專利名稱：20(s)-原人參二醇-3-酮的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三萜類化合物的提取分離方法，具體涉及20(s)_原人參二醇-3-酮的提取分離方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。劉星堦研究發(fā)現(xiàn)人參二醇型皂苷元和人參二醇葡萄糖苷(尤其是人參皂苷Rh2)具有高度細胞毒活性(達瑪烷型三萜研究的進展，國外醫(yī)學(xué)·藥學(xué)分冊，1987，3，141-144)。
研究發(fā)現(xiàn)20 (S)-原人參二醇-3-酮是俄羅斯學(xué)者Morita M.和Atopkina, L. N.等將樺葉烯三醇轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh2及其它人參皂苷化學(xué)合成研究中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物 (王紅燕等，人參化學(xué)成分研究的新進展，中國藥物化學(xué)雜志，1992，2 (I) 64-70)0因此通過 20 (s)-原人參二醇-3-酮合成的化學(xué)產(chǎn)物能開發(fā)成為抗腫瘤藥物的藥效物質(zhì)成分。
目前通常采用合成方法制備20(S)-原人參二醇-3-酮，工藝復(fù)雜。周媛媛等首次從青龍衣中分離得到20(s)_原人參二醇-3-酮(周媛媛等，中草藥，2010，41(1) :11_14)， 但分離過程復(fù)雜，尤其是反復(fù)硅膠柱層析過程，需要技術(shù)人員的經(jīng)驗判斷，不斷調(diào)整實驗參數(shù)，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，且產(chǎn)率較低。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種步驟明確、且產(chǎn)率較高的20 (S)-原人參二醇-3-酮的提取分離方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種20(s)_原人參二醇-3-酮的提取分離方法，包括以下步驟(O提取取干燥的青龍衣藥材，乙醇提取，提取液濃縮得乙醇浸膏；乙醇的濃度為 90% 100%,優(yōu)選 95% ；(2)萃取分離將步驟(I)中制備的乙醇浸膏加水制備懸浮液，依次采用二氯甲烷萃和乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液濃縮得乙酸乙酯浸膏；(3)硅膠柱層析取步驟(2)中制備的乙酸乙酯浸膏進行硅膠柱層析，依次采用體積比為15:1 10:1 (優(yōu)選體積比為15:1)的石油醚和乙酸乙酯混合液、體積比為8:1 5:1的石油醚和乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，收集體積比為8:1 5: I (優(yōu)選體積比為5:1)的石油醚和乙酸乙酯混合洗脫液；石油醚的沸程為60 90°C ；(4)二次硅膠柱層析將步驟(3)中收集的洗脫液進行硅膠柱層析，采用二氯甲烷和甲醇的混合液進行等度洗脫或梯度洗脫；采用等度洗脫時，所述二氯甲烷和甲醇的體積比為 8:1，收集2. 5個柱體積后的洗脫液；采用梯度洗脫時(優(yōu)選洗脫方式)，依次采用的體積比為12:1的二氯甲烷和甲醇混合液、體積比為8:1的二氯甲烷和甲醇混合液進行梯度洗脫， 收集體積比為8:1的二氯甲烷和甲醇混合洗脫液；(5)反相柱層析取步驟(4)中收集的洗脫液，進行C18反相柱層析，依次采用30%甲醇和60%的甲醇進行梯度洗脫；收集60%甲醇洗脫液，回收溶劑，即得20(s)_原人參二醇-3-酮。
將20(s)_原人參二醇-3-酮進行甲醇重結(jié)晶即得純度更高的產(chǎn)品。
其中，步驟(I)中乙醇的用量為每克藥材采用6 IOml (優(yōu)選8ml )，優(yōu)選提取方式米用超聲提取O. 5 I. 5h,最佳提取時間50min,反復(fù)提取一次,合并提取液。
