一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯b和槲皮素的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，所述制備方法依次經(jīng)過(guò)試管擴(kuò)大培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)和種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)、固體前發(fā)酵培養(yǎng)、液體后發(fā)酵培養(yǎng)及提取分離步驟制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體；所述含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體再分別經(jīng)過(guò)提取制得銀杏內(nèi)酯B和槲皮素晶體。本發(fā)明以去皮白果和大米為固體基質(zhì)添加銀杏葉提取物，以金耳為菌種通過(guò)固體前發(fā)酵，轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮，通過(guò)后發(fā)酵，使槲皮素和銀杏內(nèi)酯B得以分離，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，并可以同時(shí)生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B和槲皮素；工藝簡(jiǎn)單，且所得到的產(chǎn)品中，銀杏內(nèi)酯B純度大于90%，槲皮素純度大于95%，制取的純度較高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，研究證明銀杏內(nèi)酯是銀杏葉中主要的活性成分之一，是一類(lèi)特異有效的血小板活化因子(Platelet activating factor)受體措抗劑。血小板活化因子(PAF)是由血小板和多種炎癥組織分泌產(chǎn)生的一種內(nèi)源性磷酯，是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血小板聚集誘導(dǎo)劑，與許多疾病的產(chǎn)生、發(fā)展密切相關(guān)。銀杏內(nèi)酯作為PAF受體特異性拮抗劑，具有廣泛的藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)與缺血損傷有保護(hù)作用，抗休克、抗過(guò)敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B可降低肝門(mén)靜脈壓，提高全身血管耐受性，說(shuō)明它對(duì)肝硬化有一定的療效。銀杏內(nèi)酯對(duì)于腎損傷有治療作用。這些作用都與銀杏內(nèi)酯B作為PAF受體拮抗劑有關(guān)，并且它目前被認(rèn)為是作用最強(qiáng)的、最有臨床應(yīng)用前景的天然血小板活化因子(PAF)受體拮抗劑。
[0003]槲皮素及其衍生物是植物界分布廣泛的，具有多種生物學(xué)活性的黃酮類(lèi)化合物。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥工作者對(duì)槲皮素的研究日益增多，發(fā)現(xiàn)其具有許多藥理活性，如抗氧化及清除氧自由基作用、抗纖維化作用、抗腫瘤作用、能降低血壓，保護(hù)心肌缺血再灌注損傷、抗病毒、鎮(zhèn)痛及止瀉等，并且槲皮素對(duì)人體無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)致癌、無(wú)致死、無(wú)致畸等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)外曾試用于多種疾病的治療，取得了良好的效果。槲皮素存在于許多植物的花、葉、果實(shí)中，多以甙的形式存在，如蘆丁、槲皮甙、金絲桃甙等，這些甙通常經(jīng)酸水解制備槲皮素。極少用生物的方法制備槲皮素。
[0004]近年來(lái)有學(xué)者提出了中藥發(fā)酵制藥技術(shù)。所謂的中藥發(fā)酵制藥技術(shù)是在繼承中藥炮制學(xué)發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，吸取了微生態(tài)學(xué)研究成果，結(jié)合現(xiàn)代生物工程的發(fā)酵技術(shù)而形成的高科技中藥制藥新技術(shù)，是從中藥(天然藥物)制藥方面尋找藥物的新療效。傳統(tǒng)的中藥發(fā)酵多是在天然的條件下進(jìn)行的，而現(xiàn)在的中藥發(fā)酵制藥技術(shù)是在充分吸收了近代微生態(tài)學(xué)、生物工程學(xué)的研究成果而逐漸形成的。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中普遍采用對(duì)銀杏內(nèi)酯B和槲皮素分別利用單純的分離提純方法來(lái)獲得大量的銀杏內(nèi)酯B和槲皮素，分離效率低下，不能適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，并且單獨(dú)提純分離方法較落后，生產(chǎn)成本較高。
本案發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入研究和反復(fù)工業(yè)化生產(chǎn)試驗(yàn)，摸索出工業(yè)化規(guī)模同時(shí)生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B和槲皮素技術(shù)，本發(fā)明無(wú)論從產(chǎn)品的生產(chǎn)方式和生產(chǎn)的產(chǎn)品，都有別于以往的專(zhuān)利和文章報(bào)道的內(nèi)容，即一種利用金耳同時(shí)生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]、要解決的問(wèn)題
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其以去皮白果和大米為固體基質(zhì)添加銀杏葉提取物，以金耳為菌種通過(guò)固體前發(fā)酵，轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮，通過(guò)后發(fā)酵，使槲皮素和銀杏內(nèi)酯B得以分離，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，并可以同時(shí)生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B和槲皮素;工藝簡(jiǎn)單，且所得到的產(chǎn)品中，銀杏內(nèi)酯B純度大于90%，槲皮素純度大于95%，制取的純度較高。
[0007]、技術(shù)方案
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，所述制備方法以大米、去皮白果和銀杏葉提取物為主要原料，以金耳為出發(fā)菌株，依次經(jīng)過(guò)試管擴(kuò)大培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)和種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)、固體前發(fā)酵培養(yǎng)、液體后發(fā)酵培養(yǎng)及提取分離步驟制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體再分別經(jīng)過(guò)提取制得銀杏內(nèi)酯B和槲皮素晶體，其中銀杏內(nèi)酯B純度達(dá)到90%，槲皮素純度達(dá)到95%。
[0008]優(yōu)選地，所述制備方法包括如下步驟:
Al試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳中斜面菌種接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，制得金耳試管斜面菌種；
A2液體搖瓶培養(yǎng):將步驟Al所制得的金耳試管斜面菌種接種到裝有液體搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，進(jìn)行培養(yǎng)，制得金耳液體搖瓶菌種；
A3種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟A2所制得的金耳液體搖瓶菌種接種到種子罐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，制成金耳種子罐菌種；
A4固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟A3所制得的金耳種子罐菌種接種到固體培養(yǎng)基中，并混合均勻，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，制得金耳固體發(fā)酵物；
