相關基因表達發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)次級代謝產(chǎn)物合成途徑中 相關酶的活性，誘導特定次級代謝產(chǎn)物的積累。近年來國內(nèi)外在真菌誘導子誘導途徑及機 制方面進行了深入研究，同時在生物工業(yè)領域，尤其在發(fā)酵工業(yè)中的應用也引起了廣泛關 注。真菌對納塔爾鏈霉菌發(fā)酵的正面誘導影響主要來源于兩個方面，一是真菌的細胞壁或 細胞內(nèi)含物，二是真菌細胞外的代謝產(chǎn)物。添加真菌誘導子能提高生產(chǎn)菌株細胞對糖的利 用率，促進納他霉素的合成。由真菌細胞或其代謝產(chǎn)物制成的誘導子均能有效提高發(fā)酵液 中納他霉素的產(chǎn)量，原因可能是制備物中某些物質(zhì)作為一種異己成分被恰塔努加鏈霉菌株 細胞膜上的受體識別，從而激發(fā)了菌株的自我防御機制，導致次生代謝產(chǎn)物納他霉素產(chǎn)量 的增加。納他霉素作為某些鏈霉菌作為真菌抑制劑的次級代謝產(chǎn)物，可以受到某些真菌誘 導子的誘導已有報道。
[0012] -方面市場目前對納他霉素的需求量極大，但由于其發(fā)酵水平低，導致成本和售 價較高，含量為95%以上的納他霉素市場售價目前約在2000元/kg左右。因此，研究納他霉 素發(fā)酵的規(guī)律，指導和改進發(fā)酵工藝以提高納他霉素的發(fā)酵水平尤為重要。目前，對于提高 納他霉素產(chǎn)量的研究主要集中在菌種選育和培養(yǎng)條件的優(yōu)化等方面。
[0013] 另一方面，凝乳酶發(fā)酵生產(chǎn)之后的米黑根霉廢菌體經(jīng)濟價值不高，除進行無害化 處理外，尚無其他合理出路，徒增企業(yè)的環(huán)保壓力和成本。但凝乳酶發(fā)酵菌體細胞內(nèi)含有較 高的蛋白質(zhì)，初步測定蛋白質(zhì)含量超過31%，這些蛋白質(zhì)可以作為納他霉素生產(chǎn)菌株的遲 效氮源。此外，凝乳酶生產(chǎn)菌株米黑根霉的細胞組分，可以作為一種納他霉素生產(chǎn)菌株的合 成誘導劑，促進鏈霉菌合成納他霉素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)過破壁酶適度酶解的產(chǎn)凝乳酶的米黑根霉發(fā)酵菌體，可以促 進鏈霉菌納他霉素的產(chǎn)量。在提高納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量的同時，合理化利用凝乳酶發(fā)酵廢 菌體，變廢為寶。
[0015] 本發(fā)明的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，它是按照以下步驟進行的：
[0016] -、將米黑根霉廢菌體過濾除去多余水份，制成混懸液，向混懸液中加入破壁酶進 行破壁酶解，得酶解液；
[0017] 二、在納他霉菌發(fā)酵0~48h，將酶解液加入到納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵后得納 他霉素。
[0018] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0019] 本發(fā)明通過向納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中添加產(chǎn)凝乳酶的米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶解 液，可以顯著提高生產(chǎn)菌株納他霉素的產(chǎn)量，同時解決了米黑根霉發(fā)酵廢菌體難以處理的 難題，可謂一舉兩得。
[0020] 本發(fā)明向納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中添加霉菌發(fā)酵廢菌體酶解液，既可以為納他霉素 合成提供真菌誘導因子，又可以提供遲效菌體蛋白氮源。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以產(chǎn)凝乳酶的米黑根 霉廢菌體酶解液可以顯著提高納他霉素生產(chǎn)菌株納他霉素產(chǎn)量，提高率在20%以上。
[0021] 產(chǎn)凝乳酶米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶解液的向納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加時間為 納他霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵〇~48h后，優(yōu)選是在納他霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵0~36h后，更優(yōu)選是在 納他霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵〇~24h后，最優(yōu)選是在納他霉素發(fā)酵12h后。