步驟(2)中混懸液制備時加入蒸餾水的重量為乙醇浸膏的5倍，采用占所述蒸餾水體積的O. 75 I倍量(優(yōu)選等體積量)的二氯甲烷和乙酸乙酯依次進行兩相回流萃取lh。
步驟(3)和步驟(4)中硅膠柱層析均采用干法上樣，拌樣硅膠采用80 100目硅膠，裝柱硅膠采用200 300目硅膠。其中，步驟(3)中乙酸乙酯浸膏與拌樣硅膠的重量比為1:1. 5，乙酸乙酯浸膏與裝柱硅膠的重量比為1:20 ;步驟(4)中進行柱層析前，先將步驟(3)中收集的洗脫液濃縮至浸膏，浸膏進行干法上樣，浸膏與拌樣硅膠的重量比為1:1，浸膏與裝柱硅膠的重量比為1:30。
步驟(5)中C18反相柱采用預(yù)先處理好的體積為2cmX IOOcm的常壓敞口玻璃層析色譜柱(C-18反相填料為YMC公司生產(chǎn)，填料粒徑彡50// m)，洗脫液流速為lml/min。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點本發(fā)明提取分離方法采用兩次柱層析和一次反相柱層析替代多次反復(fù)的柱層析，步驟簡略，且每次柱層析的收集段明確，無需進行經(jīng)驗判斷，避免了誤差和損耗；同時采用二氯甲烷替代氯仿，降低了毒性和對環(huán)境的污染。在柱層析分離前依次采用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，分取乙酸乙酯段更加有效地富集了目標(biāo)化合物的極性段，減少了柱層析的分離步驟。利用本發(fā)明提取分離方法能有效制備20 (S)-原人參二醇-3-酮，制備方法簡單，步驟明確，適合工業(yè)化生產(chǎn)。制得的化合物純度高，且產(chǎn)率較現(xiàn)有技術(shù)提高了一倍。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明20 (S)-原人參二醇-3-酮的提取分離方法進行詳細說明。
實施例一(1)采集當(dāng)年8月中上旬產(chǎn)核桃青皮，在陰涼通風(fēng)處晾干后，粉碎，過40目篩，稱重5kg。 按藥材溶劑=l:6(g/ml)加入濃度為95%乙醇充分混勻后浸泡20min，在35 40°C、40KHz 下超聲提取30min，濾過，藥渣如上述方法再超聲提取I次，合并兩次95%乙醇液，減壓回收乙醇得浸膏252g。(利用超聲提取，能有效減少溶劑、能源等生產(chǎn)成本的消耗，達到對藥材資源的充分利用)(2)將252g浸膏按1:5比例用1260ml蒸餾水混懸后放入5000ml圓底燒瓶中，再加入 1260ml 二氯甲烷在40 45°C加熱條件下進行兩相回流萃取lh，靜置放冷后分取二氯甲烷層；剩余水相再加入IOOOml乙酸乙酯在80 85°C加熱條件下進行兩相回流萃取lh，靜置放冷后分取乙酸乙酯層，回收溶劑得乙酸乙酯浸膏A 59. 5g。
(3)用250ml甲醇分散乙酸乙酯浸膏A，按I: I. 5加入硅膠(80 100目)約90g進行拌樣蒸干，處理后樣品加入按1:20比例取1200g硅膠(200 300目)干法裝入常壓敞口玻璃層析柱，石油醚(60 90°C):乙酸乙酯(15:1和5:1)進行梯度洗脫，其中石油醚(60 90°C ):乙酸乙酯(15:1)洗脫3. 5個柱體積棄去，石油醚(60 90°C ):乙酸乙酯(5:1)洗脫5個柱體積，收集5:1的洗脫部位，濃縮得浸膏B 16. 2g。
(4)將浸膏B按I: I加入硅膠(80 100目)16. 2g進行拌樣蒸干，處理后樣品加入按1:30比例取約500g硅膠(200 300目)干法裝入常壓敞口玻璃層析柱，用二氯甲烷 甲醇(8:1)進行等度洗脫，棄去前2. 5個柱體積后，收集3個柱體積，濃縮得浸膏C 3. lg。
(5)將C加入甲醇45°C加熱溶解，濾過，加入預(yù)先處理好的體積為2cmX IOOcm的常壓敞口玻璃層析色譜柱中(C-18反相填料為YMC公司生產(chǎn)，填料粒徑彡50//m)，用30% 甲醇以lml/min流速洗脫，收集前段1500ml洗脫液棄去，然后用60%甲醇洗脫，收集洗脫液3000ml，回收溶劑至干。用甲醇進行重結(jié)晶，即得20(S)_原人參二醇-3-酮。制得產(chǎn)品 26mg,純度為 98. 3%。