A5液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟A4所制得的金耳固體前發(fā)酵物轉(zhuǎn)移到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，進(jìn)行液體后發(fā)酵，制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的金耳菌絲體；
A6提取分離:將步驟A5所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0009]優(yōu)選地，所述制備方法具體如下:
BI試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，20?35°C培養(yǎng)4?15天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫?br> B2液體搖瓶培養(yǎng):將步驟BI所制得的試管斜面菌種切成3 X 3 mm小塊菌種，挑取3?10塊接種于裝有20?150mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為50?200轉(zhuǎn)/分，溫度20?35°C的條件下，搖床培養(yǎng)18-86h，制成液體搖瓶菌種；
B3種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟B2所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為I?20%的接種量接種，在溫度為20?3 5°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50?160轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為
0.2?1.8:1的通氣量條件下，培養(yǎng)18?96h，制成金耳種子罐菌種；
B4固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟B3所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為2?10%的接種量接種，在溫度20?35°C，濕度80%前發(fā)酵20?40天，其中每隔3?6天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物； B5液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟B4所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為5?10，在溫度為20?43°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50?160轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為0.2-1.8:1的通氣量條件下發(fā)酵24?72h，所制得的發(fā)酵液體在2000?6000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體；
B6提取分離:將步驟A5所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0010]優(yōu)選地，步驟B2中所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在100?130°C條件下滅菌90?360 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮5?20g，大米5?20g的原料。
[0011]優(yōu)選地，步驟B3中所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在100?130°C條件下滅菌90?360min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮5?20g，大米5?20g的原料。
[0012]優(yōu)選地，步驟B4中所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在100?130°C條件下滅菌90?360min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果200?400g、銀杏葉提取物30?50g和大米750?570g的原料。
[0013]優(yōu)選地，所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1:0.6?1.5的比例與水混合。
[0014]優(yōu)選地，步驟B5中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在100?130°C條件下滅菌30?60 min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有5?40g葡萄糖，0.5?4g蛋白胨和0.01?0.1gK2HPO4。
[0015]優(yōu)選地，步驟A6或步驟B6中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Cl將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的5?20倍體積的60?100%的乙醇，反復(fù)提取3?5次，得提取液一；
C2將步驟Cl所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶3?18小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素純度大于95%。
[0016]優(yōu)選地，步驟A6或步驟B6中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟:
Dl將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物；
D2向步驟Dl所得產(chǎn)物中加入重量的5?20倍的60?100%乙醇回流提取3?5次，得提取液二；
D3將步驟D2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶3?18小時(shí)；
D4將步驟D3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入3?10倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其純度大于90%。
[0017]、有益效果
相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:
(I)本發(fā)明在吸取中藥發(fā)酵制藥技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵各自的優(yōu)點(diǎn)，采用固態(tài)前發(fā)酵轉(zhuǎn)化銀杏活性成分黃酮和銀杏內(nèi)酯，克服了液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)(銀杏葉的活性成分)對(duì)金耳菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，同時(shí)利用深層發(fā)酵技術(shù)，金耳將銀杏內(nèi)酯B分泌到細(xì)胞外而將黃酮轉(zhuǎn)化成槲皮素積累在細(xì)胞內(nèi)，將銀杏內(nèi)酯B和槲皮素分離；
(2)本發(fā)明所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，不是單純的利用分離提純方法獲得大量的銀杏內(nèi)酯B和槲皮素，而是以去皮白果和大米為固體基質(zhì)添加銀杏葉提取物，以金耳為菌種通過(guò)固體前發(fā)酵，轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮，通過(guò)后發(fā)酵，使槲皮素和銀杏內(nèi)酯B得以分離，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，并可以同時(shí)生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B和槲皮素；
(3)本發(fā)明所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，工藝簡(jiǎn)單，且所得到的產(chǎn)品中，銀杏內(nèi)酯B純度大于90%，槲皮素純度大于95%，制取的純度較高。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法的制備流程不意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行描述。
[0020]實(shí)施例1
