專利名稱：一種提高普那霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及始旋鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物-普那霉素的生成工藝，屬于微生物工程領(lǐng)域，特別地，涉及一種提高普那霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
抗生素的長(zhǎng)期使用，尤其是不合理的使用，使臨床致病菌感染已成為目前醫(yī)學(xué)界一個(gè)十分嚴(yán)峻的問題，研制和開發(fā)具有抗耐藥菌能力的抗生素顯得非常迫切。由始旋鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)發(fā)酵產(chǎn)生的一種鏈陽(yáng)性菌素類抗生素——普那霉素(Pristinamycins，又名原始霉素)即是這樣的抗生素產(chǎn)品，它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較好的抗菌能力，不容易產(chǎn)生耐藥性。普那霉素由約30％的普那霉素I(由P1A、P1B和P1C組成)和約70％的普那霉素II(由PIIA和PIIB組成)構(gòu)成，其中PIA和PILA是普那霉素的主要組分。
在現(xiàn)有的普那霉素生產(chǎn)技術(shù)中，法國(guó)羅納普朗克羅爾公司(現(xiàn)為安萬(wàn)特公司)的專利技術(shù)(US 3154475，1964年；GB 998195，1965年)，采用始旋鏈霉菌菌株5647和NRRL 2958通過孢子培養(yǎng)、種子液、液體發(fā)酵培養(yǎng)的常規(guī)操作來(lái)制備，但普那霉素的發(fā)酵水平只有1190U/mL(相當(dāng)于0.15g/L)。金志華等人(浙江大學(xué)生物工程研究所)先前公開的專利技術(shù)(CN 1607245A，2005年)通過對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)普那霉素的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使始旋鏈霉菌菌株CGMCC0957發(fā)酵生產(chǎn)普那霉素的水平提高到了3000～5000U/mL(相當(dāng)于0.3～0.6g/L)。盡管如此，由于普那霉素為抗革蘭氏陽(yáng)性菌類抗生素，而生產(chǎn)菌始旋鏈霉菌本身即為革蘭氏陽(yáng)性菌，因此，在通過始旋鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)普那霉素的過程中很容易產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)生產(chǎn)菌的毒害作用，使生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成過程受到很大的抑制。與此同時(shí)，普那霉素在發(fā)酵后期還容易被發(fā)酵液中所存在的酶所降解。上述原因造成了普那霉素的發(fā)酵水平難以進(jìn)一步地提高，生產(chǎn)成本因此居高不下。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)始旋鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)普那霉素過程中所存在的產(chǎn)物抑制難題，提供一種能夠提高普那霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種提高普那霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將始旋鏈霉菌的孢子培養(yǎng)物接種到種子培養(yǎng)基中，制備得到種子培養(yǎng)液。
(2)再將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
(3)在發(fā)酵開始時(shí)或在發(fā)酵進(jìn)行過程中，加入一定量的已滅菌過的大孔吸附樹脂，直至發(fā)酵結(jié)束。
(4)過濾發(fā)酵液，收集所加入的大孔吸附樹脂，并將樹脂裝填于層析柱之中，通過洗脫溶劑解吸普那霉素，進(jìn)一步精制后制得較純的普那霉素產(chǎn)品。
進(jìn)一步地，所述步驟(3)中，所述加入的大孔吸附樹脂為Diaion HP-20樹脂、Amberlite XAD-2樹脂、Amberlite XAD-4樹脂、HZ-802樹脂、HZ-803樹脂、H-103樹脂、CAD-40樹脂或CAD-45樹脂；所述大孔吸附樹脂一次性加入到發(fā)酵液之中；所添加大孔吸附樹脂的濕態(tài)質(zhì)量為發(fā)酵液體積的2％～40％；樹脂的添加時(shí)間為發(fā)酵開始時(shí)，或發(fā)酵開始10～30小時(shí)后加入；所述大孔吸附樹脂分兩到三次加入到發(fā)酵液之中；每次所添加樹脂的濕態(tài)質(zhì)量為發(fā)酵液體積的2％～20％；兩到三次累計(jì)所添加樹脂的濕態(tài)總質(zhì)量不超過發(fā)酵液體積的40％；第一次樹脂的添加時(shí)間為發(fā)酵開始時(shí)，或發(fā)酵開始10～30小時(shí)后加入；第二次或第三次樹脂的添加時(shí)間為發(fā)酵開始10～30小時(shí)后加入；前后兩次樹脂添加的時(shí)間相隔為1～5小時(shí)；所述步驟(4)中，所述洗脫溶劑是質(zhì)量百分比為50～75％的丙酮溶液。