[0022] 產(chǎn)凝乳酶米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶解液在納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加量為2.00 ~12 · 00g/L，優(yōu)選的是6 · 00~10 · 00g/L，更有選的是8 · 00g/L。
[0023] 經(jīng)本發(fā)明的方法得到的納他霉素產(chǎn)量最高為1.91 ± 0.10g/L。
[0024] 在1000L發(fā)酵體系中添加 8.00g/L的產(chǎn)凝乳酶米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶解液，其發(fā)酵 102h后納他霉素含量為12.46g/L，顯著高于未添加酶解液的對照組9.72g/L的結(jié)果，高出率 達到28.21 %。而在10L發(fā)酵體系中；納他霉素含量為11.67g/L，顯著高于未添加酶解液的對 照組9.31 g/L的結(jié)果，高出率達到25.40 %。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0025] 一:本實施方式的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，它是按照以 下步驟進行的：
[0026] -、將米黑根霉廢菌體過濾除去多余水份，制成混懸液，向混懸液中加入破壁酶進 行破壁酶解，得酶解液；
[0027]二、在納他霉菌發(fā)酵0~48h，將酶解液加入到納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵后得納 他霉素。
【具體實施方式】 [0028] 二:本實施方式與一不同的是:步驟一中去除水分后 的米黑根霉廢菌體的含水量為20 %~30 %。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0029] 三:本實施方式與一不同的是:步驟一中去除水分后 的米黑根霉廢菌體的含水量為25 %~30 %。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0030] 四：本實施方式與一不同的是:混懸液制備是用水與 米黑根霉廢菌體混合后，得混懸液;其中，水與米黑根霉廢菌體的質(zhì)量比為：1: 〇. 2~0.3。其 它與一相同。
【具體實施方式】 [0031] 五:本實施方式與一不同的是:步驟一中破壁酶解的 操作如下：向混懸液中加入維生素 B1、氯化鈉和真菌破壁酶，攪拌條件下調(diào)節(jié)pH至5.6~ 6.4;然后維持溫度在18~22°C條件下1~2h，然后加熱至45~55°C，維持8~10h;其中，混懸 液與維生素 B1的質(zhì)量比1:0.2~0.3;混懸液與氯化鈉的質(zhì)量比為1:0.4~0.6;混懸液與真 菌破壁酶的質(zhì)量比1:0.2~0.3。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0032] 六:本實施方式與一不同的是:酶解液的干物質(zhì)含量 10 %~18 %，總氮含量1.20 %~1.60 %，氨基酸態(tài)氮含量0.12 %~0.16%。其它與具體實施 方式一相同。
【具體實施方式】 [0033] 七:本實施方式與一不同的是：1L納他霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基中加入濃度為2~12g/L的酶解液。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0034] 八:本實施方式與一不同的是：1L納他霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基中加入濃度為6~10g/L的酶解液。其它與一相同。
[0035]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是：1L納他霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基中加入濃度為8~10g/L的酶解液。其它與【具體實施方式】一相同。
【具體實施方式】 [0036] 九:本實施方式與一不同的是：納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基 為:濃度為40.00g/L的葡萄糖溶液、濃度為25.00g/L的蛋白胨溶液、濃度為10.00g/L的酵母 浸膏溶液、濃度為4.00g/L的消泡劑和濃度為0 · 50g/L的MgS〇4 · 7H20;pH=7 · 00~7 · 20。其它 與一相同。