如圖1所示，一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，20°C培養(yǎng)15天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4 °C保存?zhèn)溆茫?br> (2)液體搖瓶培養(yǎng):將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取10塊接種于裝有150mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/分，溫度35°C的條件下，搖床培養(yǎng)18h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在130°C條件下滅菌360min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮5g，大米20g的原料；
(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為1%的接種量接種，在溫度為35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為0.2:1的通氣量條件下，培養(yǎng)96h，制成金耳種子罐菌種;所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在130°C條件下滅菌360 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮5g，大米20g的原料；
(4)固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為10%的接種量接種，在溫度20°C，濕度80%前發(fā)酵40天，其中每隔6天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在130°C條件下滅菌360 min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果200g、銀杏葉提取物50g和大米750g的原料;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1: 0.6的比例與水混合；
(5)液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(4)所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為10，在溫度為20°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為0.2:1的通氣量條件下發(fā)酵72h，所制得的發(fā)酵液體在2000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在130°C條件下滅菌60 min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有5g葡萄糖，4g蛋白胨和0.0lgK2HPO4 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0021]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的20倍體積的100%的乙醇，反復(fù)提取3次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶3小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為95%。
[0022]在本實(shí)施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物；
B2向步驟BI所得產(chǎn)物中加入重量的20倍的60%乙醇回流提取5次，得提取液二；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶18小時(shí)；
B4將步驟B3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入3倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其含量為90%。
[0023]所述的槲皮素含量的測(cè)定采用高效液相色譜法(齊寧利等:高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)同時(shí)測(cè)定苦蕎中蘆丁和槲皮素的含量.食品科技，2013，38(10):301-304):采用Intersil ODS-SP C 18柱(150 mmX4.6 !11111，54111)，流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸溶液(用磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)P 11至4.5)(40:60)，流速:1.0 m L/min，柱溫:35 °C，進(jìn)樣量:10 yL，檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm，以槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，根據(jù)不同濃度的槲皮素與對(duì)應(yīng)峰面積，進(jìn)行回歸得到槲皮素濃度與峰面關(guān)系方程，再根據(jù)樣品中槲皮素峰面積和稀釋倍數(shù)和回歸方程計(jì)算樣品中槲皮素含量。
[0024]所述的銀杏內(nèi)酯B含量的測(cè)定采用高效液相色譜-質(zhì)譜:配有高壓二元栗，沃特斯996二極管陣列檢測(cè)器和Agilent 1200系列自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱BEH (:_18柱(2.5 μπι，3.0Χ100 mm)的高效液相色譜(HPLC)用于分析銀杏內(nèi)酯。用甲醇和水(7:3)作為流動(dòng)相，流速為0.2 mL/ min進(jìn)行洗脫。安捷倫三級(jí)四極桿質(zhì)譜6400離子阱質(zhì)譜儀作為檢測(cè)器，在全掃描負(fù)離子電噴霧電離(ESI)(M/Z500-800)的模式運(yùn)行。離子阱質(zhì)譜儀，最條件高感光度為:ESI，負(fù)極性電離;噴霧電壓:4.0千伏;加熱毛細(xì)管溫度:275 °C;鞘氣(N2氣)流速:30 Arb;輔助/吹掃氣(N2氣);流速:50 Arb。以銀杏內(nèi)酯B標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，根據(jù)不同濃度的銀杏內(nèi)酯B與對(duì)應(yīng)峰面積，進(jìn)行回歸得到銀杏內(nèi)酯B濃度與峰面關(guān)系方程，再根據(jù)樣品中銀杏內(nèi)酯B峰面積和稀釋倍數(shù)和回歸方程計(jì)算樣品中銀杏內(nèi)酯B含量。
[0025]基于上述，本發(fā)明本發(fā)明在吸取中藥發(fā)酵制藥技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵各自的優(yōu)點(diǎn)，采用固態(tài)前發(fā)酵轉(zhuǎn)化銀杏活性成分黃酮和銀杏內(nèi)酯，克服了液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)(銀杏葉的活性成分)對(duì)金耳菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，同時(shí)利用深層發(fā)酵技術(shù)，金耳將銀杏內(nèi)酯B分泌到細(xì)胞外而將黃酮轉(zhuǎn)化成槲皮素積累在細(xì)胞內(nèi)，將銀杏內(nèi)酯B和槲皮素分離;并且本發(fā)明不是單純的利用分離提純方法獲得大量的銀杏內(nèi)酯B和槲皮素，而是以去皮白果和大米為固體基質(zhì)添加銀杏葉提取物，以金耳為菌種通過(guò)固體前發(fā)酵，轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮，通過(guò)后發(fā)酵，使槲皮素和銀杏內(nèi)酯B得以分離，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，并可以同時(shí)生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B和槲皮素;具有工藝簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，且所得到的產(chǎn)品中，銀杏內(nèi)酯B純度大于90%，槲皮素純度大于95%，制取的純度較高。
[0026]實(shí)施例2
一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)4天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)液體搖瓶培養(yǎng):將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取3塊接種于裝有20mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，溫度20°C的條件下，搖床培養(yǎng)86h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在100°C條件下滅菌90min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩20g，大米5g的原料；
