本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種吸附固定化發(fā)酵生產(chǎn)β‐聚蘋(píng)果酸的工藝。

背景技術(shù)：

聚蘋(píng)果酸(Poly malic acid或Poly malate,簡(jiǎn)稱(chēng)為PMLA)是以蘋(píng)果酸為唯一單體的均聚高分子聚合物，屬于聚酯類(lèi)聚合物。由于蘋(píng)果酸含有兩個(gè)羧基和一個(gè)羥基，其相互酯化的產(chǎn)物主要有三種，即α型、β型、γ型PMLA，生物體內(nèi)存在的只有β型PMLA。

聚蘋(píng)果酸結(jié)構(gòu)中懸掛有可修飾的羧基，使其可作為一種分子基質(zhì)與天然配體或合成配體發(fā)生特異性作用，而制得聚蘋(píng)果酸酯等衍生物，這為新材料研究提供了素材，并可得到大量具有特殊功能的新聚合物。研究發(fā)現(xiàn)聚蘋(píng)果酸具有良好的水溶性、可化學(xué)衍生性、可降解性、可再生性和生物安全性等特點(diǎn)。在生物制藥領(lǐng)域，聚蘋(píng)果酸可作為微膠囊材料及藥物載體。聚蘋(píng)果酸具有較大的溶水性和吸水性，可以作為吸水材料使用，也可以用作化妝產(chǎn)品。聚蘋(píng)果酸對(duì)一些生物物質(zhì)(如豌豆、土豆、蛋清蛋白等)的蛋白酶和某些微生物的DNA聚合酶有抑制作用，可阻止某些生物的生長(zhǎng)和繁殖。因此也可作為包裝材料應(yīng)用于食品生產(chǎn)加工。

目前，聚蘋(píng)果酸的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩種，化學(xué)法合成聚蘋(píng)果酸，只有內(nèi)酯開(kāi)環(huán)法，該方法形成內(nèi)酯的步驟較多、產(chǎn)率低、反應(yīng)溫度高、中間產(chǎn)物分離提純繁瑣，制約了該方法的發(fā)展。 生物途徑制備的聚蘋(píng)果酸主要是通過(guò)微生物發(fā)酵合成，生物合成聚蘋(píng)果酸具有突出的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)微生物發(fā)酵，產(chǎn)物均為β型，產(chǎn)物分子量高、生產(chǎn)條件溫和、生成產(chǎn)物純度較高。但微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋(píng)果酸，文獻(xiàn)中大多都是通過(guò)菌種誘變、培養(yǎng)基優(yōu)化來(lái)提高聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量，發(fā)酵工藝上也主要是控制溶氧、PH等手段，對(duì)于使用固定化技術(shù)進(jìn)行發(fā)酵鮮有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種吸附固定化發(fā)酵生產(chǎn)β‐聚蘋(píng)果酸的工藝，能耗低、投資小，設(shè)備利用率高。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種吸附固定化發(fā)酵生產(chǎn)β‐聚蘋(píng)果酸的工藝，包括如下步驟：(1)種子培養(yǎng)，將吸附固定化材料固定在發(fā)酵罐中，加入種子培養(yǎng)基，接入聚蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌株，培養(yǎng)80‐120h，實(shí)現(xiàn)聚蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌株在吸附固定化材料上的吸附固定；(2)發(fā)酵培養(yǎng)，再將發(fā)酵罐內(nèi)的種子培養(yǎng)基替換為發(fā)酵培養(yǎng)基，利用已固定化的聚蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌株單批次固定化發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋(píng)果酸；(3)聚蘋(píng)果酸的測(cè)定。

進(jìn)一步地，所述吸附固定化材料為網(wǎng)狀固定化材料，包含網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的植物纖維(如紗布、絲瓜巾)、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的人造纖維(如尼龍纖維)或金屬網(wǎng)狀材料(如不銹鋼絲網(wǎng))，吸附固定化材料表面布滿(mǎn)孔隙已保證氧氣的正常擴(kuò)散與底物、產(chǎn)物的正常運(yùn)輸。

進(jìn)一步地，所述聚蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌株在吸附固定化材料上的吸附是指聚蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌株依靠菌體自身吸附作用吸附于固定化材料上，聚 蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌株無(wú)需包埋。

進(jìn)一步地，所述吸附固定化材料固定于發(fā)酵罐內(nèi)但不影響攪拌。

進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)是將出芽短梗霉菌株活化2～3h，然后用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面菌株的孢子，制備孢子懸浮液；按照10％的接種量將孢子懸液轉(zhuǎn)接到含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml的擋板瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為180‐200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為36‐42h。

進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖120‐140g/L，酵母膏2.5‐3g/L，硫酸銨0.7‐1g/L，丁二酸1.6‐2g/L，玉米漿0.08‐0.1v/v，K2CO3 0.2‐0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.08‐0.1g/L，KH2PO4 0.8‐1g/L，ZnSO4·7H2O 0.03‐0.05g/L，其余為蒸餾水。

進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)是接種口在火焰保護(hù)下，將所得種子液以10％(v/v)的量接于裝有3L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速300‐400r/min，通風(fēng)比1:1‐1:1.5，罐壓0.05‐0.1Mpa，發(fā)酵周期為80‐120h。