實施例二(I)取實施例一中制備的干燥藥材5kg。按藥材溶劑=l:8(g/ml)加入濃度為95%乙醇充分混勻后浸泡20min，在35 40°C、40KHz下超聲提取50min，濾過，藥渣如上述方法再超聲提取I次，合并兩次95%乙醇液，減壓回收乙醇得浸膏260g。
(2)將乙醇浸膏按1:5比例用蒸餾水混懸后放入5000ml圓底燒瓶中，再加入等體積的二氯甲烷在40 45°C加熱條件下進行兩相回流萃取lh，靜置放冷后分取二氯甲烷層； 剩余水相再加入等體積的乙酸乙酯在80 85°C加熱條件下進行兩相回流萃取lh，靜置放冷后分取乙酸乙酯層，回收溶劑得乙酸乙酯浸膏A 65g。
(3)用250ml甲醇分散乙酸乙酯浸膏A，按I: I. 5加入硅膠(80 100目)進行拌樣蒸干，處理后樣品加入按1:20比例取硅膠(200 300目)干法裝入常壓敞口玻璃層析柱，石油醚(60 90°0:乙酸乙酯(15:1和5:1)進行梯度洗脫，其中石油醚(60 90°C ): 乙酸乙酯(15:1)洗脫3. 5個柱體積棄去，石油醚(60 90°C):乙酸乙酯(5:1)洗脫5個柱體積，收集5:1的洗脫部位，濃縮得浸膏B 18g。
(4)將浸膏B按I: I加入硅膠(80 100目)進行拌樣蒸干，處理后樣品加入按 I 30比例取硅膠(200 300目)干法裝入常壓敞口玻璃層析柱，用二氯甲烷甲醇(12:1和 8:1)進行梯度洗脫，其中二氯甲烷甲醇(12:1)洗脫4個柱體積，二氯甲烷甲醇(8:1)洗脫3個柱體積，收集8:1的洗脫部位，濃縮得浸膏C 4g。
(5)將C加入甲醇45°C加熱溶解，濾過，加入預(yù)先處理好的體積為2cmX IOOcm的常壓敞口玻璃層析色譜柱中(C-18反相填料為YMC公司生產(chǎn)，填料粒徑彡50//m)，用30% 甲醇以lml/min流速洗脫，收集前段1500ml洗脫液棄去，然后用60%甲醇洗脫，收集洗脫液3000ml，回收溶劑至干。用甲醇進行重結(jié)晶，即得20(S)_原人參二醇-3-酮。制得產(chǎn)品 32mg，純度為 99. 2%。
實施例三(I)取實施例一中制備的干燥藥材5kg。按藥材溶劑=1:10 (g/ml)加入濃度為90%乙醇中，在35 40°C、40KHz下超聲提取I. 5h，濾過，藥渣如上述方法再超聲提取I次，合并兩次90%乙醇液，減壓回收乙醇得浸膏269g。
(2)將乙醇浸膏按1:5比例用蒸餾水混懸后放入5000ml圓底燒瓶中，再加入等體積的二氯甲烷在40 45°C加熱條件下進行兩相回流萃取lh，靜置放冷后分取二氯甲烷層； 剩余水相再加入等體積的乙酸乙酯在80 85°C加熱條件下進行兩相回流萃取lh，靜置放冷后分取乙酸乙酯層，回收溶劑得乙酸乙酯浸膏A 68g。
(3)用250ml甲醇分散乙酸乙酯浸膏A，按I: I. 5加入硅膠(80 100目)進行拌樣蒸干，處理后樣品加入按1:20比例取硅膠(200 300目)干法裝入常壓敞口玻璃層析柱，石油醚(60 90°C):乙酸乙酯(10:1和8:1)進行梯度洗脫，其中石油醚(60 90°C) 乙酸乙酯(10:1)洗脫2. 5個柱體積棄去，石油醚(60 90°C):乙酸乙酯(8:1)洗脫6. 5個柱體積，收集8:1的洗脫部位，濃縮得浸膏B 18. 6g。
(4)將浸膏B按I: I加入硅膠(80 100目)進行拌樣蒸干，處理后樣品加入按 I 30比例取硅膠(200 300目)干法裝入常壓敞口玻璃層析柱，用二氯甲烷甲醇(12:1和 8:1)進行梯度洗脫，其中二氯甲烷甲醇(12:1)洗脫4個柱體積，二氯甲烷甲醇(8:1)洗脫3個柱體積，收集8:1的洗脫部位，濃縮得浸膏C 3.5g。
(5)將C加入甲醇45°C加熱溶解，濾過，加入預(yù)先處理好的體積為2cmX IOOcm的常壓敞口玻璃層析色譜柱中(C-18反相填料為YMC公司生產(chǎn)，填料粒徑彡50//m)，用30% 甲醇以lml/min流速洗脫，收集前段1500m l洗脫液棄去，然后用60%甲醇洗脫，收集洗脫液3000ml，回收溶劑至干。用甲醇進行重結(jié)晶，即得20(S)_原人參二醇-3-酮。制得產(chǎn)品 27mg，純度為 97. 8%。
權(quán)利要求