(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為20%的接種量接種，在溫度為20 0C，攪拌轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為0.2?1.8:1的通氣量條件下，培養(yǎng)18h，制成金耳種子罐菌種;所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在100°C條件下滅菌90min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮20g，大米5g的原料；
(4)固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為2%的接種量接種，在溫度35°C，濕度80%前發(fā)酵20天，其中每隔3天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物；所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在100°C條件下滅菌90min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果400g、銀杏葉提取物30g和大米570g的原料;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1:1.5的比例與水混合；
(5)液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(4)所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為5，在溫度為35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為1.8:1的通氣量條件下發(fā)酵24h，所制得的發(fā)酵液體在6000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在100°C條件下滅菌30min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有40g葡萄糖，0.5g蛋白胨和0.0lgK2HPO4 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0027]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的5倍體積的60%的乙醇，反復(fù)提取5次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶18小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為99.9%。
[0028]在本實(shí)施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟: BI將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物；
B2向步驟BI所得產(chǎn)物中加入重量的5倍的60?100%乙醇回流提取3次，得提取液二；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶3小時(shí)；
B4將步驟B3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入10倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其含量為99.8%。
[0029]實(shí)施例3
一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)10天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4 °C保存?zhèn)溆茫?br> (2)液體搖瓶培養(yǎng):將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取7塊接種于裝有80mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分，溫度28°C的條件下，搖床培養(yǎng)57h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在120 °C條件下滅菌260min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮13g，大米13g的原料；
(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為10%的接種量接種，在溫度為28 0C，攪拌轉(zhuǎn)速為110轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為1:1的通氣量條件下，培養(yǎng)57h，制成金耳種子罐菌種;所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在120°C條件下滅菌260 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮13g，大米13g的原料；
(4)固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為6%的接種量接種，在溫度28°C，濕度80%前發(fā)酵30天，其中每隔4.5天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在120°C條件下滅菌260 min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果300g、銀杏葉提取物40g和大米660g的原料;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1:1的比例與水混合；
(5)液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(4)所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為8，在溫度為27°C，攪拌轉(zhuǎn)速為110轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為0.2-1.8的通氣量條件下發(fā)酵48h，所制得的發(fā)酵液體在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在120°C條件下滅菌45 min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有23g葡萄糖，2.2g蛋白胨和0.05gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0030]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的13倍體積的80%的乙醇，反復(fù)提取4次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶11小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為98%。
[0031]在本實(shí)施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物；
B2向步驟BI所得產(chǎn)物中加入重量的13倍的80%乙醇回流提取4次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶11小時(shí)；
B4將步驟B3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入7倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其含量為95%。
[0032]實(shí)施例4
一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，23°C培養(yǎng)12天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)液體搖瓶培養(yǎng):將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取8塊接種于裝有30mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為75轉(zhuǎn)/分，溫度20?350C的條件下，搖床培養(yǎng)30h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在100 °C條件下滅菌100 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮8g，大米12g的原料；
