專利名稱：添加胰蛋白酶提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉胺酶產量的方法
技術領域：
一種添加胰蛋白酶提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉胺酶產量的方法，涉及吸水鏈霉菌發(fā)酵制備谷氨酰胺轉胺酶技術領域。
背景技術：
谷氨酰胺轉胺酶(Microbial transglutaminase，簡稱MTG)是一種催化?；D移反應的轉移酶，能催化蛋白質分子內、分子間發(fā)生交聯(lián)，蛋白質和氨基酸之間的連接以及蛋白質分子內谷氨酰胺基的水解反應，從而直接改變蛋白質本身以及蛋白質所附著的細胞、組織等的結構與功能性質的特性，提高蛋白質的營養(yǎng)價值，生產出滿足人們需求的新型蛋白食品?，F(xiàn)在谷氨酰胺轉胺酶已經廣泛應用在許多方面在食品加工過程中，可以保護食品蛋白質中的賴氨酸避免發(fā)生化學反應，從而保護限制性氨基酸，提高食品的營養(yǎng)價值；在肉制品加工中，谷氨酰胺轉胺酶的交聯(lián)作用將一些低價值的碎肉進行重組，從而改善其外觀、結構、風味，以提高其營養(yǎng)價值和市場價值；在水產品保鮮中，可通過形成可食性的薄膜，包埋脂類物質；在乳制品加工中，提高蛋白質的營養(yǎng)性；在醫(yī)藥工業(yè)中，谷氨酰胺轉胺酶包埋脂類或脂溶性物質，形成耐熱耐水性的膜；在非肉類的豆類食品中，提高食品的彈性和持水能力；在紡織行業(yè)，還被用來提高蠶絲織物以及羊毛織物的品質。
目前生產MTG的方法主要是微生物發(fā)酵法生產，目前商業(yè)化的產品主要由日本味之素等公司生產。國內用微生物發(fā)酵法生產MTG尚處于起步階段，菌種主要為茂原鏈霉菌，生產水平較低。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種添加胰蛋白酶提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉胺酶產量的方法。
本發(fā)明的技術方案菌種吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，CCTCC No.203062(中國專利03152956.92003年公開)，由江南大學生物工程學院環(huán)境生物技術研究室保藏和提供。
培養(yǎng)基麥汁斜面培養(yǎng)基(g/L)麥汁50，葡萄糖4，酵母膏4，瓊脂20，PH7.0。
種子培養(yǎng)基(g/L)甘油20，葡萄糖20，酵母膏5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH7.0發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)淀粉5，甘油20，葡萄糖5，蛋白胨15，冷榨豆餅粉30，酵母膏5，碳酸鈣5，NaH2PO45，Na2HPO45，Mg2SO45，pH8.0。
培養(yǎng)方法將成熟的孢子接種到麥汁斜面上，32℃下培養(yǎng)10～20d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長后期。吸取種子培養(yǎng)液，按4％～8％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)48h。
谷氨酰胺轉胺酶活力的測定方法發(fā)酵液經離心后的清液稀釋5倍后用于活力的測定。谷氨酰胺轉胺酶活力采用分光光度法在37℃下測定。吸取0.4mL稀釋樣品于試管中，加入1mL試劑A；37℃水浴保溫10min，加入0.4mL試劑B，終止反應，525nm波長比色。
試劑A將100mg底物CBZ-GLN-GLY(Nalpha-Carbobenzyloxy-Glutamine Glycine)完全溶解于2mL 0.2mol/L的NaOH溶液中，并加入4mLa溶液，2mL b溶液和2ml c溶液，調pH為6.0。[a溶液0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液，pH6.0；b溶液1mol/L羥胺；c溶液0.01mol/L GSH(還原型谷光甘肽)]。