【具體實施方式】 [0037] 十:本實施方式與一不同的是：向1L液體種子培養(yǎng)基 中接入斜面種子無菌菌懸液，30 °C下以300rpm的轉(zhuǎn)速進行攪拌培養(yǎng)48h，然后將米黑根霉廢 菌體過濾除去多余水份，制成混懸液。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0038] ^ :本實施方式與一不同的是：納他霉素液體種子 培養(yǎng)基制備：濃度為20.00g/L的葡萄糖溶液、濃度為20.00g/L的酵母浸膏溶液、濃度為 5.00g/L的玉米漿干粉溶液、濃度為6.00g/L的NaCl溶液、濃度為0.50g/L的MgS〇4 · 7H20溶液 和濃度為1.40g/L的消泡劑溶液;pH=6.60~6.80。其它與一相同。
[0039] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
不僅限于上述各實施方式的內(nèi)容，其中一個或幾個【具體實施方式】的組 合同樣也可以實現(xiàn)發(fā)明的目的。
[0040] 通過以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：
[0041 ] 實施例1:
[0042]產(chǎn)凝乳酶米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶解液在對納他霉素培養(yǎng)基中的最佳添加量的確 定。
[0043]搖瓶培養(yǎng)基的配制：葡萄糖，20.00g/L;酵母浸膏，20.00g/L;玉米漿干粉，5.00g/ L; NaCl，6 · 00g/L ;MgS04 · 7H20，0 · 50g/L;消泡劑，1 · 40g/L;米黑根霉發(fā)酵凝乳酶廢菌體酶 解液分別為〇. 〇〇g/L(對照組）、2.00g/L(實驗組一）、4.00g/L(實驗組二）、6.00g/L(實驗組 三）、8.00g/L(實驗組四）、10.00g/L(實驗組五)和12.00g/L(實驗組六）；ρΗ=7·00~7·20。 1L搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配制好后分裝于500mL帶擋板的三角搖瓶中，每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為 50mL，每個實驗組6瓶。然后三角瓶口用6層干凈紗布封瓶口，121°CX20min滅菌，冷卻后備 用。從斜面培養(yǎng)基上刮取一環(huán)納他鏈霉菌孢子，接種至搖瓶培養(yǎng)基中。30°C下，以200rpm的 轉(zhuǎn)速在搖床中振蕩培養(yǎng)72h，培養(yǎng)過程中不流加碳、氮源，也不調(diào)節(jié)pH。
[0044]在振蕩培養(yǎng)48h和培養(yǎng)72h后，分別在對照組和每個實驗組中抽取三瓶，分別測定 發(fā)酵液中的納他霉素含量、葡萄糖含量、0D值和pH值。
[0045]發(fā)酵液中納他霉素含量的測定方法:按照國標GB 25532-2010中規(guī)定的方法進行 測定。
[0046]發(fā)酵液中葡萄糖含量的測定:SBA40E型葡萄糖酶膜分析儀測定。
[0047] 0D值的測定:將發(fā)酵液稀釋10倍，置于722型分光光度計中600nm波長下進行測定。
[0048] pH的測定:利用梅特勒pH計進行直接測定。
[0049] 具體結(jié)果見表1所示。
[0050] 表1不同米黑根霉廢菌體酶解液添加量對搖瓶中納他霉素產(chǎn)量的影響
[0051]
[0052]從表1的結(jié)果可以看出向納他霉素搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中加入米黑根霉廢菌體酶解液 能夠有效地提高納他霉素的產(chǎn)量。當向納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2.00~12.00g/L的米黑 根霉廢菌體酶解液時，與不添加米黑根霉廢菌體酶解液的對照組相比，納他霉素產(chǎn)量提高 了 16.98%~67.92%。其中當向納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中加入6.00~10.00g/L的米黑根霉廢 菌體酶解液時，與不添加米黑根霉廢菌體酶解液的對照組相比，納他霉素產(chǎn)量提高了 54.72%~67.92%。其中當向納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中加入8.00g/L的米黑根霉廢菌體酶解 液時(實驗組六），與不添加米黑根霉廢菌體酶解液的對照組相比，納他霉素產(chǎn)量最高提高 了67.92 % ;當米黑根霉廢菌體酶解液添加量為10.00g/L時(實驗組五），納他霉素產(chǎn)量與實 驗組六相比略低，但差異不顯著;米黑根霉廢菌體酶解液添加量為12.00g/L時(實驗組五）， 納他霉素產(chǎn)量與實驗組六相比顯著降低。
[0053]根據(jù)以上的數(shù)據(jù)結(jié)果，在本發(fā)明此后的實施例中凝乳酶發(fā)酵生產(chǎn)后的米黑根霉廢 菌體酶解液的添加量均為8.00g/L。
[0054] 實施例2:
[0055] 產(chǎn)凝乳酶米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶解液在對納他霉素培養(yǎng)基中的最佳添加時間的 確定。
[0056]搖瓶培養(yǎng)基的配制：葡萄糖，20.00g/L;酵母浸膏，20.00g/L;玉米漿干粉，5.00g/ L; NaCl，6 · 00g/L;MgS04 · 7H20，0 · 50g/L;消泡劑，1 · 40g/L; pH = 7 · 00~7 · 20。1L搖瓶發(fā)酵培 養(yǎng)基配制好后分裝于500mL帶擋板的三角搖瓶中，每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為50mL，每個實驗 組5瓶。然后三角瓶口用6層干凈紗布封瓶口，121°C X 20min滅菌，冷卻后備用。米黑根霉發(fā) 酵凝乳酶廢菌體酶解液均為8.00g/L，單獨121°CX15min滅菌，在納他霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵的 不同時間按比例進行添加，添加時間分別為:不添加(對照組）、〇h(實驗組一）、12h(實驗組 二）、24h(實驗組三）、36h(實驗組四）和48 (實驗組五）。
[0057]從斜面培養(yǎng)基上刮取一環(huán)納他鏈霉菌孢子，接種至搖瓶培養(yǎng)基中。30°C下，以 200rpm的轉(zhuǎn)速在搖床中振蕩培養(yǎng)72h，培養(yǎng)過程中不流加碳、氮源，也不調(diào)節(jié)pH。
[0058]在振蕩培養(yǎng)72h后，分別測定發(fā)酵液中的納他霉素含量、葡萄糖含量、0D值和pH值。 [0059]發(fā)酵液中納他霉素含量的測定方法：按照國標GB 25532-2010中規(guī)定的方法進行 測定。
[0060] 發(fā)酵液中葡萄糖含量的測定:SBA40E型葡萄糖酶膜分析儀測定。
[0061] 0D值的測定:將發(fā)酵液稀釋10倍，置于722型分光光度計中600nm波長下進行測定。
[0062] pH的測定:利用梅特勒pH計進行直接測定。
[0063]具體結(jié)果見表2所示。
[0064] 表2米黑根霉廢菌體酶解液添加時間對搖瓶中納他霉素產(chǎn)量的影響
[0065]
[0067]從表2的結(jié)果可以直觀地看出，向納他霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 8.00g/L的 米黑根霉廢菌體酶解液與不添加米黑根霉菌體酶解液的培養(yǎng)基(對照組)相比，納他霉素產(chǎn) 量均有顯著的提高。但是，在納他霉素菌株發(fā)酵的不同時間添加產(chǎn)凝乳酶米黑根霉發(fā)酵廢 菌體酶解液對納他霉素產(chǎn)量有影響，其中當納他霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵12h后添加米黑根霉酶 解液(實驗組二），納他霉素產(chǎn)量最高為1.91±0.10g/L，與Oh添加(實驗組一)相比納他霉素 產(chǎn)量提高15.06%，與不添加酶解液組(對照組)相比納他霉素產(chǎn)量提高94.89%。隨著添加 時間的延長，納他霉素的產(chǎn)量出現(xiàn)規(guī)律性降低。
[0068] 實施例3:
[0069] 向10L發(fā)酵培養(yǎng)基中添加米黑根霉發(fā)酵凝乳酶廢菌體酶解液對納他霉素產(chǎn)量的影 響。
[0070] 納他霉素液體種子培養(yǎng)基制備:葡萄糖，20.00g/L;酵母浸膏，20.00g/L;玉米漿干 粉，5 · 00g/L; NaCl，6 · 00g/L;MgS04 · 7H20，0 · 50g/L;消泡劑，1 · 40g/L; pH = 6 · 60~6 · 80。種 子培養(yǎng)基配制好后121°C X20min滅菌。
[0071 ]向1.5L液體種子培養(yǎng)基中接入斜面種子無菌菌懸液，30°C下以300rpm的轉(zhuǎn)速進行 攪拌培養(yǎng)48h。
[0072]納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基制備(實驗組）：葡萄糖，40.00g/L;蛋白胨，25.00g/L;酵母浸 膏，10 · 00g/L;消泡劑4 · 00g/L ;MgS04 · 7H20，0 · 50g/L;產(chǎn)凝乳酶米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶解 液，8.00g/L; pH= 7.00~7.20。發(fā)酵培養(yǎng)基未接種前體積為5.4L，裝入10L全自動發(fā)酵罐中。 發(fā)酵培養(yǎng)基配制好后12?ΓΧ20π?η滅菌，滅菌冷卻后按10%體積接入納他霉素種子培養(yǎng) 液，即600mL。接入種子培養(yǎng)液后，實驗組初始發(fā)酵培養(yǎng)液的總體積為6.0L。