(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為4%的接種量接種，在溫度為25°C，攪拌轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為0.6:1的通氣量條件下，培養(yǎng)35h，制成金耳種子罐菌種;所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在100°C條件下滅菌100 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮8g，大米15g的原料；
(4)固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為4%的接種量接種，在溫度22°C，濕度80%前發(fā)酵25天，其中每隔3天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物；所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在100°C條件下滅菌100 min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果250g、銀杏葉提取物35g和大米715g的原料;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1: 0.6的比例與水混合；
(5)液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(4)所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為6，在溫度為24°C，攪拌轉(zhuǎn)速為65轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為1.5:1的通氣量條件下發(fā)酵60h，所制得的發(fā)酵液體在5000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在115°C條件下滅菌50 min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有30g葡萄糖，3g蛋白胨和0.09gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0033]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟: Al將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的18倍體積的95%的乙醇，反復(fù)提取3次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶4小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素純度大于95%。
[0034]在本實(shí)施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物；
B2向步驟BI所得產(chǎn)物中加入重量的18倍的95%乙醇回流提取4次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶17小時(shí)；
B4將步驟B3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入9倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其含量為92%。
[0035]實(shí)施例5
一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)6天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)液體搖瓶培養(yǎng):將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取4塊接種于裝有40mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分，溫度30°C的條件下，搖床培養(yǎng)36h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在128 °C條件下滅菌320min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮6g，大米20g的原料；
(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為15%的接種量接種，在溫度為30 0C，攪拌轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為0.6:1的通氣量條件下，培養(yǎng)68h，制成金耳種子罐菌種;所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在128 °C條件下滅菌320 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮15g，大米7g的原料；
(4)固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為6%的接種量接種，在溫度30°C，濕度80%前發(fā)酵28天，其中每隔5天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物；所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在128°C條件下滅菌320 min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果350g、銀杏葉提取物50g和大米600g的原料;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1: 1.2的比例與水混合；
(5)液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(4)所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為7，在溫度為30°C，攪拌轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為1.6:1的通氣量條件下發(fā)酵58h，所制得的發(fā)酵液體在3000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在128°C條件下滅菌60 min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有35g葡萄糖，0.5g蛋白胨和0.04gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0036]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的18倍體積的90%的乙醇，反復(fù)提取4次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶12小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為96%。
[0037]在本實(shí)施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物；
B2向步驟BI所得產(chǎn)物中加入重量的8倍的70%乙醇回流提取5次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶6小時(shí)；
B4將步驟B3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入4倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其含量為92%。
[0038]實(shí)施例6
一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)5天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)液體搖瓶培養(yǎng):將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取4塊接種于裝有20mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為170轉(zhuǎn)/分，溫度25°C的條件下，搖床培養(yǎng)60h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在110°C條件下滅菌250min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮16g，大米8g的原料；
(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為15%的接種量接種，在溫度為25 0C，攪拌轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為1.6:1的通氣量條件下，培養(yǎng)29h，制成金耳種子罐菌種;所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在110°C條件下滅菌250 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮14g，大米1g的原料；