試劑B3mol/L HCl，12％TCA(三氯乙酸)，5％FeCl3·6H2O(溶于0.1mol/LHCl中)按1∶1∶1混合配制。一個單位谷氨酰胺轉胺酶酶活定義(U/mL)37℃時每分鐘催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-單羥胺酸的酶量。
提高谷氨酰胺轉胺酶產量的培養(yǎng)方式谷氨酰胺轉胺酶是一種胞外酶，首先生成沒有酶活力的酶原，經蛋白酶切割后生成有活力的成熟酶。在普通的發(fā)酵過程中，由于蛋白酶抑制劑的存在，酶原只能在特定階段緩慢逐步地轉化為成熟酶。
在發(fā)酵過程中，適時添加適量的胰蛋白酶可以促進產酶，實現(xiàn)了谷氨酰胺轉胺酶的高表達?？梢允姑冈瓘囊划a生就開始大量迅速地轉化為成熟酶，從而使生物反應的平衡發(fā)生改變，產生更多的酶原，最終提高發(fā)酵的產酶量。在發(fā)酵至0-16h在發(fā)酵液中添加10-100U/mL的胰蛋白酶，發(fā)酵終了時發(fā)酵液中谷氨酰胺轉胺酶的酶活水平達5.6U/mL。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明選用的吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13合成的谷氨酰胺轉胺酶為胞外酶，并且是迄今為止已報道過的熱、堿穩(wěn)定性和蛋白質交聯(lián)特性都較好的谷氨酰胺轉胺酶，用于食品加工、醫(yī)藥行業(yè)以及紡織行業(yè)具有很大的潛力。所用的胰蛋白酶價格低廉，用量少，顯著提高了谷氨酰胺轉胺酶的產量，搖瓶培養(yǎng)的實驗水平達國內領先水平。
具體實施例方式
實施例1在谷氨酰胺轉胺酶發(fā)酵液中，在發(fā)酵的0h添加20U/ml的胰蛋白酶，發(fā)酵至結束時，發(fā)酵液中的谷氨酰胺轉胺酶產量為5.64U/mL，比不加胰蛋白酶的對照例提高了35.2％。不添加胰蛋白酶的發(fā)酵液中的谷氨酰胺轉胺酶產量為4.17U/mL。
實施例2在谷氨酰胺轉胺酶發(fā)酵液中，在發(fā)酵的16h添加50U/mL的胰蛋白酶，發(fā)酵至結束時，發(fā)酵液中的谷氨酰胺轉胺酶產量為5.24U/mL。
實施例3在谷氨酰胺轉胺酶發(fā)酵液中，在發(fā)酵的8h添加10u/ml的胰蛋白酶，發(fā)酵至結束時，發(fā)酵液中的谷氨酰胺轉胺酶產量為5.42U/mL。
權利要求
1.一種提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉胺酶產量的方法，其特征是采用吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，菌種保藏編號為CCTCC NO203062，作為出發(fā)菌株，經液體發(fā)酵制備谷氨酰胺轉胺酶，通過在發(fā)酵過程中添加胰蛋白酶，提高谷氨酰胺轉胺酶的發(fā)酵產酶量。。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是在發(fā)酵過程中添加胰蛋白酶，發(fā)酵至0-16h在發(fā)酵液中添加10-100U/mL的胰蛋白酶。
全文摘要
一種添加胰蛋白酶提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉胺酶產量的方法，涉及吸水鏈霉菌發(fā)酵制備谷氨酰胺轉胺酶技術領域。本發(fā)明采用吸水鏈霉菌為發(fā)酵菌株，經斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中經液體發(fā)酵制備谷氨酰胺轉胺酶。通過在發(fā)酵過程中添加胰蛋白酶，最終實現(xiàn)了提高谷氨酰胺轉胺酶產量的目標。本發(fā)明的優(yōu)點是所用胰蛋白酶用量較少，且價格低廉，可顯著提高谷氨酰胺轉胺酶的產量，在其它培養(yǎng)條件相同的情況下，本發(fā)明比不添加胰蛋白酶的對照例產量提高達35％，達到發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉胺酶的先進水平。
文檔編號C12R1/55GK1944632SQ200610097160
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月28日 優(yōu)先權日2006年10月28日
發(fā)明者陳堅, 堵國成, 程力, 張東旭 申請人:江南大學