[0073]納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基制備(對照組）：葡萄糖，40.00g/L;蛋白胨，25.00g/L;酵母浸 膏，10 · 00g/L;消泡劑4 · 00g/L;MgS04 · 7H20，0 · 50g/L;pH=7 · 00~7 · 20。發(fā)酵培養(yǎng)基未接種 前體積為5.4L，裝入10L全自動發(fā)酵罐中。發(fā)酵培養(yǎng)基配制好后121°C X 20min滅菌，滅菌冷 卻后按10%體積接入納他霉素種子培養(yǎng)液，即600mL。接入種子培養(yǎng)液后，對照組初始發(fā)酵 培養(yǎng)液的總體積為6.0L。
[0074] 實驗組和對照組均以30.0 ± 0.5 °C為培養(yǎng)溫度，發(fā)酵過程中溶氧D0值控制在30 % ~40 %之間。培養(yǎng)初期pH從初始pH值自然降落至6.00 ±0.10時開始流加20%濃度NaOH并將 pH維持在6.00 ± 0.20之間至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中流加40 %質(zhì)量百分比濃度的葡萄糖溶 液，并始終將葡萄糖含量控制在15.00 ± 5.00g/L。
[0075]表3添加米黑根霉廢菌體酶解液對10L發(fā)酵體系中中納他霉素產(chǎn)量的影響
[00771
[0078] 從表3中可以看出，實驗組由于添加了 8. OOg/L的產(chǎn)凝乳酶米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶 解液，其發(fā)酵l〇2h后納他霉素含量為11.67g/L，顯著高于未添加酶解液的對照組9.31g/L的 結(jié)果，高出率達到25.40%。10L發(fā)酵體系驗證結(jié)果表明，添加8.00g/L的產(chǎn)凝乳酶米黑根霉 發(fā)酵廢菌體酶解液可以顯著提高納他霉素生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量。
[0079] 實施例4:
[0080] 向1000L發(fā)酵培養(yǎng)基體系中添加米黑根霉發(fā)酵凝乳酶廢菌體酶解液對納他霉素產(chǎn) 量的影響。
[0081 ]納他霉素液體種子培養(yǎng)基制備:葡萄糖，20.00g/L;酵母浸膏，20.00g/L;玉米漿干 粉，5 · 00g/L; NaCl，6 · 00g/L;MgS04 · 7H20，0 · 50g/L;消泡劑，1 · 40g/L; pH=6 · 60~6 · 80。28L 種子培養(yǎng)基配制好后121°C X20min滅菌。
[0082]向裝有28L液體種子培養(yǎng)基的50L全自動種子發(fā)酵罐中接入2L斜面種子無菌菌懸 液，30 °C下以300rpm的轉(zhuǎn)速進行攪拌培養(yǎng)48h。同一批次準備2個種子罐，培養(yǎng)好后的種子分 別接種至實驗組和對照組中試發(fā)酵罐中。
[0083]納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基制備(實驗組）：葡萄糖，40 · 00g/L;蛋白胨，25 · 00g/L;酵母浸 膏，10 · 00g/L;消泡劑4 · 00g/L ;MgS04 · 7H20，0 · 50g/L;產(chǎn)凝乳酶米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶解 液，8.00g/L; pH= 7.00~7.20。發(fā)酵培養(yǎng)基未接種前體積為570L，裝入1000L中試級全自動 發(fā)酵罐中。發(fā)酵培養(yǎng)基配制好后12?ΓΧ20π?η原位滅菌，滅菌冷卻后按5%體積比（即30L) 接入納他霉素種子培養(yǎng)液。接入種子培養(yǎng)液后，實驗組初始發(fā)酵培養(yǎng)液的總體積為600L。 [0084]納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基制備(對照組）：葡萄糖，40.00g/L;蛋白胨，25.00g/L;酵母浸 膏，10 · 00g/L;消泡劑4 · 00g/L;MgS04 · 7H20，0 · 50g/L;pH=7 · 00~7 · 20。發(fā)酵培養(yǎng)基未接種 前體積為570L，裝入1000L中試級全自動發(fā)酵罐中。發(fā)酵培養(yǎng)基配制好后12?ΓΧ20π?η原位 滅菌，滅菌冷卻后按5%體積比（即30L)接入納他霉素種子培養(yǎng)液。接入種子培養(yǎng)液后，實驗 組初始發(fā)酵培養(yǎng)液的總體積為600L。
[0085] 實驗組和對照組均以30.0 ± 0.5 °C為培養(yǎng)溫度，發(fā)酵過程中溶氧D0值控制在30 % ~40 %之間。培養(yǎng)初期pH從初始pH值自然降落至6.00 ±0.10時開始流加20%濃度NaOH并將 pH維持在6.00 ± 0.20之間至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中流加40 %質(zhì)量百分比濃度的葡萄糖溶 液，并始終將葡萄糖含量控制在15.00 ± 5. OOg/L。