(4)固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為6%的接種量接種，在溫度25°C，濕度80%前發(fā)酵26天，其中每隔5天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物；所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在110Γ條件下滅菌250 min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果276g、銀杏葉提取物33g和大米691g的原料;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1: 0.9的比例與水混合；
(5)液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(4)所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為9，在溫度為25°C，攪拌轉(zhuǎn)速為110轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為1.4:1的通氣量條件下發(fā)酵48h，所制得的發(fā)酵液體在3500轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在110°c條件下滅菌35 min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有34g葡萄糖，4g蛋白胨和0.03gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0039]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的16倍體積的70%的乙醇，反復(fù)提取5次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶12小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為98%。
[0040]在本實(shí)施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物；
B2向步驟BI所得產(chǎn)物中加入重量的1倍的70%乙醇回流提取4次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶8小時(shí)；
B4將步驟B3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入7倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其含量為94%。
[0041 ] 實(shí)施例7
一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，23°C培養(yǎng)13天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)液體搖瓶培養(yǎng):將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取10塊接種于裝有130mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分，溫度23°C的條件下，搖床培養(yǎng)36h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在115 °C條件下滅菌260 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮9g，大米20g的原料；
(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為15%的接種量接種，在溫度為210C，攪拌轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為0.3:1的通氣量條件下，培養(yǎng)81h，制成金耳種子罐菌種;所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在115°C條件下滅菌260 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮19g，大米18g的原料；
(4)固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為4%的接種量接種，在溫度21°C，濕度80%前發(fā)酵34天，其中每隔6天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物；所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在110Γ條件下滅菌250 min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果370g、銀杏葉提取物40g和大米590g的原料;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1: 0.7的比例與水混合；
(5)液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(4)所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為10，在溫度為21°C，攪拌轉(zhuǎn)速為60轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為1.4:1的通氣量條件下發(fā)酵66h，所制得的發(fā)酵液體在5700轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在110°C條件下滅菌35 min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有35g葡萄糖，5g蛋白胨和0.05gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0042]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的17倍體積的90%的乙醇，反復(fù)提取4次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶18小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為99.5%。
[0043]在本實(shí)施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物；
B2向步驟BI所得產(chǎn)物中加入重量的8倍的65%乙醇回流提取5次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶6小時(shí)；
B4將步驟B3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入5倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其含量為99%。
[0044]實(shí)施例8
一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，29°C培養(yǎng)10天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4 °C保存?zhèn)溆茫?br> (2)液體搖瓶培養(yǎng):將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取8塊接種于裝有60mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分，溫度33°C的條件下，搖床培養(yǎng)SOh，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在120 °C條件下滅菌300min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮19g，大米19g的原料；
(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為18%的接種量接種，在溫度為33 0C，攪拌轉(zhuǎn)速為140轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為1.6:1的通氣量條件下，培養(yǎng)90h，制成金耳種子罐菌種;所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在120°C條件下滅菌300 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮18g，大米18g的原料；