1.一種20 (S)-原人參二醇-3-酮的提取分離方法，其特征在于包括以下步驟 (1)提取取干燥的青龍衣藥材，乙醇提取，提取液濃縮得乙醇浸膏；所述乙醇的濃度為 90% 100% ； (2)萃取分離將步驟(I)中制備的乙醇浸膏加水制備懸浮液，依次采用二氯甲烷萃和乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液濃縮得乙酸乙酯浸膏； (3)硅膠柱層析取步驟(2)中制備的乙酸乙酯浸膏進行硅膠柱層析，依次采用體積比為15:1 10:1的石油醚和乙酸乙酯混合液、體積比為8:1 5:1的石油醚和乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，收集體積比為8:1 5:1的石油醚和乙酸乙酯混合洗脫液；所述石油醚的沸程為60 90°C ; (4)二次硅膠柱層析將步驟(3)中收集的洗脫液進行硅膠柱層析，采用二氯甲烷和甲醇的混合液進行等度洗脫或梯度洗脫；采用等度洗脫時，所述二氯甲烷和甲醇的體積比為8:1，收集2.5個柱體積后的洗脫液；采用梯度洗脫時，依次采用的體積比為12:1的二氯甲烷和甲醇混合液、體積比為8:1的二氯甲烷和甲醇混合液進行梯度洗脫，收集體積比為8:1的二氯甲烷和甲醇混合洗脫液； (5)反相柱層析取步驟(4)中收集的洗脫液，進行C18反相柱層析，依次采用30%甲醇和60%的甲醇進行梯度洗脫；收集60%甲醇洗脫液，回收溶劑，即得20 (s)-原人參二醇-3-酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的20(s)-原人參二醇-3-酮的提取分離方法，其特征在于所述步驟(3)中梯度洗脫依次采用15:1的石油醚和乙酸乙酯混合液、體積比為5:1的石油醚和乙酸乙酯混合液進行洗脫，收集體積比為5:1的石油醚和乙酸乙酯混合洗脫液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的20(s)-原人參二醇-3-酮的提取分離方法，其特征在于所述步驟(4)中進行硅膠柱層析時，先將步驟(3)中收集的洗脫液濃縮至浸膏，干法上樣，硅膠柱中硅膠的重量為上樣浸膏重量的30倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的20(s)-原人參二醇-3-酮的提取分離方法，其特征在于所述步驟(I)中乙醇的用量為每克藥材采用6 10mL，采用超聲提取O. 5 1.5h，反復(fù)提取一次，合并提取液；所述步驟(2)中混懸液制備時加入蒸餾水的重量為乙醇浸膏的5倍，采用占所述蒸餾水體積的O. 75 I倍量的二氯甲烷和乙酸乙酯依次進行兩相回流萃取Ih ；所述步驟(5)中洗脫液的流速為lmL/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的20(s)-原人參二醇-3-酮的提取分離方法，其特征在于所述步驟(I)中乙醇的濃度為95%，用量為每克藥材采用8毫升，采用超聲提取50min，反復(fù)提取一次，合并提取液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的20(s)-原人參二醇-3-酮的提取分離方法，其特征在于所述步驟(5)制備的20 (s)-原人參二醇-3-酮采用甲醇進行重結(jié)晶，即得產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種20(s)-原人參二醇-3-酮的提取分離方法，將干燥的青龍衣藥材通過乙醇提取，二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取、兩次硅膠柱層析和一次反相柱層析，得到純化的20(s)-原人參二醇-3-酮目標(biāo)化合物。利用本發(fā)明提取分離方法能有效制備20(s)-原人參二醇-3-酮，制備方法簡單，步驟明確，適合工業(yè)化生產(chǎn)。且制得的化合物純度高，產(chǎn)率高。
文檔編號C07J9/00GK102977176SQ20121056055
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者周媛媛, 于瑩, 付蕾 申請人:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)