本發(fā)明的有益效果是，在普那霉素生產(chǎn)菌始旋鏈霉菌的發(fā)酵過程中，將能夠吸附普那霉素的大孔吸附樹脂直接加入到發(fā)酵液之中，實(shí)現(xiàn)了微生物發(fā)酵與發(fā)酵產(chǎn)物原位分離的耦合，使發(fā)酵液中的普那霉素始終維持在較低的水平，從而在很大程度上緩解了發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)生產(chǎn)菌的抑制作用，促進(jìn)了始旋鏈霉菌的生長(zhǎng)和普那霉素的生物合成，通過選擇大孔吸附樹脂的種類、添加量、添加時(shí)間和添加方式，可以將普那霉素的發(fā)酵產(chǎn)量提高到1.0～2.5g/L的水平，有效提高了普那霉素的產(chǎn)量，從而降低了普那霉素的生產(chǎn)成本。


圖1是實(shí)施例2的洗脫液中普那霉素的含量分析HPLC圖譜；圖2是對(duì)比實(shí)施例2的發(fā)酵液中普那霉素的含量分析HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的方法包括以下步驟(1)將始旋鏈霉菌的孢子培養(yǎng)物接種到種子培養(yǎng)基中，制備得到種子培養(yǎng)液；(2)再將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(3)在發(fā)酵開始時(shí)或在發(fā)酵進(jìn)行過程中，加入一定量的已滅菌過的大孔吸附樹脂，直至發(fā)酵結(jié)束；(4)過濾發(fā)酵液，收集所加入的大孔吸附樹脂，并將樹脂裝填于層析柱之中，采用合適的洗脫方式解吸普那霉素，進(jìn)一步精制后制得較純的普那霉素產(chǎn)品。
所采用的始旋鏈霉菌種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件，已如金志華等人先前公開的專利技術(shù)(CN 1607245A)所述。具體地，所采用的種子培養(yǎng)基主要含有2～5％的可利用碳源(如葡萄糖)和1～4％的有機(jī)氮源(如酵母粉)；將孢子培養(yǎng)物制成孢子懸浮液后接種到種子培養(yǎng)基中，或用挖塊法直接接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)制備種子；種子培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25～37℃，培養(yǎng)時(shí)間為36～60小時(shí)。所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基在主要含有4～8％的可利用碳源(如葡萄糖)和2～5％的有機(jī)氮源(如酵母粉)；將種子以1～20％(接入的種子液體積與發(fā)酵培養(yǎng)基體積的比例)的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵采用深層液體沉沒培養(yǎng)法，根據(jù)規(guī)模大小在搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行；如搖瓶發(fā)酵時(shí)裝液量為搖瓶體積的10～20％，搖床轉(zhuǎn)速為150～250轉(zhuǎn)/分；如在發(fā)酵罐中發(fā)酵時(shí)通過通入無(wú)菌空氣和攪拌來(lái)提供氧氣，通氣量為每分鐘每升發(fā)酵液0.5～1.5升無(wú)菌空氣，攪拌轉(zhuǎn)速為100～600轉(zhuǎn)/分；發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為28～32℃，培養(yǎng)時(shí)間為36～60小時(shí)。
所采用的樹脂為非極性或弱極性大孔吸附樹脂，其種類(牌號(hào))包括DiaionHP-20樹脂(日本Mitsubishi化學(xué)公司)、Amberlite XAD-2或Amberlite XAD-4樹脂(美國(guó)Rohm & Hass公司)、HZ-802或HZ-803樹脂(上海華震科技有限公司)、H-103樹脂(南開大學(xué)化工廠)、CAD-40或CAD-45樹脂(華北制藥廠)，優(yōu)先考慮選用HZ-802樹脂。
所選用的大孔吸附樹脂，可以在發(fā)酵開始時(shí)一次性加入，也可以在發(fā)酵開始10～30小時(shí)后加入，優(yōu)先考慮在發(fā)酵開始15～25小時(shí)后加入；所添加樹脂的濕態(tài)質(zhì)量(千克)為發(fā)酵液體積(升)的2％～40％，更適宜的添加量為10％～20％。