(4)固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為9%的接種量接種，在溫度33°C，濕度80%前發(fā)酵37天，其中每隔6天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物；所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在105°C條件下滅菌350 min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果400g、銀杏葉提取物30g和大米570g的原料;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1: 1.4的比例與水混合；
(5)液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(4)所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為10，在溫度為33°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為1.6:1的通氣量條件下發(fā)酵70h，所制得的發(fā)酵液體在5800轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在105°C條件下滅菌35 min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有38g葡萄糖，4g蛋白胨和0.09gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0045]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的19倍體積的100%的乙醇，反復(fù)提取5次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶16小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為99%。
[0046]在本實(shí)施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物；
B2向步驟BI所得產(chǎn)物中加入重量的18倍的98%乙醇回流提取5次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶17小時(shí)；
B4將步驟B3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入10倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其含量為98%。
[0047]實(shí)施例9
一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，24°C培養(yǎng)6天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)液體搖瓶培養(yǎng):將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取4塊接種于裝有24mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為58轉(zhuǎn)/分，溫度24°C的條件下，搖床培養(yǎng)20h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在100°C條件下滅菌100min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮5g，大米5g的原料；
(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為3%的接種量接種，在溫度為24°C，攪拌轉(zhuǎn)速為58轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為0.3:1的通氣量條件下，培養(yǎng)25h，制成金耳種子罐菌種;所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在100°C條件下滅菌100 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮5g，大米6g的原料；
(4)固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為3%的接種量接種，在溫度24°C，濕度80%前發(fā)酵23天，其中每隔3天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物；所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在100°C條件下滅菌150 min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果220g、銀杏葉提取物33g和大米747g的原料;所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1: 0.8的比例與水混合；
(5)液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(4)所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為6，在溫度為24°C，攪拌轉(zhuǎn)速為55轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為0.3:1的通氣量條件下發(fā)酵26h，所制得的發(fā)酵液體在2300轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在100°C條件下滅菌35 min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有6g葡萄糖，0.6g蛋白胨和0.02gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。
[0048]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的6倍體積的67%的乙醇，反復(fù)提取4次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶5小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為95%。
[0049]在本實(shí)施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物；
B2向步驟BI所得產(chǎn)物中加入重量的6倍的65%乙醇回流提取3次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶4小時(shí);B4將步驟B3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入4倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其含量為91%。
[0050]以上示意性的對(duì)本發(fā)明及其實(shí)施方式進(jìn)行了描述，該描述沒(méi)有限制性，實(shí)際的結(jié)構(gòu)并不局限于此。所以，如果本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員受其啟示，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造宗旨的情況下，不經(jīng)創(chuàng)造性的設(shè)計(jì)出與該技術(shù)方案相似的結(jié)構(gòu)方式及實(shí)施例，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制備方法以大米、去皮白果和銀杏葉提取物為主要原料，以金耳為出發(fā)菌株，依次經(jīng)過(guò)試管擴(kuò)大培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)和種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)、固體前發(fā)酵培養(yǎng)、液體后發(fā)酵培養(yǎng)及提取分離步驟制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體再分別經(jīng)過(guò)提取制得銀杏內(nèi)酯B和槲皮素晶體，其中銀杏內(nèi)酯B純度達(dá)到90%，槲皮素純度達(dá)到95%。