[0086] 表4添加米黑根霉廢菌體酶解液對1000L發(fā)酵體系中中納他霉素產(chǎn)量的影響
[0087]
[0088]
[0089]從表4中可以看出，實驗組由于添加了8.OOg/L的產(chǎn)凝乳酶米黑根霉發(fā)酵廢菌體酶 解液，其發(fā)酵l〇2h后納他霉素含量為12.46g/L，顯著高于未添加酶解液的對照組9.72g/L的 結(jié)果，高出率達到28.21 %。1000L發(fā)酵體系驗證結(jié)果表明，添加8.00g/L的產(chǎn)凝乳酶米黑根 霉發(fā)酵廢菌體酶解液可以顯著提高納他霉素生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量。
【主權(quán)項】
1. 一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的： 一、 將米黑根霉廢菌體過濾除去多余水份，制成混懸液，向混懸液中加入破壁酶進行破 壁酶解，得酶解液； 二、 在納他霉菌發(fā)酵0~48h后，將酶解液加入到納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵后得納他 霉素。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于步驟一中去 除水分后的米黑根霉廢菌體的含水量為20%~30%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于混懸液制備 是用水與米黑根霉廢菌體混合后，得混懸液;其中，水與米黑根霉廢菌體的質(zhì)量比為1:0.2 ~0 · 3〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于步驟一中破 壁酶解的操作如下：向混懸液中加入維生素 B1、氯化鈉和真菌破壁酶，攪拌條件下調(diào)節(jié)pH至 5.6~6.4;然后維持溫度在18~22°(：條件下1~211，然后加熱至45~55°(：，維持8~1011 ;其 中，混懸液與維生素 B1的質(zhì)量比1:0.2~0.3;混懸液與氯化鈉的質(zhì)量比為1:0.4~0.6;混懸 液與真菌破壁酶的質(zhì)量比1:0.2~0.3。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于酶解液的干 物質(zhì)含量1 〇%~18%，總氮含量1 · 20%~1 · 60%，氨基酸態(tài)氮含量0 · 12%~0 · 16%。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于1L納他霉素 發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度為2~12g/L的酶解液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于1L納他霉素 發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度為6~1 Og/L的酶解液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于納他霉素發(fā) 酵培養(yǎng)基為：濃度為40.00g/L的葡萄糖溶液、濃度為25.00g/L的蛋白胨溶液、濃度為 10.00g/L的酵母浸膏溶液、濃度為4.00 g//L的消泡劑和濃度為0.50g//L的MgS〇4 · 7H20;pH = 7.00~7·20〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于向1L液體種 子培養(yǎng)基中接入斜面種子無菌菌懸液，30°C下以300rpm的轉(zhuǎn)速進行攪拌培養(yǎng)48h，然后將米 黑根霉廢菌體過濾除去多余水份，制成混懸液。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種提高納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于納他霉素液 體種子培養(yǎng)基制備:濃度為20.00g/L的葡萄糖溶液、濃度為20.00g/L的酵母浸膏溶液、濃度 為5.00g/L的玉米漿干粉溶液、濃度為6.00g/L的NaCl溶液、濃度為0.50g/L的MgS〇4 · 7H20溶 液和濃度為1 · 40g/L的消泡劑溶液;pH=6 · 60~6 · 80。
【文檔編號】C12R1/465GK105838761SQ201610421504
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】梁恒宇, 張欽革, 郭坤, 殷永新, 欒亞紅, 陳傲冰, 孫寶蘭, 許鑫, 周梅偉, 王亞麗
【申請人】安泰生物工程股份有限公司