所選用的大孔吸附樹脂，還可以在發(fā)酵過程中分兩到三次加入到發(fā)酵液之中；每次所添加樹脂的濕態(tài)質(zhì)量(千克)為發(fā)酵液體積(升)的2％～20％，更適宜的添加量為5％～15％，兩到三次累計(jì)所添加樹脂的濕態(tài)總質(zhì)量(千克)不超過發(fā)酵液體積(升)的40％；第一次樹脂的添加時(shí)間為發(fā)酵開始時(shí)，或發(fā)酵開始10～30小時(shí)后加入，優(yōu)先考慮在發(fā)酵開始15～25小時(shí)后加入；第二次或第三次樹脂的添加時(shí)間為發(fā)酵開始10～30小時(shí)后加入，優(yōu)先考慮在發(fā)酵開始20～30小時(shí)后加入；前后兩次樹脂添加的時(shí)間相隔為1～5小時(shí)。
所采用的普那霉素從吸附樹脂上解吸的洗脫溶劑，為50～75％(質(zhì)量百分比)丙酮溶液，最好為70％的內(nèi)酮溶液；洗脫液體積為2～5倍層析柱床體積，洗脫流速為每小時(shí)0.5～2.0倍床體積，更合適的洗脫流速為0.8～1.2倍床體積。
所述的普那霉素的進(jìn)一步精制方法，采用如下方法將丙酮洗脫液加水稀釋，直至丙酮濃度為30％左右，加入0.1倍稀釋液體積的氯仿萃取稀釋液，減壓濃縮后加入正己烷使普那霉素沉淀出來(lái)，得到普那霉素粗品；粗品用丙酮溶解，過濾去除不溶物后經(jīng)過硅膠柱層析，以丙酮與正己烷的混合溶液作洗脫溶劑，分步收集各出峰部分，減壓濃縮、烘干后得到普那霉素純品。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案適用于任何能夠通過微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生普那霉素的菌種，特別適合于始旋鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)，該菌種在美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(ATCC)和美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部(NRRL)均有保存，編號(hào)分別為ATCC 25486和NRRL 2958，更特別適合于金志華等人先前的專利技術(shù)(CN 1607245A)中所采用的菌株Streptomyces pristinaespiralis CGMCC 0957。
實(shí)施例1在搖瓶中添加大孔吸附樹脂發(fā)酵生產(chǎn)普那霉素新工藝將已培養(yǎng)成熟的始旋鏈霉菌孢子培養(yǎng)物以挖塊法(挖塊大小為1×1平方厘米)接種到含有25毫升種子培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置于搖床中振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，搖床的轉(zhuǎn)速設(shè)定為220轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為28℃，當(dāng)種子液中始旋鏈霉菌的菌絲濃度達(dá)到20％對(duì)結(jié)束培養(yǎng)。將1.5毫升種子液接種到含有25毫升發(fā)酵培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置于搖床中振蕩培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速設(shè)定為250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為28℃，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第24小時(shí)，直接將已滅菌的HZ-802大孔吸附樹脂加入到發(fā)酵液之中，樹脂加量為2.1g濕重，發(fā)酵至第63小時(shí)結(jié)束。過濾分離出發(fā)酵液中的吸附樹脂，用8毫升濃度為70％的丙酮溶液分步洗脫二次，合并洗脫液，用HPLC法定量分析發(fā)酵液和洗脫液中的普那霉素含量，累計(jì)算出普納霉素的產(chǎn)量為1.72g/L，樹脂對(duì)普那霉素的吸附容量為18.75mg/g濕樹脂。
實(shí)施例2在5升發(fā)酵罐中添加大孔吸附樹脂發(fā)酵生產(chǎn)普那霉素新工藝將180毫升種子液接種到含有3升發(fā)酵培養(yǎng)基的5升發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中通入無(wú)菌壓縮空氣，通氣量為1.2升/(分鐘×升)，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分)，溫度控制為28℃。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第18小時(shí)時(shí)，將已滅菌的HZ-802大孔吸附樹脂用火焰法加入到發(fā)酵罐之中，樹脂加量為150克濕重；然后當(dāng)發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行到第25小時(shí)時(shí)，再用火焰法加入150克HZ-802濕樹脂，發(fā)酵直至第63小時(shí)結(jié)束。過濾分離出發(fā)酵液中的吸附樹脂，用1200毫升濃度為70％的丙酮溶液分步洗脫二次，合并洗脫液，用HPLC法定量分析發(fā)酵液和洗脫液中的普那霉素含量，累計(jì)算出普納霉素的產(chǎn)量為1.64g/L，樹脂對(duì)普那霉素的吸附容量為15.6mg/g濕樹脂。洗脫液中普那霉素的含量分析HPLC圖譜如圖1所示。
