專利名稱：一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高發(fā)酵法產(chǎn)硫酸軟骨素產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)又名康得靈，是一種糖胺聚糖類多糖，其二糖單體由葡糖醛酸(D-GlcUA)與N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β _1，3鍵相連。硫酸軟骨素具有廣泛的生物活性，主要用于神經(jīng)性頭痛、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛等，作為安全有效的保健食品和藥品在世界各國(guó)有廣泛的應(yīng)用。目前，硫酸軟骨素主要是以堿或酶提取法從動(dòng)物軟骨中提取生產(chǎn)，傳統(tǒng)生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法存在原材料匱乏、不容易形成規(guī)模、收集原料的成本高、質(zhì)量不穩(wěn)定、純度不好控制、提取復(fù)雜、生產(chǎn)造成污染等諸多問(wèn)題。近幾年，國(guó)外不斷有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)一些菌株可發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素的類似物，微生物發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素或軟骨素類似物的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。發(fā)酵法成本低、污染小，成為最具經(jīng)濟(jì)效益和開(kāi)發(fā)潛力的硫酸軟骨素生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素產(chǎn)量的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案使用篩選的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis BN)為生產(chǎn)菌株，在實(shí)驗(yàn)室條件下，利用單因素法和正交實(shí)驗(yàn)分別對(duì)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵優(yōu)化。菌種實(shí)驗(yàn)室篩選的產(chǎn)硫酸軟骨素的枯草芽孢桿菌本發(fā)明的有益效果利用本發(fā)明能夠有效提高硫酸軟骨素的產(chǎn)量，為硫酸軟骨素的生產(chǎn)提供了新途徑。硫酸軟骨素的產(chǎn)量由177mg/L提高至449mg/L，提高幅度為153%， 效果顯著。本發(fā)明通過(guò)提供一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)硫酸軟骨素的策略，對(duì)今后發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素工業(yè)化實(shí)現(xiàn)具有一定的指導(dǎo)意義。
具體實(shí)施例方式對(duì)照實(shí)施例本發(fā)明所用菌種為實(shí)驗(yàn)室篩選的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis BN)。從斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接菌體于基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基中，繪制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線，確定最佳接種時(shí)間為12h，對(duì)基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化確定培養(yǎng)基最佳組成。從最佳種子培養(yǎng)基中按10%接種量接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，確定最佳發(fā)酵周期為32h，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化確定發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。以上培養(yǎng)基條件溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，500mL搖瓶裝液量為50mL。斜面固體培養(yǎng)基大豆蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，NaClO. 5%，瓊脂2%，pH值 7. 0 7. 2。
基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基大豆蛋白胨1. 0%，NaCll%，酵母提取物0. 5%。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖1. 5 %，大豆蛋白胨0. 8 %，酵母粉0.8%，K2HPO4 · 3H20 0. 04%, KH2PO4 0. 04%。最佳種子培養(yǎng)基葡萄糖1.5%，大豆蛋白胨0. 8 %，酵母粉0. 8 %，K2HPO4 · 3H20 0. 04%, KH2PO4 0. 04%。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖4%，酵母粉 5. 5%,K2HPO4 0. 15%,KH2PO4 ·3Η20 0. 15%, MgSO4 · 7Η20 0. 04%, MnCl2 · 4Η20 0· 02%。實(shí)施例1 發(fā)酵條件同對(duì)照例，利用單因素法和正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)種子培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)優(yōu)化前后接種的菌齡不變，但是菌濃0D_由初始的2. 9增加到12. 8，菌體濃度增加了 341%。實(shí)施例2 發(fā)酵條件同對(duì)照例，利用單因素和正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后發(fā)酵周期不變，發(fā)酵液中菌體濃度由3. 6g/L提高至6. 7g/L發(fā)酵液中硫酸軟骨素含量177mg/L提高至449mg/L，提高幅度為153%。
權(quán)利要求
1.一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素產(chǎn)量的方法，其特征是使用篩選的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis BN)為生產(chǎn)菌株，培養(yǎng)溫度為37 °C，200rpm，搖瓶裝液量為 50mL/500mL，接種量10%條件下分別對(duì)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化；種子培養(yǎng)基葡萄糖 1. 5%，大豆蛋白胨0. 8%，酵母粉 0. 8%，Κ2ΗΡ0 4·3Η20 0. 04%,KH2PO4 0. 04% 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 4%，酵母粉 5. 5%，K2HPO4 0. 15%, KH2PO4 ‘ 3Η20 0. 15%, MgSO4 ‘ 7Η20 0. 04%, MnCl2 · 4Η20 0. 02%ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于接種菌齡為12-13h，發(fā)酵周期為32h，發(fā)酵液中硫酸軟骨素含量由177mg/L提高至449mg/L，提高幅度為153%。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以產(chǎn)硫酸軟骨素的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis BN)為生產(chǎn)菌株，利用單因素和正交實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，確定接種菌齡為12-13h，發(fā)酵周期為32h，最佳種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成。本發(fā)明有效提高了硫酸軟骨素的產(chǎn)量(153％)，為實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素這一新方法提供借鑒。
文檔編號(hào)C12R1/125GK102337312SQ20111031739
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者劉佳, 劉立明, 吳秋林 申請(qǐng)人:江南大學(xué)