進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：蔗糖160‐180g/L，蛋白胨30‐35g/L，KH2PO4 0.08‐0.1g/L，NaNO3 1.7‐2g/L，MgSO4·7H2O0.2‐0.3g/L，KCl 0.3‐0.5g/L，MnSO4 0.03‐0.05g/L，其余為蒸餾水。

進(jìn)一步地，所述聚蘋(píng)果酸的測(cè)定是利用高效液相色譜法進(jìn)行聚蘋(píng)果酸的含量測(cè)定，首先將含有聚蘋(píng)果酸且去除菌體的發(fā)酵液水解，用高效液相色譜法測(cè)定其中蘋(píng)果酸的含量，從而得出聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量。

本發(fā)明所用菌種來(lái)源是天津北洋百川生物技術(shù)有限公司申請(qǐng)的 專(zhuān)利名稱(chēng)為一種惰性載體吸附固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)β‐聚蘋(píng)果酸的方法，申請(qǐng)?zhí)柺?00910071171.2；該專(zhuān)利中公開(kāi)了本發(fā)明所用菌種為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種編號(hào)CGMCC3337。

本發(fā)明的有益效果是，一種吸附固定化發(fā)酵生產(chǎn)β‐聚蘋(píng)果酸的工藝，避免了菌絲體大量附著于發(fā)酵罐罐壁上，有利于聚蘋(píng)果酸的高效生產(chǎn)；聚蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌株無(wú)需包埋，依靠菌絲體自身吸附作用即可實(shí)現(xiàn)菌株在吸附固定化材料上的吸附。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中背景技術(shù)的α、β、γ三種聚蘋(píng)果酸的結(jié)構(gòu)圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：游離細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋(píng)果酸(對(duì)照例)

(1)種子培養(yǎng)

將出芽短梗霉菌株活化3h，然后用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面菌株的孢子，制備孢子懸液；按照10％的接種量將孢子懸液轉(zhuǎn)接到含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml的擋板瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為40h。

種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸銨1g/L，丁二酸2g/L，玉米漿0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余為蒸餾水。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)

接種口在火焰保護(hù)下，將所得種子液以10％(v/v)的量接于裝有3L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；初始轉(zhuǎn)速300r/min，通風(fēng)比1:1‐1:1.3，罐壓在0.1Mpa，培養(yǎng)溫度為25℃，發(fā)酵周期為120h。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KCl 0.5g/L，MnSO4 0.05g/L，其余為蒸餾水。

(3)聚蘋(píng)果酸的測(cè)定

使用高效液相色譜法進(jìn)行聚蘋(píng)果酸的含量測(cè)定，首先將含有聚蘋(píng)果酸且去除菌體的發(fā)酵液水解，用高效液相色譜法測(cè)定其中蘋(píng)果酸的含量，從而得出聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量為28.7g/L。

實(shí)施例2：固定化單批次制備聚蘋(píng)果酸

(1)種子培養(yǎng)

將出芽短梗霉菌株活化3h，然后用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面菌株的孢子，制備孢子懸液；按照10％的接種量將孢子懸液轉(zhuǎn)接到含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml的擋板瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為40h。

種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸銨1g/L，丁二酸2g/L，玉米漿0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余為蒸餾水。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)

以網(wǎng)狀植物纖維紗布為固定化載體，將長(zhǎng)40cm、寬15cm的紗 布沿PH電極、溫度電極、取樣管繞成一圈，固定后不影響攪拌。其余發(fā)酵條件、發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)施例1.

(3)聚蘋(píng)果酸的測(cè)定

使用高效液相色譜法進(jìn)行聚蘋(píng)果酸的含量測(cè)定，測(cè)得聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量為31.5g/L，相比空白提高9.7％。

實(shí)施例3：固定化單批次制備聚蘋(píng)果酸

(1)種子培養(yǎng)

將出芽短梗霉菌株活化3h，然后用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面菌株的孢子，制備孢子懸液；按照10％的接種量將孢子懸液轉(zhuǎn)接到含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml的擋板瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為40h。

種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸銨1g/L，丁二酸2g/L，玉米漿0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余為蒸餾水。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)

以網(wǎng)狀固定化材料不銹鋼絲網(wǎng)為固定化載體，將不銹鋼絲網(wǎng)沿PH電極、溶氧電極、溫度電極、取樣管繞圈，固定后不影響攪拌。其余發(fā)酵條件、發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)施例1.

(3)聚蘋(píng)果酸的測(cè)定

使用高效液相色譜法進(jìn)行聚蘋(píng)果酸的含量測(cè)定，測(cè)得聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量為32.3g/L，相比空白提高12.5％。

實(shí)施例4：固定化單批次制備聚蘋(píng)果酸

(1)種子培養(yǎng)

將出芽短梗霉菌株活化3h，然后用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面菌株的孢子，制備孢子懸液；按照10％的接種量將孢子懸液轉(zhuǎn)接到含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml的擋板瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為40h。

種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸銨1g/L，丁二酸2g/L，玉米漿0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余為蒸餾水。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)

以網(wǎng)狀植物纖維絲瓜巾為固定化載體，將去皮、去仔后的絲瓜巾固定于溫度電極、溶氧電極、取樣管上各1個(gè)，固定后不影響攪拌。其余發(fā)酵條件、發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)施例1.

(3)聚蘋(píng)果酸的測(cè)定

使用高效液相色譜法進(jìn)行聚蘋(píng)果酸的含量測(cè)定，測(cè)得聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量為33.6g/L，相比空白提高17％。