對(duì)比實(shí)施例1普那霉素?fù)u瓶發(fā)酵生產(chǎn)常規(guī)工藝與實(shí)施例1平行類似進(jìn)行，只是在發(fā)酵過程中不添加大孔吸附樹脂，結(jié)果是普那霉素的產(chǎn)量為0.58g/L，只相當(dāng)于實(shí)施例1的百分之三十四。
比較例2普那霉素發(fā)酵罐生產(chǎn)常規(guī)工藝與實(shí)施例2平行類似進(jìn)行，只是在發(fā)酵過程中不添加大孔吸附樹脂，結(jié)果是普那霉素的產(chǎn)量為0.47g/L，約為實(shí)施例2的百分之二十九。發(fā)酵液中普那霉素的含量分析HPLC圖譜如圖2所示。
上述實(shí)施例用來(lái)解釋說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高普那霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將始旋鏈霉菌的孢子培養(yǎng)物接種到種子培養(yǎng)基中，制備得到種子培養(yǎng)液。(2)再將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。(3)在發(fā)酵開始時(shí)或在發(fā)酵進(jìn)行過程中，加入一定量的已滅菌過的大孔吸附樹脂，直至發(fā)酵結(jié)束。(4)過濾發(fā)酵液，收集所加入的大孔吸附樹脂，并將樹脂裝填于層析柱之中，通過洗脫溶劑解吸普那霉素，進(jìn)一步精制后制得較純的普那霉素產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述加入的大孔吸附樹脂為Diaion HP-20樹脂、Amberlite XAD-2樹脂、Amberlite XAD-4樹脂、HZ-802樹脂、HZ-803樹脂、H-103樹脂、CAD-40樹脂或CAD-45樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述大孔吸附樹脂一次性加入到發(fā)酵液之中；所添加大孔吸附樹脂的濕態(tài)質(zhì)量為發(fā)酵液體積的2％～40％；樹脂的添加時(shí)間為發(fā)酵開始時(shí)，或發(fā)酵開始10～30小時(shí)后加入。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述大孔吸附樹脂分兩到三次加入到發(fā)酵液之中；每次所添加樹脂的濕態(tài)質(zhì)量為發(fā)酵液體積的2％～20％；兩到三次累計(jì)所添加樹脂的濕態(tài)總質(zhì)量不超過發(fā)酵液體積的40％；第一次樹脂的添加時(shí)間為發(fā)酵開始時(shí)，或發(fā)酵開始10～30小時(shí)后加入；第二次或第三次樹脂的添加時(shí)間為發(fā)酵開始10～30小時(shí)后加入；前后兩次樹脂添加的時(shí)間相隔為1～5小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述洗脫溶劑是質(zhì)量百分比為50～75％的丙酮溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高始旋鏈霉菌(Streptomycespristinaespiralis)發(fā)酵產(chǎn)物——普那霉素(Pristinamycin，又名原始霉素)產(chǎn)量的方法。通過將大孔吸附樹脂直接添加于發(fā)酵液之中，實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵與產(chǎn)物分離的原位耦合，在很大程度上緩解了普那霉素對(duì)生產(chǎn)菌的抑制作用，同時(shí)避免了普那霉素在發(fā)酵后期容易被降解的可能性。通過選擇大孔吸附樹脂的種類、添加量、添加時(shí)間和添加方式，可以將普那霉素的發(fā)酵水平提高到1.0～2.5g/L，有效提高了普那霉素的產(chǎn)量，從而降低了普那霉素的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1876827SQ200610050350
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月14日
發(fā)明者金志華, 雷引林, 賈波, 李寧惠, 陶正利, 吳亞銘, 梅樂和 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院