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟: Al試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳中斜面菌種接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，制得金耳試管斜面菌種； A2液體搖瓶培養(yǎng):將步驟Al所制得的金耳試管斜面菌種接種到裝有液體搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，進(jìn)行培養(yǎng)，制得金耳液體搖瓶菌種； A3種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟A2所制得的金耳液體搖瓶菌種接種到種子罐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，制成金耳種子罐菌種； A4固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟A3所制得的金耳種子罐菌種接種到固體培養(yǎng)基中，并混合均勻，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，制得金耳固體發(fā)酵物； A5液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟A4所制得的金耳固體前發(fā)酵物轉(zhuǎn)移到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，進(jìn)行液體后發(fā)酵，制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的金耳菌絲體； A6提取分離:將步驟A5所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制備方法具體如下: BI試管擴(kuò)大培養(yǎng):將金耳試管中斜面菌種切成3X3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養(yǎng)基中，20?35°C培養(yǎng)4?15天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫? B2液體搖瓶培養(yǎng):將步驟BI所制得的試管斜面菌種切成3 X 3 mm小塊菌種，挑取3?10塊接種于裝有20?150mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為50?200轉(zhuǎn)/分，溫度20?35°C的條件下，搖床培養(yǎng)18-86h，制成液體搖瓶菌種； B3種子罐擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟B2所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基按體積比為I?20%的接種量接種，在溫度為20?3 5°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50?160轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基體積比為為0.2?1.8:1的通氣量條件下，培養(yǎng)18?96h，制成金耳種子罐菌種； B4固體前發(fā)酵培養(yǎng):將步驟B3所制得的金耳種子罐菌種接入裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋中，且所述金耳種子罐菌種與裝有固體前發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)袋按體積比為2?10%的接種量接種，在溫度20?35°C，濕度80%前發(fā)酵20?40天，其中每隔3?6天，翻袋一次，制得固體前發(fā)酵物； B5液體后發(fā)酵培養(yǎng):將步驟B4所制得的固體前發(fā)酵物粉碎至20目，加入到液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積與固體前發(fā)酵物的重量比為5?10，在溫度為20?43°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50?160轉(zhuǎn)/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比為0.2-1.8:1的通氣量條件下發(fā)酵24?72h，所制得的發(fā)酵液體在2000?6000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液和含有槲皮素的菌絲體； B6提取分離:將步驟A5所制得的含有槲皮素的金耳菌絲體和含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液分別經(jīng)過(guò)提取，得到槲皮素和銀杏內(nèi)酯B晶體。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟B2中所述液體搖瓶培養(yǎng)基是在100?130°C條件下滅菌90?360 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮5?20g，大米5?20g的原料。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟B3中所述種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)基是在100?130°C條件下滅菌90?360 min制得，且每升液體搖瓶培養(yǎng)基中含有麩皮5?20g，大米5?20g的原料。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟B4中所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基是在100?130°C條件下滅菌90?360 min制得，且每一千克固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中含有去皮白果200?400g、銀杏葉提取物30?50g和大米750?570g的原料。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述固體前發(fā)酵培養(yǎng)基中的原料按1:0.6?1.5的比例與水混合。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟B5中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基是在100?130°C條件下滅菌30?60 min制得，且每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基含有5?40g葡萄糖，0.5?4g蛋白胨和0.01?0.1gK2HPO^9.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟A6或步驟B6中所述從含有槲皮素的金耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟: Cl將所制得的金耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的5?20倍體積的60?100%的乙醇，反復(fù)提取3?5次，得提取液一； C2將步驟Cl所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結(jié)晶3?18小時(shí)，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素純度大于95%。10.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種利用金耳同時(shí)制備銀杏內(nèi)酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟A6或步驟B6中所述從含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液中制取銀杏內(nèi)酯B晶體的方法包括如下步驟: Dl將所制得的銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液減壓濃縮并干燥得產(chǎn)物； D2向步驟Dl所得產(chǎn)物中加入重量的5?20倍的60?100%乙醇回流提取3?5次，得提取液二； D3將步驟D2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結(jié)晶3?18小時(shí)； D4將步驟D3結(jié)晶后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復(fù)溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無(wú)水乙醇復(fù)溶，并加入3?10倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內(nèi)酯B，其純度大于90%。
【文檔編號(hào)】C12P17/18GK105838752SQ201610393912
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】俞建國(guó)
【申請(qǐng)人】河?？萍脊こ碳瘓F(tuán)有限公司